孟 瑤 余 蓮 秦祥宇 劉 暢 王澤霖 趙春建 付玉杰*

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)林業(yè)生物制劑教育部工程研究中心，哈爾濱 150040； 3.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040)

無花果(FicuscaricaL.)英文名為fig，外觀只見果不見花所以在民間稱之為無花果。雖然其果實(shí)備受食品市場(chǎng)的歡迎，但其葉子通常作為果實(shí)加工的副產(chǎn)品而丟棄處理，在產(chǎn)生大量的生物質(zhì)資源浪費(fèi)的同時(shí)也因?yàn)椴磺‘?dāng)?shù)奶幚韺?duì)環(huán)境造成了一定的影響。無花果葉具有多重藥理活性，包括抗氧化[1]，抗菌，抗腫瘤[2]，抗蟲[3]，抗病毒以及降血糖降血脂[4～5]等，在醫(yī)療及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有較大的開發(fā)潛能。無花果葉中含有豐富的天然活性物質(zhì)[6]，所以開發(fā)出一種高效的提取無花果葉中有效物質(zhì)的方法是十分必要的。

中草藥中有效物質(zhì)提取的一種新興手段——微波輔助提取技術(shù)，是通過使用適當(dāng)?shù)娜軇┰谖⒉ǚ磻?yīng)器中從天然植物、礦物或動(dòng)物組織中獲取目標(biāo)產(chǎn)物的技術(shù)和方法[7]。微波輔助提取法具有快速高效，加熱均勻[8]等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)由于微波設(shè)備操作簡(jiǎn)單，且節(jié)省溶劑和提取所用時(shí)間，所有參數(shù)均可以數(shù)據(jù)化，能夠與制藥現(xiàn)代化接軌[9]，在提取過程中溫度較低，不易糊化[10～11]，后續(xù)的處理也十分方便。經(jīng)上述可得，微波輔助提取工藝提取效率高，在化工生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)的有機(jī)試劑在天然產(chǎn)物的提取中占主導(dǎo)地位，但是能耗大，產(chǎn)率低是其亟需解決的問題。表面活性劑由于具有兩親性，在提取極性較小的目標(biāo)產(chǎn)物后還可以充分溶解在極性較大的水溶液中，這是其他提取劑所不能比較的[12]。目前，表面活性劑在天然產(chǎn)物提取上的應(yīng)用還處于初步階段，但是由于其提取效率高，短時(shí)間內(nèi)能提取完全，且用量較低，綜合經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)受到了越來越多的關(guān)注。同時(shí)，因?yàn)槠溥€具有良好的復(fù)配性質(zhì)[13]，可作為一種新型的環(huán)保綠色可替代的提取劑[14～15]。本實(shí)驗(yàn)采用了陰陽離子表面活性劑進(jìn)行復(fù)配，更好地對(duì)無花果葉中的不同化合物進(jìn)行捕捉，聯(lián)合微波輔助對(duì)無花果葉中的有效成分進(jìn)行提取，通過單因素法對(duì)最佳的提取工藝進(jìn)行了研究，本方法操作簡(jiǎn)單且溶劑用量較少，同時(shí)也能有效地提高最終粗提物的品質(zhì)，為天然產(chǎn)物的開發(fā)利用提供了必要的科學(xué)依據(jù)與實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

無花果葉采摘在山東省威海市；十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，十六烷基三甲基銨氯化物(CTAC)，二十六烷基二甲基溴化銨(DHAB)，十二烷基硫酸鈉(SDS)和辛基硫酸鈉(SOS)均購買于Aladdin生物技術(shù)有限公司；分析級(jí)的乙醇購自天津市Kermel試劑公司；1,1-二苯基-1-甲基苯并肼(DPPH)，抗壞血酸(Vc)和丁基羥基甲苯(BHT)購自Sigma-Aldrich(德國)；用Milli-Q水凈化系統(tǒng)制備去離子水；補(bǔ)骨脂素以及佛手柑內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)品(>98%)購買于上海源葉生物技術(shù)有限公司。

儀器與設(shè)備：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀型號(hào)為RE25AA；BT25S型電子分析天平；W891型烘干機(jī)；MAS-Ⅱ型微波儀；22R型高速離心機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

