陳靜，郝俊光，蔡秋杏，戴梓茹，李桂英，袁燕萍，徐新鳳

（1.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院，廣西欽州535000；2.欽州市特色果蔬發(fā)酵重點實驗室，廣西欽州535000；3.石河子質(zhì)量與計量檢測所，新疆石河子832000）

葡萄酒以新鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部發(fā)酵或部分發(fā)酵制成含有一定酒精度的發(fā)酵酒[1]。葡萄酒的營養(yǎng)成分很多，其中包含豐富的碳水化合物、維生素、氨基酸、果膠，以及蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等物質(zhì)，還含有鉀、鈣、鎂、磷、鋅、硒等微量元素[2]。葡萄酒不但營養(yǎng)價值高，同時還具有極高的醫(yī)療保健價值。近年研究表明葡萄酒中花色苷具有降血脂、抗變異、延緩衰老、改善視覺等作用[3]。葡萄酒中的白藜蘆醇具有降低膽固醇和甘油三脂、降低血脂、防治心血管疾病及癌癥等作用[4]。因此，除了作為平常的飲用需求外，廣大消費者購買葡萄酒更具有養(yǎng)生需求。

廣西地區(qū)葡萄資源豐富，葡萄酒釀造產(chǎn)量不斷增加。但由于原材料葡萄和加工工藝會對葡萄酒的質(zhì)量有影響（如葡萄的品種、質(zhì)量與種植環(huán)境等），因而存在一定的安全風(fēng)險，尤其是在釀造過程易產(chǎn)生甲醇及雜醇油等安全危害因子[5]。

通過對廣西本地產(chǎn)的巨峰葡萄在釀造過程中進(jìn)行跟蹤檢測葡萄酒中甲醇、異戊醇、異丁醇含量的變化以及總酸、總糖、單寧、酒精度理化指標(biāo)，從而研究葡萄釀造過程中不同果膠酶添加量及不同溫度下對葡萄酒中甲醇、異戊醇、異丁醇及理化指標(biāo)總酸、總糖、單寧、酒精度等的影響。從而為巨峰葡萄酒發(fā)酵過程甲醇和雜醇油的控制因素提供了一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨峰葡萄：欽州本地超市；白砂糖：北部灣大學(xué)文科地超市；帝伯仕果膠酶（酶活力＞50 U/mg）：南寧東南恒華道生物科技有限公司；帝伯仕18度酵母：煙臺良緣酒業(yè)有限公司；焦亞硫酸鉀：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

試劑甲醇（99．8%）、異丁醇（99．8%）、異戊醇（99．8%）、乙醇（99．8%）、叔戊醇（99．8%）：均為色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉（分析純）：天津化學(xué)試劑有限公司；福林酚（生物技術(shù)級）：上海麥克林生化科技有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫（Agilent）7890B配氫火焰檢測器氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；色譜柱（聚乙二醇石英毛細(xì)管柱，柱長 60 m，內(nèi)徑 0.25 mm，膜厚 0.25 μm）：上海碧真儀器有限公司；UV1800紫外分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

葡萄→預(yù)處理（清洗、晾干、除梗）→擠碎（加入不同含量的果膠酶）→接種酵母發(fā)酵→主發(fā)酵→后發(fā)酵→澄清→成品葡萄酒

1.3.2 樣品處理

將樣品分為A、B試驗組，均將葡萄汁初始糖度調(diào)至 24 °Brix。

A組為果膠酶添加量使用研究：分別稱巨峰葡萄2 kg，除梗破碎，加入到3 L發(fā)酵罐中。分別將濃度為150 mg/kg的焦亞硫酸鉀、0.2 g/kg的酵母加入發(fā)酵罐中，攪拌均勻。再分別將濃度為0、100、150、200 mg/kg的果膠酶加到每個樣品中，攪拌均勻，置于24℃恒溫箱下進(jìn)行10 d的主發(fā)酵，主發(fā)酵結(jié)束、過濾、靜置于16℃恒溫箱進(jìn)行后發(fā)酵。

B組為發(fā)酵溫度的研究：分別稱取巨峰葡萄1kg，除梗破碎，加入到2 L發(fā)酵罐中。分別將濃度為150 mg/kg的焦亞硫酸鉀、0.2 g/kg的酵母、150 mg/kg果膠酶加入發(fā)酵罐中，攪拌均勻，分別置于24、28、30℃、恒溫箱下進(jìn)行10 d的主發(fā)酵，主發(fā)酵結(jié)束、過濾、靜置于16℃恒溫箱進(jìn)行后發(fā)酵。

1.3.3 理化指標(biāo)的測定

酒精度：酒精度計法，蒸餾測定；總糖：直接滴定法：采用2.5 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定；總酸：直接滴定法：采用0.05 mol/L氫氧化鈉滴定；以上方法均參照GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[6]。單寧：參照NY/T1600-2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定分光光度法》[7]。

