吳 晨，魏 昀，高慧琴

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000）

秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）為龍膽科植物秦艽的干燥根，威靈仙（Clematis chinensis Osbeck.）為毛茛科植物威靈仙的干燥根和根莖［1］。秦艽和威靈仙二藥均具有祛風(fēng)濕之功效［2］。環(huán)烯醚萜類化合物苷元具有抗炎、止血、鎮(zhèn)痛等功效，可分為獐牙菜苦苷類、龍膽苦苷類和獐牙菜苷類等［3-4］。本研究首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索秦艽-威靈仙藥對(duì)中含有的環(huán)烯醚萜苷類有效成分，接著通過高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液成分進(jìn)行分析，最終將色譜分析結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，判斷通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液成分結(jié)果的準(zhǔn)確性，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 軟件數(shù)據(jù)庫(kù)

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)［5］（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 和 Cytoscape 3.2.1 分析軟件（https：//cytoscape.org）。

1.2 藥品與試劑

秦艽和威靈仙飲片購(gòu)自蘭州惠仁堂藥店，批號(hào)分別為16062901 和16061406，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李成義教授鑒定為正品。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：獐牙菜苦苷（批號(hào)：CHB181105）、龍膽苦苷（批號(hào)：CHB190130）和獐牙菜苷（批號(hào)：CHB180115），純度均≥98%，購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇（色譜純）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；磷酸（色譜純）購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠；蒸餾水購(gòu)自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

1260 系列高效液相色譜儀配 G7115A DAD檢測(cè)器（美國(guó)Ailent Technologies 公司）；KQ-700DE型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E 型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；MYB 型電子調(diào)溫電熱套（天津市中實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥對(duì)活性成分篩選與收集 依次以“秦艽”和“威靈仙”為關(guān)鍵詞通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索各味藥的活性成分，以生物口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)［6］，匯總整理秦艽-威靈仙藥對(duì)的活性成分，并通過Cytoscape 構(gòu)建“中藥-成分”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，篩選環(huán)烯醚萜苷類成分。

1.4.2 色譜條件 色譜柱為：安捷倫883975-902 ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A 為 0.04%磷酸水溶液（0～28 min，85%A→77%A；28～35 min，77%A→65%A）、流動(dòng)相 B 為甲醇，色譜柱采用梯度洗脫（0～28 min，15%B→23%B；28～35 min，23%B→35%B）；流速設(shè)置為 0.8 mL/min；柱溫箱設(shè)置為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為245 nm；進(jìn)樣量設(shè)置為 5 μL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品和藥品的制備 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取獐牙菜苦苷5.0 mg、龍膽苦苷10.6 mg 和獐牙菜苷3.1 mg，分別置于3 個(gè)10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得對(duì)應(yīng)高濃度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的制備：分別精密量取1 mL 獐牙菜苦苷、1 mL 龍膽苦苷和1 mL 獐牙菜苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，置于1 個(gè)10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液。其濃度分別為：獐牙菜苦苷0.050 0 mg/mL、龍膽苦苷0.106 0 mg/mL 和獐牙菜苷0.031 0 mg/mL，置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

通過冷凝回流法制備秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液，按照秦艽：威靈仙1∶1 的比例分別稱取秦艽飲片和威靈仙飲片各5 g 共10 g，分2 次煎煮。第1次加 10 倍量水（100 mL），浸泡 30 min 后，加熱至沸騰后再煎煮1 h，紗布過濾收集藥液；第2 次加8倍量水（80 mL），加熱至沸騰后再煎煮30 min，紗布過濾收集藥液，合并濃縮2 次水煎液，定容至100 mL，得到濃度為0.1 g/mL 的秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液。將以上制得中藥水煎液通過0.45 μm 濾器過濾，置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 設(shè)定HPLC 色譜儀精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL，在“1.4.2項(xiàng)”色譜條件下分別進(jìn)樣進(jìn)行適應(yīng)性測(cè)定。