選取七、八月份新鮮無明顯枯萎和蟲害的無花果葉于陰涼干燥處陰干直到重量不變，粉碎至60目后于4℃下放置在密封袋里進(jìn)行低溫避光保存。取用時(shí)應(yīng)將密封袋取出冰箱放置一段時(shí)間，待粉末達(dá)到室溫后再打開袋子進(jìn)行稱重，避免無花果葉子吸潮影響稱量。

1.2.2 組成成分的研究

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜對(duì)無花果葉有效成分進(jìn)行分析，HPLC分析方法是在具有Diamonsil C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Dikma，北京)的Agilent 1200系列液相色譜系統(tǒng)上開發(fā)的。以下為補(bǔ)骨脂素以及佛手柑內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯回歸數(shù)據(jù)

Table 1 Regression data，LODs and LOQs forpsoralen and bergapten

分析物Analyte標(biāo)準(zhǔn)曲線Calibration curve相關(guān)系數(shù)R2(n=8)線性范圍Linearity range(μg·mL-1)檢出限LOD(μg·mL-1)定量限LOQ(μg·mL-1)補(bǔ)骨脂素PsoralenY=83.25X+1.870.99995～1000.170.52佛手柑內(nèi)酯BergaptenY=138.25X-2.240.99985～1000.200.62

注：X.標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg·mL-1)；Y.峰面積

Note:X.Standard concentration(μg·mL-1)；Y.Peak area

1.2.3 陰陽離子表面活性劑聯(lián)合微波輔助提取

準(zhǔn)確稱取1.0 g無花果葉粉末溶于一定量的水中，加入配制的一定比例的表面活性劑溶液后混勻直到溶液穩(wěn)定，置于微波提取器中，按照一定條件進(jìn)行微波提取，反應(yīng)結(jié)束后取出，定容，過濾，離心，并用微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析其成分及含量，重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)過程的優(yōu)化

不同的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)最終的提取率有一定程度的影響，此處分別對(duì)包括復(fù)配的表面活性劑的種類及其濃度、液固比、微波時(shí)間及溫度等實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。其中無花果葉中主要目標(biāo)成分的提取率的計(jì)算為

提取率(mg·g-1)=(C×V)/M

(1)

式中：C為樣品溶液中所測(cè)物質(zhì)的濃度(mg·mL-1)；V為樣品溶液體積(mL)；M為無花果葉粉干重(g)。

1.3 初步功能性評(píng)價(jià)

1.3.1 抗氧化性質(zhì)檢測(cè)

DPPH抗氧化性能力的測(cè)定：取1 mL樣品濃度為0.004%的DPPH乙醇溶液于黑暗條件下與樣品溶液混合，待穩(wěn)定后再與一定體積的乙醇溶液混合，黑暗條件下靜置，70 min后在517 nm下進(jìn)行吸光度測(cè)定，Vc作為對(duì)照，重復(fù)測(cè)定3次。

抗氧化能力(Ip)=[(AA-AB)/AB]×100

(2)

式中：AA與AB分別為70 min后待測(cè)樣品和空白的吸光度值。

ABTS抗氧化能力的測(cè)定：量取200 μL的ABTS工作液與10 μL的樣品溶液混合，待溶液均勻后在黑暗條件下靜置2～6 min后于734 nm處測(cè)定吸光度值，重復(fù)測(cè)定3次。

還原力的測(cè)定：量取500 μL的磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1，pH6.6)同相同體積的1%[K3Fe(CN)6]溶液混合，加入相同體積的樣品溶液，于50℃下水浴反應(yīng)25 min后快速取出，加入冷水使其快速冷卻，加入相同體積的10%三氯乙酸，3 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液500 μL同相同體積的蒸餾水及FeCl3混和均勻，在靜置10 min后在700 nm下進(jìn)行測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2 穩(wěn)定性檢測(cè)

