楊 星，高立紅，龔旭昊，馬秋冉，董玲玲，趙富華，于曉輝*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，北京 100102)

成鹽是改善藥物分子理化性質，提高其成藥性的有效手段之一，可改變藥物的溶解性，改善其依從性，提高其穩(wěn)定性，減少其不良反應，而且在藥物開發(fā)中，還可利用成鹽來延長藥物的專利保護期或規(guī)避其專利保護[1]。磺胺氯吡嗪是磺胺類抗球蟲藥，對球蟲具有良好的活性，作用峰期為球蟲的第二代裂殖體，對第一代裂殖體亦有一定的作用。其多在球蟲病爆發(fā)時短期應用，尤其是對感染后大量處于裂殖生殖階段的球蟲，具有良好的殺滅作用，同時對大部分革蘭氏陰性和陽性菌具有較強的抑制作用，能預防各種細菌的繼發(fā)感染[2]。由于磺胺氯吡嗪的水溶性不佳，實際上市的藥物是其鈉鹽磺胺氯吡嗪鈉。

在化學對照品標定中，通常采用質量平衡法進行賦值，對于成鹽對照品，需要準確測定成鹽離子的含量。離子色譜法具有快速、方便、靈敏度高、選擇性好，可同時分析多種離子，樣品用量少等優(yōu)點，目前已成為分析化學領域中發(fā)展最快的分析方法之一，被廣泛地用于無機陰、陽離子和有機離子的測定[3-10]。因此，本研究建立了離子色譜法測定磺胺氯吡嗪鈉中鈉離子的含量，該方法準確，靈敏度高，專屬性強，對于磺胺氯吡嗪鈉對照品的標定賦值具有重要意義。

1 儀器與試藥

Dionex Integrion離子色譜儀，配有CSRS 300(4 mm)抑制器，電導檢測器及甲烷磺酸(MSA)在線淋洗液發(fā)生器(Thermo公司，Chromeleon 7色譜工作站)；Milli-Q去離子水發(fā)生系統(tǒng)(Millipore公司)；Mettler Toledo XS 205型電子分析天平(Mettler公司)。

磺胺氯吡嗪鈉(揚州天和藥業(yè)有限公司生產，批號：20180205)；鈉單元素標準溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，1000 μg/mL，批號：GSB04-1738-2004)；陽離子混合標準溶液(Thermo，含Li+50 mg/L、Na+200 mg/L、NH4+400 mg/L、K+200 mg/L、Mg2+200 mg/L、Ca2+1000 mg/L，批號：130204)；水為18.2MΩ·cm超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Dionex IonPac CS12A(250 mm×4 mm)，保護柱：Dionex IonPac CG12A(50 mm×4 mm)，流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃，進樣量：25 μL，檢測器：電導檢測器，抑制器電流：117 mA，以淋洗液發(fā)生器產生的甲烷磺酸溶液為流動相，按表1進行梯度洗脫。

表1 梯度淋洗條件Tab 1 Procedure of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性試驗溶液 精密量取陽離子混合標準溶液(含Li+50 mg/L、Na+200 mg/L、NH4+400 mg/L、K+200 mg/L、Mg2+200 mg/L、Ca2+1000 mg/L)5 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 對照品儲備液 精密量取鈉單元素標準溶液(含Na+1000 μg/mL)10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 對照品溶液 精密量取鈉單元素標準溶液(含Na+1000 μg/mL)1 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 供試品儲備液 取磺胺氯吡嗪鈉約150 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.5 供試品溶液 取磺胺氯吡嗪鈉約15 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.6 線性試驗溶液 精密量取對照品儲備液適量，加水稀釋制成含鈉離子分別為0.2、1、2、5、8、10、12、15 μg/mL的溶液。

2.2.7 回收率試驗溶液 精密量取9份供試品儲備液5 mL，分別置100 mL量瓶中，再分別精密加入對照品儲備液3、5、7 mL各3份，加水稀釋至刻度，搖勻，制成含鈉離子8、10、12 μg/mL的溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性 分別精密量取2.2.1項下系統(tǒng)適用性試驗溶液、2.2.3項下對照品溶液、2.2.5項下供試品溶液各25 μL，照2.1項下色譜條件測定。結果顯示，在該色譜條件下，Na+與Li+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+均能基線完全分離，Na+測定不受干擾，方法專屬性強，見圖1～3圖。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗溶液色譜圖Fig 1 Chromatogram of the system suitability solution