1.3.4 甲醇及主要雜醇油含量的測定

參照GB5009.266-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測定》[8]，將發(fā)酵醪液過濾，量取50 mL濾液倒入500 mL圓底燒瓶中，并加入50 mL蒸餾水，并開啟冷卻水，加入幾粒沸石，連接冷凝管，用50 mL容量瓶作為接收器（外加冰?。?，并開啟冷卻水，緩慢加熱蒸餾，收集蒸餾液50 mL，混勻；吸取10.0 mL蒸餾后的溶液于試管中，加入0.10 mL叔戊醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，備用。

1.3.5 氣相色譜條件

色譜柱：島津氣相色譜柱毛細(xì)管柱（60 m×0.25mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：初溫 40℃，保持1 min，以4.0℃/min升到130℃，以20℃/min升到200℃，保持5 min；載氣流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL；分流比：20.1[8]。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的配制：用電子天平準(zhǔn)確稱取各0.5 g（精確至0.001 g）甲醇、異丁醇、異戊醇至于100 mL的容量瓶，分別用40%的無水乙醇定容，混勻，配制濃度為5 000 mg/L。準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.001 g）叔戊醇，用40%的無水乙醇定容，混勻，備用。

從標(biāo)準(zhǔn)品溶液中分別吸取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL甲醇、異丁醇、異戊醇至25 mL的容量瓶，用40%的無水乙醇定容至刻度，依次配制成濃度梯度為100、200、400、800、1 000 mg/L 的混標(biāo)溶液。分別吸取10.0 mL的混標(biāo)溶液于5個試管中，加入0.1 mL的叔戊醇，混勻，備用[9]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理是通過制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線及安捷倫的7890B的OpenLab工作站軟件獲得結(jié)果。各種試驗的試驗數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次重復(fù)試驗獲得，采用平均值表示；采用WPS 2019軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶的添加量對葡萄酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化影響

2.1.1 果膠酶的添加量對葡萄酒發(fā)酵過程中總酸含量的變化影響

在巨峰葡萄發(fā)酵初期添加不同的果膠酶含量，依照GB/T15038-2006中總酸方法的檢測結(jié)果見表1。

表1 巨峰葡萄發(fā)酵過程中總酸的含量變化Table 1 Changes of total acid content in Jufeng grape during fermentation g/L

從表1可以看出，添加不同量的果膠酶對葡萄酒中的總酸基本沒有影響。在發(fā)酵過程中，總酸含量一直不斷下降，發(fā)酵到第10天，總酸下降速率變慢，后期逐漸趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵過程中酸類物質(zhì)不斷地快速分解，導(dǎo)致總酸快速降低，到后期酸類物質(zhì)分解速率緩慢，總酸下降速率變小并趨于穩(wěn)定的趨勢。

2.1.2 果膠酶的添加量對葡萄酒中發(fā)酵過程中總糖含量的變化影響

巨峰葡萄發(fā)酵中添加不同的果膠酶含量，按照總糖方法的檢測結(jié)果見表2。

表2 巨峰葡萄發(fā)酵過程中總糖的含量變化影響Table 2 Effect of total sugar content on fermentation of Jufeng grape g/L

總糖減少主要經(jīng)酵母菌代謝轉(zhuǎn)化成能量和醇類物質(zhì)，醇類物質(zhì)產(chǎn)生的種類和數(shù)量直接影響葡萄酒的品質(zhì)[10]。由表2可知，添加不同量的果膠酶，對葡萄酒中總糖的含量幾乎沒有影響。葡萄酒在發(fā)酵的前6 d，總糖的下降速度很快，說明該時期，酵母菌生長繁殖旺盛[11]，需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)，因此分解糖類，從而導(dǎo)致總糖量快速下降，發(fā)酵到第8天含糖量降到很低，隨后總糖含量降低十分緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定。這是因為后期營養(yǎng)物質(zhì)變少，酒精抑制作用導(dǎo)致酵母菌大量死亡，發(fā)酵作用降低[12]，因此總糖含量下降趨勢變慢，發(fā)酵到第20天，兩種葡萄酒的總糖含量均小于2.0 g/L，符合國家干紅葡萄酒總糖含量標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)（≤4.0 g/L）[13]干型葡萄酒。

2.1.3 果膠酶的添加量對葡萄酒發(fā)酵過程中的酒精度的變化影響

巨峰葡萄發(fā)酵過程中添加不同的果膠酶含量，按照酒精度的檢測方法的檢測結(jié)果見表3。

表3 巨峰葡萄發(fā)酵過程中酒精度的變化影響Table 3 Effect of alcohol degree on fermentation of Jufeng grape %vol