在生產(chǎn)應(yīng)用中，產(chǎn)品的儲(chǔ)備時(shí)間也是一個(gè)衡量產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)。眾所周知，無花果葉中的主要成分補(bǔ)骨脂素是一種光敏感型的化合物，經(jīng)常會(huì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的降解。但是其本身也是十分重要的抗皮膚炎癥等的有效物質(zhì)，所以在生產(chǎn)過程中保留原有物質(zhì)本身性質(zhì)的同時(shí)提高本身的抗降解率也是十分必要的。所以本實(shí)驗(yàn)衡量了相同提取含量下，加入一定量的復(fù)配型表面活性劑，與原材料進(jìn)行對(duì)比，研究在相同條件下，不同天數(shù)無花果葉中主要物質(zhì)的含量變化情況。

具體實(shí)驗(yàn)操作步驟：取相同體積的樣品溶液進(jìn)行放置實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)得在第1、3、5、7天中，補(bǔ)骨脂素的含量與最開始原始的含量進(jìn)行百分比測(cè)試。制定的降解折線圖能直觀地對(duì)比出二者的穩(wěn)定性能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果選擇

2.1.1 表面活性劑種類對(duì)無花果葉中目標(biāo)成分提取率的影響

為了獲得最佳的提取效果，如圖1所示，選擇了4種復(fù)配的表面活性劑體系進(jìn)行篩選，分別為DTAB/SDS，CTAB/SOS，CTAC/SOS和DHAB，可以發(fā)現(xiàn)表面活性劑的加入與常規(guī)水溶液提取有較明顯的提高[11]，當(dāng)使用DTAB/SDS作為萃取溶劑時(shí)，所有分析物的提取效率達(dá)到最高。DTAB/SDS體系具有與陰離子和陽離子表面活性劑相同的烷基鏈長(zhǎng)，與其他研究的體系相比，這可能導(dǎo)致更緊密、更穩(wěn)定的極性層聚集體。此外，DTAB/SDS體系的獨(dú)特性質(zhì)以及與目標(biāo)分析物的特殊相互作用可能更加有助于提取，反觀，DHAB的提取效率最低，這可能是由于DHAB的電荷密度較低的緣故。與帶相反電荷的表面活性劑形成的其他體系相比，靜電相互作用弱，因此，選擇DTAB/SDS體系為最佳的提取溶劑。

圖1 表面活性劑種類對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物提取率的影響Fig.1 The effect of the formulated surfactant types on the extraction yield of target compounds

圖2 表面活性劑濃度對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物提取率的影響Fig.2 The effect of the formulated surfactantconcentrations on the extraction yield of target compounds

圖4 提取時(shí)間對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物提取率的影響Fig.4 Effect of differentextraction time on the extraction yield of target compounds

圖3 液固比對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物提取率的影響Fig.3 Effect of different liquid to solid ratio on the extraction yield of target compounds

圖5 提取溫度對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperatureon the extraction yield of target compounds

2.1.2 表面活性劑濃度對(duì)無花果葉中目標(biāo)成分提取率的影響

為了獲得最高的提取效率，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，在0.1%～5.0%(w/v)的范圍內(nèi)對(duì)表面活性劑濃度進(jìn)行了研究。結(jié)果如圖2所示，目標(biāo)化合物的提取量隨著濃度增加呈正態(tài)分布趨勢(shì)。當(dāng)濃度過低時(shí)可能導(dǎo)致與底物接觸不完全，達(dá)不到徹底的提取。增加DTAB/SDS的濃度可以通過增強(qiáng)氫鍵與目標(biāo)分析物的疏水—親水相互作用來提高提取率。但是，將濃度進(jìn)一步從1%(w/v)增加到5%(w/v)會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)分析物的提取效率降低或保持不變。分析原因可能是在1%(w/v)的濃度附近達(dá)到了動(dòng)力學(xué)提取平衡，進(jìn)一步增加濃度可能使原表面活性劑單體開始沉淀。此外，過高的濃度會(huì)導(dǎo)致溶液本身較為粘稠，傳質(zhì)受到阻礙，導(dǎo)致分析物在水相中的溶解度受到影響?；谏鲜鲈?，選擇1%(w/v)作為DTAB/SDS提取目標(biāo)產(chǎn)物的最佳濃度。