1.5 線性關(guān)系

設(shè)定HPLC 色譜儀分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液 2.5 μL、5 μL、10 μL 和混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液各 1.25 μL、2.5 μL、5 μL、10 μL、12.5 μL 進(jìn)樣，按步驟“1.4.2 項(xiàng)”的色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為 X 軸，峰面積值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性回歸方程和線性范圍。

1.6 精密度實(shí)驗(yàn)

設(shè)定HPLC 色譜儀，分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣7 次，記錄分析色譜圖并計(jì)算混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量的RSD 值。

1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取秦艽 5 g，威靈仙 5 g，共10 g，設(shè)置為7 組平行，按“1.4.3 項(xiàng)”方法制備 7 份平行秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液的供試品溶液，設(shè)定HPLC 色譜儀分別精密吸取5 μL 供試品溶液進(jìn)樣檢驗(yàn)，在“1.4.2 項(xiàng)”色譜條件下分析藥對(duì)水煎液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量的RSD 值。

1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液供試品溶液，設(shè)定HPLC 色譜儀精密吸取5 μL 供試品溶液，在“1.4.2 項(xiàng)”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定 0 h～24 h 內(nèi)每隔2 h 的獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的峰面積，并計(jì)算RSD 值。

1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

量取已知成分含量的秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液供試品溶液6 份，分別加入一定量的獐芽菜苦苷對(duì)照品、龍膽苦苷對(duì)照品和獐牙菜苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，在“1.4.2 項(xiàng)”色譜條件下分別進(jìn)樣 5 μL，記錄色譜峰，計(jì)算加樣回收率。

1.10 樣品含量測(cè)量

取秦艽和威靈仙飲片按“1.4.3 項(xiàng)”方法平行制備5 份供試品溶液，在“1.4.2 項(xiàng)”色譜條件下進(jìn)樣5 μL，測(cè)量獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的峰面積并代入“1.5 項(xiàng)”中的線性回歸方程以計(jì)算獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量。

2 結(jié) 果

2.1 藥對(duì)活性成分篩選與收集結(jié)果

以關(guān)鍵詞“秦艽”和“威靈仙”于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索活性成分，共檢索到：秦艽27 個(gè)成分，威靈仙57 個(gè)成分。根據(jù)步驟2.1 中標(biāo)準(zhǔn)篩選后，秦艽-威靈仙藥對(duì)共篩得13 個(gè)活性成分，其中屬于秦艽的活性成分6 個(gè)，屬于威靈仙的活性成分7 個(gè)，共有活性成分2 個(gè)，分別是齊墩果酸和β-谷甾醇（表1）。通過Cytoscape 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D（圖 1），篩選得到藥對(duì)中的環(huán)烯醚萜苷類成分有獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷。

表1 秦艽-威靈仙藥對(duì)活性成分及相關(guān)參數(shù)

圖1 秦艽-威靈仙藥對(duì)“中藥-活性成分”拓?fù)鋱D

2.2 適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以“1.4.4 項(xiàng)”方法進(jìn)樣檢測(cè)的HPLC 色譜圖見圖2，結(jié)果可見獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的保留時(shí)間分別為 25.6 min、30.5 min 和 34.6 min，峰分離度良好。

2.3 線性關(guān)系結(jié)果

將“1.5 項(xiàng)”方法檢測(cè)所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為X 軸，峰面積值為Y 軸，最終得到線性回歸方程。獐牙菜苦苷的線性回歸方程為 Y=507X+5.531 8（R2=0.998 2）；龍膽苦苷的線性回歸方程為Y=713.23X+12.219（R2=0.998 9）；獐牙菜苷的線性回歸方程為Y=296.12X+8.881 6（R2=0.997）。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：獐牙菜苦苷在0.021 0～1.056 0 μ g，龍膽苦苷在 0.036 5～11.720 0 μg 以及獐牙菜苷在 0.016 2～1.142 0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 高效液相色譜圖