圖2 對照品溶液色譜圖Fig 2 Chromatogram of the standard solution

2.3.2 線性關系考察 分別精密量取2.2.6項下線性試驗溶液各25 μL，照2.1項下色譜條件測定。以平均峰面積為y軸，鈉離子濃度為x軸，計算回歸方程。結果表明：在0.2～15 μg/mL濃度范圍內，鈉離子溶液的峰面積與其濃度呈良好的線性關系，線性方程為y=0.3132x+0.0068，r2=1.0000。

2.3.3 精密度試驗 取濃度為10 μg/mL的對照品溶液，照2.1項下色譜條件，連續(xù)重復進樣6次，鈉離子峰面積的RSD為0.1%。

2.3.4 重復性試驗 平行配制6份磺胺氯吡嗪鈉供試品溶液，照2.1項下色譜條件測定，計算鈉離子的含量，平均含量為6.67%，RSD為0.4%。

2.3.5 回收率試驗 采用加樣回收率試驗測定準確度。分別精密量取2.2.7項下回收率試驗溶液各25 μL，照2.1項下色譜條件測定，采用外標法計算回收率，結果見表2。

表2 鈉離子回收率Tab 2 Recovery of Sodium ion

2.3.6 檢測限與定量限 取鈉離子線性試驗溶液適量，用水逐步稀釋至一定濃度后測定，鈉離子定量限為0.2 μg/mL(S/N>10)，檢測限為0.1 μg/mL(S/N>3)。

2.3.7 耐用性試驗 采用不同柱溫、不同流速進行測定。結果如表3所示，不同柱溫、流速的耐用性均良好，僅保留時間發(fā)生改變。

表3 耐用性試驗Tab 3 Robustness test

2.3.8 樣品測定 取供試品溶液，照2.1項下色譜條件測定，采用外標法以峰面積計算，鈉離子含量為6.66%。

3 討 論

3.1 系統(tǒng)適用性試驗溶液的考察 為了考察環(huán)境、使用的試劑和容器中可能存在的微量Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+等陽離子對測定結果的影響[11-12]，系統(tǒng)適用性試驗溶液選擇Thermo公司生產的含6種陽離子的混合標準溶液(含Li+50 mg/L、Na+200 mg/L、NH4+400 mg/L、K+200 mg/L、Mg2+200 mg/L、Ca2+1000 mg/L)稀釋制得。

3.2 色譜條件的考察 參考離子色譜法測定鈉離子相關檢測方法[10-16]，色譜柱選擇Dionex IonPac CS12A，流動相選擇甲烷磺酸溶液(MSA)，不同文獻MSA的濃度從2.2 mmol/L至20 mmol/L不等。本研究最初選擇15 mmol/L的MSA作為淋洗液，在該條件下系統(tǒng)適用性試驗溶液6種陽離子色譜峰之間的分離度均大于1.5，但在測定磺胺氯吡嗪鈉時發(fā)現(xiàn)，雖然鈉離子與銨根離子分離度大于1.5，但兩峰的基線未完全分離。為消除銨根離子對鈉離子測定的干擾，經考察，在淋洗液為5 mmol/L的MSA時，鈉離子與銨根離子色譜峰的基線能完全分離，再通過梯度洗脫程序提高MSA濃度，增強洗脫能力，將其余陽離子迅速洗脫出來，縮短檢測時間。

3.3 空白干擾與進樣濃度的考察 在鈉離子含量測定時，錢敏等[10,13]選擇外標法不扣除空白，聞宏亮等[12,14]選擇標準曲線法不扣除空白，馮光等[11]選擇標準曲線法扣除空白，張軍霞等[15-16]選擇外標法扣除空白進行計算，為了確定選擇何種方式進行計算，本研究考察了空白對測定結果的影響。

