基于分子對接技術(shù)模擬預(yù)測復(fù)明片對M膽堿受體的作用

黃丹梅　陳沛洪

摘? 要：【目的】采用分子對接技術(shù)模擬預(yù)測復(fù)明片與M膽堿受體的作用關(guān)系?！痉椒ā拷?fù)明片活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，采用Autodocking vina等軟件，以M膽堿受體蛋白激動劑 IX0作為配體，建立 M膽堿受體蛋白的活性位點，對復(fù)明片中活性成分進(jìn)行分子對接模擬預(yù)測?！窘Y(jié)果】以自帶配體IX0（-6.5 kcal/mol）為閾值，復(fù)明片中共有217種成分與 M膽堿受體蛋白對接親和力在閾值之上。復(fù)明片中活性成分主要作用于以ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111等氨基酸殘基組成的活性位點?！居懻摗繌?fù)明片中活性成分與M膽堿受體蛋白能夠成功進(jìn)行分子對接，其對接位點信息有助于研究復(fù)明片活性物質(zhì)與M膽堿受體的作用機(jī)制的闡釋及發(fā)現(xiàn)新型抗青光眼藥物提供參考。

關(guān)鍵詞：復(fù)明片;活性成分;M膽堿受體蛋白;分子對接

中圖分類號：R276? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2020）21-0005-04

Abstract： Objective： The molecular docking technology was used to simulate and predict the relationship between Fumingpian tablets and M choline receptors. Methods： We established the active ingredient database of Fumingpian tablets， used software such as Autodocking vina， and used M choline receptor protein agonist IX0 as a ligand， so as to establish the active site of M choline receptor protein and perform molecular analysis on the active ingredients in Fumingpian tablets Docking simulation prediction. Results： Taking the self-ligand IX0 （-6.5 kcal/mol） as the threshold， a total of 217 components in Fumingpian tablets have a docking affinity with M choline receptor protein above the threshold. The active ingredients in Fumingpian tablets mainly act on ALA-194， ASN-108， ASN-404， ASP-103， CYS-429， PHE-195， SER-107， TRP-155， TRP-400， TYR-403， TYR -426， TYR-430， VAL-111 and other active sites composed of amino acid residues. Discussion： The active components of Fumingpian tablets can successfully dock with M-choline receptor proteins， and the information of their binding sites is helpful to study themechanism of interaction between active substances and M-choline receptors， and provide a reference for the discovery of new anti-glaucoma drugs.

Keywords： Fumingpian tablets; active ingredients; M choline receptor protein; molecular docking

前言

青光眼是一種以眼壓急劇升高并伴有相應(yīng)癥狀和眼前段組織改變?yōu)樘卣鞯难鄄。湟滓鹨暳ο陆?、視野缺損等后遺癥，是一種致盲率較高的眼疾病。青光眼的致病原因是復(fù)雜的、多方面的，或與全身疾病有著密切的關(guān)系，目前尚有部分患者病因不明。例如急性閉角型青光眼，其發(fā)病急劇，視力可數(shù)日內(nèi)迅速下降，甚至失明，而原發(fā)性閉角型青光眼則發(fā)病隱匿，進(jìn)展緩慢，早期患者無自覺的癥狀，隨著眼壓長期對視神經(jīng)的壓迫造成損害，患者才會發(fā)現(xiàn)視力下降，此時視神經(jīng)已經(jīng)有了一定的損害了[1]。一般認(rèn)為，高眼壓、缺血等原發(fā)性損傷因素首先引起敏感性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的崩解死亡，崩解產(chǎn)物致使躲過原發(fā)損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序而最終丟失，它是青光眼患者視神經(jīng)病變進(jìn)展的最主要因素。對于本病的治療目前主要是通過藥物和手術(shù)來降低眼壓及保護(hù)視神經(jīng)藥物以延緩青光眼的發(fā)病進(jìn)程[2]。

復(fù)明片為補(bǔ)益類中成藥，有滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)陰生津，清肝明目之功效。主治肝腎陰虛所致的畏光、視物模糊。適用于青光眼，初、中期白內(nèi)障見上述證候者。臨床研究證實服用復(fù)明片能有效改善青光眼患者高眼壓及視神經(jīng)損傷等癥狀;實驗研究發(fā)現(xiàn)復(fù)明片水溶液給家兔滴眼可明顯縮小瞳孔直徑，降低眼內(nèi)壓的作用。因而我們大膽猜想，復(fù)明片的有效成分中可能有擬膽堿樣作用的成分組存在[1，3，4]。

1 方法

1.1 試驗藥物

復(fù)明片總方的所有有效成分結(jié)構(gòu)

1.2 使用軟件

Atoudocking vina 1.1.2、Pymol 1.7、Atoudocktool-1.5.6

1.3 復(fù)明片總方分子數(shù)據(jù)庫的建立

通過查找及中國天然產(chǎn)物化學(xué)成分庫（http：//pharmdata.ncmi.cn/cnpc/）及TCMP數(shù)據(jù)庫（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/index.php），檢索復(fù)明片中中草藥的化學(xué)成分。全方共計1181個化學(xué)成分，采用ChemBioDraw Ultra 12.0畫出化合物L(fēng)IN的結(jié)構(gòu)，然后用ChemBio3D Ultra 12.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，并使用MMFF94力場進(jìn)行優(yōu)化，輸出mol2結(jié)構(gòu)，后通過Atoudocktool-1.5.6軟件轉(zhuǎn)變?yōu)?pdbqt格式。

