張勇，?？〔罡Ｉ?，王晶，劉春明

（長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130032）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）為大型珍貴藥用真菌，屬于多孔菌科褐臥孔菌，又名白樺茸，主要生長(zhǎng)在俄羅斯遠(yuǎn)東、北美北部、芬蘭、日本北海道以及我國(guó)黑龍江和吉林等地區(qū)[1]。藥效作用研究表明，樺褐孔菌具有抗癌、防治糖尿病、抗氧化、抗衰老、降血糖、增強(qiáng)免疫力、防治艾滋病、調(diào)節(jié)血脂等多種藥理活性[2-3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，樺褐孔菌中含有多種化學(xué)成分，如三萜、酮類(lèi)、多糖、木質(zhì)素、生物堿和黑色素類(lèi)等成分[4-6]。其中，紫萁酮是樺褐孔菌中的主要活性成分，屬于酮類(lèi)化合物，可以調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇，對(duì)病毒的增殖有明顯的抑制作用[7]，此外，還具有殺死癌細(xì)胞和抗氧化的活性[8-10]，其藥理作用廣泛，且在樺褐孔菌中含量較高。目前文獻(xiàn)報(bào)道中，主要對(duì)樺褐孔菌中某一類(lèi)成分進(jìn)行含量分析，如采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樺褐孔菌粗提物中總多糖、總?cè)祁?lèi)化合物等進(jìn)行含量[11-12]，應(yīng)用氨基酸分析儀測(cè)定其各種氨基酸含量[13]。然而，對(duì)樺褐孔菌中紫萁酮這一單體化合物的定量分析還未見(jiàn)報(bào)道。中藥質(zhì)量控制需要對(duì)其中的有效成分進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定性和定量分析。因此，需要建立能夠準(zhǔn)確、迅速檢測(cè)樺褐孔菌粗提物中紫萁酮含量測(cè)定方法。

本研究以樺褐孔菌中紫萁酮為研究對(duì)象，建立反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC） 技術(shù)檢測(cè)紫萁酮（C10H10O3）[14]（如圖1）含量的分析方法，并對(duì)建立的HPLC分析條件進(jìn)行了方法學(xué)考察。同時(shí)，采用所建立的方法對(duì)不同樺褐孔菌提取物中的紫其酮進(jìn)行含量測(cè)定。

圖1 紫萁酮（osmundancetone）的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of osmundancetone

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器）、柱溫箱采用安捷倫配套裝置（1100）、RP-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美國(guó) Agilent公司；Hei-VAP 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)Heidolph公司；電子分析天平：德國(guó)桑塔瑞斯公司；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；YoungLin Istrument超純水制備器：韓國(guó)YoungLin Istrument公司；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

樺褐孔菌：吉林省晏達(dá)順參業(yè)有限公司；甲醇、醋酸（試劑均為色譜純）：加拿大CaledonLaboratoriesLLtd.公司；紫萁酮（Osmundancetone）：成都普思生物科技有限公司；異丙醇、甲醇、乙醇分析試劑：北京化工廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

2.1.1 不同溶劑提取

分別精密稱(chēng)取4份樺褐孔菌粉末5.000 1、5.000 4、5.000 5、5.000 8 g，分別加入100 mL的異丙醇、甲醇、95%乙醇、70%乙醇溶液，超聲輔助提取1h。提取液進(jìn)行抽濾，濾液減壓回收至干，4 mL色譜甲醇溶解，過(guò)0.45 μm濾膜，4℃冰箱保存，待用。

2.1.2 不同方法提取

以甲醇為提取溶劑，分別稱(chēng)取樺褐孔菌粉末（5.000 8、5.000 7、5.000 2 g），分別采用超聲輔助提取1 h、溫度50℃，回流提取1h、溫度80℃，微波輔助提取1 h、功率為180 W。提取物進(jìn)行抽濾，濾液減壓回收至干4 mL色譜甲醇溶解，過(guò)0.45 μm濾膜，4℃冰箱保存，待用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱(chēng)取紫萁酮對(duì)照品0.500 2 mg，加入1 mL的色譜甲醇制成濃度為500 μg/mL的貯備液，過(guò)0.45 μm的濾膜，紫萁酮對(duì)照品溶液，4℃冰箱保存，待用。