使用PP進樣瓶直接從超純水機接18.2 MΩ·cm的去離子水作為空白時，空白中未檢出Na+(圖4)，但在進行檢測限考察時發(fā)現(xiàn)，鈉離子對照品溶液0.03、0.01、0.005 μg/mL的峰面積分別為0.0066、0.0059、0.0040，濃度與峰面積不呈線性，因此，推測在溶液配制過程中引入了微量鈉離子。梳理整個溶液配制過程，需經過以下環(huán)節(jié)：盛裝去離子水的塑料瓶、移液器槍頭、玻璃量瓶、一次性無菌注射器、濾頭、進樣瓶。經試驗，每個環(huán)節(jié)均可能引入Na+，除玻璃量瓶外，其他環(huán)節(jié)引入鈉離子的峰面積總計低于0.004。

圖4 水空白(18.2MΩ·cm)色譜圖Fig 4 Chromatogram of the water(18.2MΩ·cm)

設計一組試驗考察玻璃量瓶對空白的干擾。取10 mL量瓶，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，取其溶液作為清洗0次的空白溶液；將該量瓶中的水棄去，再用去離子水稀釋至刻度，搖勻，取其溶液作為清洗1次的空白溶液；依次配制10 mL量瓶分別清洗0、1、3、5、7、9、11次的空白溶液，每份溶液進樣2次，以清洗次數為橫坐標，平均峰面積為縱坐標，作圖(圖5)。由圖可知，當清洗0次時，鈉離子峰面積高達0.025，清洗5次以上后，鈉離子峰面積降至低于0.005，與其他環(huán)節(jié)總計引入的鈉離子峰面積基本一致，可認為已消除玻璃量瓶引入的干擾。因此，為盡可能減少實驗操作引入的空白干擾，在后續(xù)試驗時，將玻璃量瓶用去離子水清洗9次。同時，為了驗證9次的清洗次數是否充分，本研究測定了其他兩種規(guī)格量瓶(50 mL、100 mL)分別清洗9次后的空白溶液，鈉離子峰面積分別為0.002和0.003(見圖6)。

圖5 清洗次數對鈉離子峰面積的影響Fig 5 Effects of the number of cleaning on peak area

圖6 用去離子水清洗9次后的量瓶空白溶液色譜圖Fig 6 Chromatogram of the blank of volumetric flask with nine times cleaning

綜上所述，使用離子色譜法測定鈉離子時，為降低環(huán)境、容器和操作引入的鈉離子對測定造成的干擾，建議將量瓶用去離子水清洗9次，小心操作避免汗液等污染引入鈉離子。

不同文獻鈉離子測定時選擇的進樣濃度從0.7、1.5至24 μg/mL不等[10-16]，經考察，空白溶液、2、10 μg/mL對照品溶液中鈉離子的峰面積分別約為0.003、0.64、3.14，當進樣濃度從2 μg/mL提高至10 μg/mL時，空白干擾對測定結果造成的偏差從0.5%降低至0.1%，同時考慮樣品是否易溶于水等因素，本研究選擇10 μg/mL作為進樣濃度，此時空白造成的干擾較小，可不扣除空白直接采用外標法進行計算。

3.4 檢測限與定量限的考察 由于空白溶液中含有鈉離子干擾，本研究未選擇儀器計算所得信噪比作為方法的信噪比來確定檢測限與定量限，而是將空白溶液中鈉離子的峰面積(低于0.005)作為噪音，選擇鈉離子峰面積為0.026(大于3倍的空白溶液峰面積)的濃度0.1 μg/mL作為檢測限，選擇鈉離子峰面積為0.052(大于10倍的空白溶液峰面積)的濃度0.2 μg/mL作為定量限。

4 結 論

本研究建立了離子色譜-抑制型電導檢測器法測定磺胺氯吡嗪鈉中鈉離子的含量，該方法可實現(xiàn)Na+與Li+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+等常見陽離子的有效分離，具有專屬性強、靈敏度高、操作簡便、快速準確、環(huán)保無污染等特點，對磺胺氯吡嗪鈉對照品的質量平衡法賦值具有重要意義。