2.4 精密度結(jié)果

以“1.6 項(xiàng)”方法分析色譜圖并計(jì)算混合對(duì)照品溶液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分別為0.42%、0.24%和1.79%，表明實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.5 重復(fù)性結(jié)果

以“1.7 項(xiàng)”方法檢測(cè)分析秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分別為1.21%、0.07%和0.49%，表明實(shí)驗(yàn)具有較好重復(fù)性。

2.6 穩(wěn)定性結(jié)果

以“1.8 項(xiàng)”方法，每隔 2 h 檢測(cè) 1 次，24 h 內(nèi)秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分別2.32%、0.33%和1.89%，表明樣品在24 h 內(nèi)具有良好穩(wěn)定性。

2.7 加樣回收率結(jié)果

以“1.9 項(xiàng)”方法檢測(cè)并計(jì)算秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液的加樣回收率，獐牙菜苦苷的平均加樣回收率為 99.64%（表2）、龍膽苦苷的平均加樣回收率為100.20%（表3）以及獐牙菜苷的平均加樣回收率為 101.11%（表4）。

2.8 樣品含量測(cè)量結(jié)果

表2 獐牙菜苦苷加樣回收結(jié)果

表3 龍膽苦苷加樣回收結(jié)果

表4 獐牙菜苷加樣回收結(jié)果

以“1.10 項(xiàng)”方法檢測(cè)并將峰面積代入線性回歸方程計(jì)算秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液中獐芽菜苦苷、龍膽苦苷峰和獐牙菜苷的含量分別為2.13 mg/g、28.36 mg/g 和 4.51 mg/g。

3 討 論

獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷既是環(huán)烯醚萜苷中的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分，也是秦艽-威靈仙藥對(duì)發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一［7-8］。近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展方興未艾，但是由于其所得結(jié)果多數(shù)基于數(shù)據(jù)庫(kù)查詢和軟件分析并且只能定性不能定量［9］，其結(jié)果也備受爭(zhēng)議。本研究借助HPLC法對(duì)通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法檢索得到的秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液中含有的環(huán)烯醚萜苷類成分結(jié)果進(jìn)行定性檢測(cè)并確定了其含量，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在預(yù)測(cè)秦艽-威靈仙藥對(duì)水煎液成分方面的可行性，進(jìn)而推廣到預(yù)測(cè)其他中藥的活性成分，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

本研究使用紫外全波長(zhǎng)掃描（190 nm～400 nm），查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為235 nm、270 nm和247 nm，因吸收波長(zhǎng)在245 nm 處獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷色譜峰的靈敏度較高且雜質(zhì)干擾較少，故選擇245 nm 作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)。通過查閱文獻(xiàn)并結(jié)合不同溶劑流動(dòng)相考察的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，較乙腈-磷酸水溶液來(lái)說(shuō)，甲醇-磷酸水溶液作為流動(dòng)相有助于各峰之間的完全分離，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的分離效果較好，色譜圖基線較平穩(wěn)。因?yàn)楸狙芯枯o助課題組藥效學(xué)研究，故選擇了與藥效研究相同的水煎液制備方法，以期其結(jié)果對(duì)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)具有指導(dǎo)作用［10］。

最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，秦艽-威靈仙水煎液中含有獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷這3 種環(huán)烯醚萜苷類成分，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，其含量按順序排列為：龍膽苦苷（28.36 mg/g）＞獐牙菜苷（4.51 mg/g）＞獐牙菜苦苷（2.13 mg/g）。本研究從基礎(chǔ)的儀器分析方法入手，以秦艽-威靈仙藥對(duì)為例，考察了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中有效成分查詢方法的可靠性，彌補(bǔ)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)成分只能定性不能定量的缺陷，為日后基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥藥性理論或是作用機(jī)制提供了新的思路。