1.4 作用靶點的選擇

通過在TTD數(shù)據(jù)庫搜索青光眼治療靶點，搜索到M膽堿受體蛋白（PDB ID：4MQS）。在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（www.rcsb.org）上，下載具有蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的晶體，通過Atoudocktool-1.5.6及其附帶的激動劑化合物確定作用位點的三維坐標(biāo)。

1.5 分子對接模擬試驗

本課題采用Atoudocking vina 1.1.2進(jìn)行分子對接研究。按照以上坐標(biāo)參數(shù)進(jìn)行模擬對接。為了增加計算的準(zhǔn)確度，我們將參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為20。除了特別說明，其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。最后，選取打分值最高的幾個構(gòu)象用PyMoL 1.7進(jìn)行結(jié)果分析[5-8]。

2 結(jié)果

通過Atoudocking vina 1.1.2批量對接可得到復(fù)明片1181個化合物，能與M膽堿受體蛋白有效的對接的化合物共611個，高于原激動配體的化合物共217個，占比約35.51%。將高于原激動配體的化合物親和力的絕對值前10個化合物用pymol軟件作圖分析得到表1。選擇對接活性較高，與活性口袋有氫鍵連接的neocnidilide及N-Salicylidene-salicylamine與原配體IX0作圖對比。

蛋白的原配體IX0、neocnidilide及N-Salicylidene-salicylamine與M膽堿受體蛋白的分子對接圖1表示IX0與M膽堿受體蛋白的分子對接圖： 左圖球棍狀代表化合物，線條部分代表與化合物臨近的氨基酸殘基，飄帶表示M膽堿受體蛋白。右圖顯示出了對接活性口袋及其二維圖（ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111）。

圖2表示neocnidilide與M膽堿受體蛋白的分子對接圖：左圖球棍狀代表化合物，線條部分代表與化合物臨近的氨基酸殘基，飄帶表示M膽堿受體蛋白。右圖顯示出了對接活性口袋及其二維圖（ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-426、VAL-111、TYR-104）。

圖3表示N-Salicylidene-salicylamine與M膽堿受體蛋白的分子對接圖： 左圖球棍狀代表化合物，線條部分代表與化合物臨近的氨基酸殘基，飄帶表示M膽堿受體蛋白。右圖顯示出了對接活性口袋及其二維圖（ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111、TYR-104）。

根據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，復(fù)明片的活性物質(zhì)均共同作用于同一群活性口袋：ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111。這些數(shù)據(jù)證明復(fù)明片的活性物質(zhì)能有效作用M膽堿受體蛋白。

3 討論

分子對接方法是依據(jù)受體學(xué)的“鎖和鑰匙”原理，從已知結(jié)構(gòu)的受體和原配體出發(fā)，通過化學(xué)計量方法模擬、 識別并預(yù)測受體-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的方法[9]。該方法可以預(yù)測蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點，在藥物設(shè)計中具有重要作用，并已廣泛用于藥物虛擬篩選、定量構(gòu)效關(guān)系研究[10]。復(fù)明片臨床用于青光眼治療由來已久，然而對其何種有效成分作用何種蛋白的研究卻甚少，且分子對接模擬的研究報道不多。

治療青光眼的機(jī)制有多種，如抑制β受體以減少房水的生成;激動M膽堿受體使之縮瞳從而促進(jìn)房水流出[11]。有研究發(fā)現(xiàn)復(fù)明片的10%的水浸液對實驗家兔的瞳孔有明顯縮瞳作用和降低眼壓作用，其可能有擬膽堿樣作用。因而作者選用M膽堿受體蛋白與復(fù)明片的有效成分進(jìn)行對接，探討了復(fù)明片對于抗青光眼降眼壓的潛在影響[1]。

M膽堿受體，又稱M受體，能與毒蕈堿特異性結(jié)合并被激動的膽堿受體稱為毒蕈堿型膽堿受體（muscarinic receptor，M受體），主要分布于節(jié)后膽堿能神經(jīng)纖維所支配的效應(yīng)器細(xì)胞膜上。擬膽堿藥-毛果蕓香堿主要作用于副交感神經(jīng)（包括支配汗腺的交感神經(jīng)）節(jié)后纖維支配的效應(yīng)器官的M膽堿受體，滴眼后可引起縮瞳、降低眼壓和調(diào)節(jié)痙攣等作用[1，12]。中藥復(fù)明片為臨床上常用的中成藥，其抗青光眼的療效已被證實。然而其抗青光眼的機(jī)制卻鮮有人研究。作者通過分子對接預(yù)測其有效成分中擬膽堿樣作用的成分，發(fā)現(xiàn)復(fù)明片成分中共有217個有高于原蛋白激動配體的作用。其中以neocnidilide、（+）-alpha-Curcumene、beta-Bisabolen等有效成分對M膽堿受體有較高的親和力。這些對接信息將為研究新型抗青光眼擬膽堿藥提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

復(fù)明片中的有效成分有三成可與M膽堿受體對接，這預(yù)示復(fù)明片的有效成分可能對M膽堿受體有效，且其中部分有效成分有比原配體更高的結(jié)合力，其結(jié)構(gòu)可作為將來新的擬膽堿藥的設(shè)計母體。

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