2.1.3 液固比對(duì)無花果葉中目標(biāo)成分提取率的影響

如圖3所示，當(dāng)提取時(shí)間固定時(shí)，目標(biāo)成分的提取率隨液固比的變化呈先增加后有輕微下降。然而當(dāng)液固比較小時(shí)，材料底物與表面活性劑的接觸不夠充分，提取效率就較低。但是當(dāng)液固比過大時(shí)，不僅會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，還會(huì)使得溶液體系稀釋過度，表面活性劑在短時(shí)間內(nèi)捕獲目標(biāo)化合物不夠完全，導(dǎo)致提取率輕微下降。如圖3所示，當(dāng)液固比達(dá)到30∶1時(shí)，可以達(dá)到較高的提取效率同時(shí)還不會(huì)造成過多的浪費(fèi)，符合綠色節(jié)能的發(fā)展理念。

2.1.4 時(shí)間對(duì)無花果葉中目標(biāo)成分提取率的影響

從圖4中可以看出，提取時(shí)間在10 min時(shí)候呈現(xiàn)出了最大值，補(bǔ)骨脂素與佛手柑內(nèi)酯分別為15.21與3.57 mg·g-1。隨后在15 min后又有輕微的下降，分析原因可能是由于積累的時(shí)間導(dǎo)致了容器內(nèi)溫度的增加，過熱的溫度會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞從而降低最終的產(chǎn)量。而在5 min時(shí)產(chǎn)量較低，應(yīng)該是由于底物與提取溶劑的接觸時(shí)間不夠充分，在較短的時(shí)間內(nèi)不能夠完全地將目標(biāo)化合物捕獲，導(dǎo)致最終的產(chǎn)量下降。但是過長(zhǎng)的時(shí)間不僅僅會(huì)造成能源的浪費(fèi)，反而會(huì)引發(fā)能量積累對(duì)最后的產(chǎn)量產(chǎn)生不利的影響。所以選取最適合的提取時(shí)間10 min，不僅會(huì)減少能量消耗，縮短時(shí)間提高效率，還可以最大程度地將目標(biāo)化合物提取出來。

2.1.5 溫度對(duì)無花果葉中目標(biāo)成分提取率的影響

溫度是影響分子運(yùn)動(dòng)快慢的一個(gè)重要因素，所以，探索不同溫度下對(duì)提取效率的影響是十分必要的。從圖5中可以看出，在溫度30℃、40℃、50℃、60℃的情況下，總提取效率呈現(xiàn)先上升后接近平緩的趨勢(shì)。其中，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，補(bǔ)骨脂素及佛手柑內(nèi)酯的提取率達(dá)到了最大(見圖5)，分別為15.37和3.59 mg·g-1。分析原因可能是在較低的溫度下，分子間的運(yùn)動(dòng)較慢，不利于表面活性劑分子與目標(biāo)化合物的接觸，阻礙了反應(yīng)高效、有序地進(jìn)行。隨著溫度的升高，分子間的運(yùn)動(dòng)加快，在一定時(shí)間內(nèi)接觸的更加充分徹底，能夠讓反應(yīng)更加完全。但是隨著溫度的進(jìn)一步增加，總提取效率并沒有呈現(xiàn)出線性增加，而是更加趨近于平緩。這就說明了在一定時(shí)間內(nèi)，在高于40℃的條件下，分子之間的接觸已經(jīng)達(dá)到了完全的充分，過高的溫度可能會(huì)加快分子之間運(yùn)動(dòng)的進(jìn)行但是并不會(huì)提高最終的產(chǎn)量。此外，過高的溫度可能會(huì)對(duì)表面活性劑內(nèi)部的復(fù)配造成化合鍵的斷裂，影響了與化合物之間的絡(luò)合。最重要的是，溫度過高還可能造成無花果葉中主要成分的降解，影響最終的獲取率。所以綜合以上的分析，本實(shí)驗(yàn)采用40℃作為最適合的提取溫度，在保證最高提取效率的同時(shí)減少能源損耗，達(dá)到綠色發(fā)展的理念。

2.2 初步功能評(píng)價(jià)