2.3 液相色譜條件

色譜柱 RP-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent，USA）；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為 0.5%醋酸水，梯度洗脫條件：0～2 min（20%A→20%A），2 min～20 min（20%A→45%A），20 min～40 min（45%A→100%A），40 min～50 min（100%A→20%A）；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

3 結(jié)果分析與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系與范圍

用色譜甲醇進(jìn)行對(duì)紫萁酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為 0.5、1、2.5、4、5 μg/mL，采用 HPLC 檢測(cè)，以紫萁酮的濃度（M，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（S）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2），得到紫萁酮的回歸方程，S=3 861.3M+42.977，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，結(jié)果表明，紫萁酮在 0.5 μg/mL～5 μg/mL 范圍線性關(guān)系良好。

3.2 不同溶劑提取的比較

分別采用異丙醇、95%乙醇、70%乙醇、甲醇作為溶劑，表明甲醇提取樺褐孔菌中紫萁酮有效成分效果較好，基線不平，提取效果雖然沒(méi)有顯著差異，但是異丙醇、95%乙醇、70%乙醇溶劑提取有較多雜質(zhì)。用甲醇作為提取溶劑時(shí)，峰面積和峰形大小合適，確定用甲醇作為提取溶劑。用RP-HPLC檢測(cè)不同溶劑提取物，如表1所示，結(jié)果表明樺褐孔菌的甲醇提取物中紫萁酮含量最高，達(dá)到0.107%。

圖2 紫萁酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of osmundancetone

表1 不同溶劑對(duì)紫萁酮含量的影響Table 1 The effect of different solvents on the content of osmundancetone

3.3 不同提取方法的比較

以甲醇為溶劑，分別采取超聲輔助、回流、微波輔助對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行提取，用RP-HPLC分析不同方法提取物中紫萁酮含量，如表2所示。結(jié)果表明，不同提取方法對(duì)紫萁酮含量的影響不大，但超聲輔助提取操作簡(jiǎn)單、方便、快速，提取效率高，超聲輔助提取物中紫萁酮的含量為0.108%。

表2 不同提取方法對(duì)紫萁酮含量的影響Table 2 The effect of different extraction methods on the content of osmundancetone

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 樺褐孔菌液相圖

采用2.3中HPLC條件下，超聲輔助提取的樺褐孔菌甲醇提取物及紫萁酮標(biāo)準(zhǔn)品均得到較好的分離，結(jié)果如圖3所示。

3.4.2 精密度試驗(yàn)

取2.2對(duì)照品溶液，按照2.3的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定色譜峰面積，以峰面積和保留時(shí)間考察精密度，紫萁酮峰面積的RSD為0.24%，紫萁酮保留時(shí)間的RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

圖3 樺褐孔菌甲醇提取物及紫萁酮的RP-HPLC圖Fig.3 RP-HPLC chromatograms of Inonotus obliquus methanol extract and osmundancetone

3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取同一樣品溶液，分別于制備后的0、2、6、10、12、16、24 h，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，不同樣品中紫萁酮的相對(duì)峰面積的RSD為0.77%，表明樣品在24 h以內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樺褐孔菌藥材5份，以甲醇為溶劑，超聲輔助提取物法制備樣品溶液，分別應(yīng)用HPLC進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，樺褐孔菌中紫萁酮的平均含量為0.105 mg/g，峰面積含量的RSD為0.59%，表明該方法的重復(fù)性較好。

3.4.5 回收率試驗(yàn)

取同一批樺褐孔菌藥材6份，按上述方法制備樣品溶液，加入紫萁酮適量，按照2.3高效液相色譜的條件測(cè)定加樣回收率，計(jì)算紫萁酮的加樣回收率，結(jié)果如表3所示。

表3 平均回收率的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of the average recovery

4 結(jié)論

本研究利用RP-HPLC法對(duì)樺褐孔菌中的紫萁酮成分的含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，分別以異丙醇、95%乙醇、70%乙醇、甲醇作為溶劑，采用超聲、回流、微波方法提取了樺褐孔菌中的紫萁酮有效成分，并用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行定量分析，檢測(cè)了該化合物的含量，結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑，超聲輔助提取紫萁酮的效果較好，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法和前期處理過(guò)程簡(jiǎn)便，含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、靈敏度高和重復(fù)性良好。目前，樺褐孔菌廣泛用于到保健品和化妝品中，該方法的建立為樺褐孔菌中紫萁酮的有效成分含量的測(cè)定和質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)。