2.2.1 抗氧化性質(zhì)的研究

通過抗氧化實(shí)驗(yàn)的測(cè)定可以得出的結(jié)論是，在加入了一定濃度的陰陽離子復(fù)配型表面活性劑后，無花果葉的粗提物的抗氧化能力有明顯的提升，其中溶液的DPPH的IC50由0.107 mg·mL-1下降到了0.095 mg·mL-1，ABTS自由基清除能力也由0.503 mmol·g-1上升到了0.794 mmol·g-1，以BHT為對(duì)照，還原力IC50值降低了0.038 mg·mL-1。所以，不僅作為一種有效的提取劑，表面活性劑還可以作為一種綠色的抗氧化劑，保證所需要的活性成分在儲(chǔ)備和運(yùn)輸過程中得到較好的保護(hù)，為許多工業(yè)化生產(chǎn)，比如化妝品，藥品等生活必需品的制備，提供了有價(jià)值的依據(jù)和參考。

表2 無花果葉不同溶劑提取物的抗氧化結(jié)果

Table 2 Antioxidant results of different solvent extracts of fig leaves

商品名Trade nameDPPH IC50(mg·mL-1)ABTS(mmol·g-1Trolox)Reduction ability IC50(mg·mL-1)無花果葉粗提物Crude fig leaf extract0.1070.5030.183無花果葉粗提物與表面活性劑Fig leaf crude extract and surfactant0.0950.7940.145Vc0.0641.034—BHT——0.136

圖6 不同提取溶液的穩(wěn)定性研究Fig.6 The study on the stability of extraction solution

2.2.2 穩(wěn)定性的比較

無花果葉中補(bǔ)骨脂素為光敏感型物質(zhì)，如果沒有進(jìn)行遮光處理十分容易降解。由實(shí)驗(yàn)得知，與初始濃度相比，沒有加入表面活性劑的一組在1、3、5、7 d分別為80%、50%、40%和35%，而加入了表面活性劑的一組則為83%、70%、60%以及50%。從圖3可以看出來，無花果葉粗提物與表面活性劑的組合整體下降趨勢(shì)線的斜率要小于單獨(dú)的無花果葉粗提物，說明在相同的條件下，表面活性劑的加入會(huì)大大減緩原本極容易降解的物質(zhì)——補(bǔ)骨脂素的消失，也說明了表面活性劑可以作為一種穩(wěn)定溶劑，在3～7 d，它的添加使無花果葉粗提物的活性物質(zhì)的穩(wěn)定性平均提高了20%，分析原因可能是由于表面活性劑的加入增加了溶液的不透光性，光敏性物質(zhì)比如補(bǔ)骨脂素以及佛手柑內(nèi)酯等受到了較少的影響。還可能是因?yàn)楸砻婊钚詣┑募尤虢档土苏w溶液的表面張力，所以與空氣接觸的面積相對(duì)較低，不容易被空氣中的氧化物質(zhì)所氧化。同時(shí)研究2.2.1也表明，表面活性劑的加入會(huì)導(dǎo)致整個(gè)體系的抗氧化能力的增強(qiáng)，所以對(duì)目標(biāo)化合物的降解具有一定程度的緩沖作用。在現(xiàn)代醫(yī)療美容等行業(yè)中，表面活性劑的加入會(huì)大大的降低產(chǎn)品的損失，提高產(chǎn)品使用效率，從而經(jīng)濟(jì)和綠色發(fā)展也得到了較好的效果，具有較大的開發(fā)價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究完成了陰陽離子復(fù)配表面活性劑溶劑微波輔助提取無花果葉中主要目標(biāo)成分的提取工藝的優(yōu)化，最佳工藝條件為1%(w/v)的十二烷基硫酸鈉(SDS)與十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，液固比為30∶1，提取時(shí)間為10 min，溫度為40℃，在此條件下，補(bǔ)骨脂素與佛手柑內(nèi)酯的提取量分別為15.37和3.59 mg·g-1。通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)以及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對(duì)陰陽離子復(fù)配型表面活性劑的功能進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，為合理、有效開發(fā)利用無花果葉資源提供了必要的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)對(duì)植物中天然有效目標(biāo)產(chǎn)物的綠色高效提取以及功能評(píng)價(jià)具有十分重要的理論指導(dǎo)意義。