由表3可以看出，添加不同量的果膠酶，葡萄酒中的酒精度基本沒有影響。葡萄酒在發(fā)酵過程中酒精度均呈快速上升后逐漸趨于平穩(wěn)。從表3知，第2天到第8天是發(fā)酵最激烈的時期，在這個階段酒精度的產(chǎn)生和總糖下降的速度呈現(xiàn)出一定的一致性，隨后酒精度逐漸趨于平穩(wěn)。

2.1.4 果膠酶的添加量對葡萄酒發(fā)酵過程中單寧含量的變化影響

葡萄發(fā)酵過程中添加不同的果膠酶含量，按照單寧的檢測方法的檢測結(jié)果見表4。

表4 巨峰葡萄發(fā)酵過程中單寧含量的變化影響Table 4 Effect of tannin content on fermentation of Jufeng grape mg/L

葡萄酒釀制過程中添加果膠酶，有利于增強多酚物質(zhì)的浸提，從而使單寧含量的增加[14]。由表4可知，添加果膠酶，對葡萄酒中單寧含量有明顯的影響，并隨著果膠酶添加量的增加而增加。在一定濃度果膠酶范圍內(nèi)，隨著果膠酶濃度的增大，果膠酶對葡萄表皮果膠的分解作用增大，分解釋放到果肉中，使果肉中單寧的含量不斷提高[15]。因此，果膠酶濃度越大，對葡萄品質(zhì)影響越大，而葡萄酒在發(fā)酵的過程中單寧的含量均呈快速上升再緩慢增加，最后逐漸降低的變化趨勢，此結(jié)果與楊穎瓊等[16]的研究山葡萄發(fā)酵過程中單寧含量變化趨勢相似。

2.2 果膠酶的添加量對葡萄酒發(fā)酵過程中的甲醇及主要雜醇油含量的變化影響

2.2.1 果膠酶添加量與甲醇變化的關(guān)系

果膠酶的添加量對巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇含量的變化影響圖見圖1。

從圖1可知，4組添加了不同量果膠酶的巨峰葡萄酒在發(fā)酵過程中甲醇含量均從0開始快速增加，發(fā)酵到第14天含量達(dá)到峰值，隨果膠酶添加量由0～200 mg/kg，甲醇含量依次為 165.23、243.98、252.35、272.54 mg/L，發(fā)酵終止時甲醇含量依次為145.28、224.74、232.82、242.45 mg/L，甲醇含量均在國家標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。與對照組相比（145.28 mg/L），甲醇依次增加了79.46、87.54、97.17 mg/L。

圖1 果膠酶的添加量對巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇含量的變化影響Fig.1 Effect of pectinase addition on methanol content in Jufeng wine during fermentation

巨峰葡萄酒中甲醇的含量隨著果膠酶添加量的增加而增加，而隨著發(fā)酵時間的推進(jìn)甲醇含量均呈先上升后緩慢下降的趨勢。由于葡萄酒在發(fā)酵過程中原料的果膠不斷大量酶解，生成甲醇的含量不斷增加，而隨著果膠的大量分解代謝，甲醇生成的速率變低，導(dǎo)致甲醇含量下降。

2.2.2 果膠酶添加量與雜醇油變化的關(guān)系

果膠酶的添加量對巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中雜醇油含量的變化影響見圖2。

圖2 果膠酶的添加量對巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中雜醇油含量的變化影響Fig.2 Effect of pectinase addition on fusel oil content in Jufeng wine during fermentation

從圖2可以看出，4組添加了不同量的果膠酶時的巨峰葡萄酒在發(fā)酵初期沒有雜醇油的產(chǎn)生，到第2 d雜醇油含量從0開始逐漸增加，發(fā)酵到第8天含量達(dá)到峰值，隨果膠酶添加量的增加，雜醇油含量依為224.09、259.47、245.65、238.02 mg/L，發(fā)酵終止時雜醇油含量依次下降到 188.34、241.05、223.88、214.18 mg/L，與對照組比較（188.34 mg/L），雜醇油含量依次增加了52.71、35.54、25.84 mg/L。

添加果膠酶對巨峰葡萄酒中雜醇油的含量有影響，雜醇油的含量不隨著果膠酶添加量增加而增加，反而下降，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行雜醇油含量呈上升后緩慢下降的趨勢。由于雜醇油產(chǎn)生的機理與甲醇不同，雜醇油主要是伴隨著酒精發(fā)酵過程產(chǎn)生的,主要由兩條代謝途徑產(chǎn)生降解代謝路徑和合成代謝路徑；雜醇油α氨基氮源充足時，酵母以氨基酸為基質(zhì)進(jìn)行降解代謝路徑，從而產(chǎn)生雜醇油；當(dāng)發(fā)酵液中可利用的α氨基氮源缺乏時，酵母以糖為基質(zhì)進(jìn)行合成代謝路徑，從而產(chǎn)生雜醇油[17]。

2.3 不同發(fā)酵溫度下葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇及主要雜醇油含量的變化

2.3.1 溫度對甲醇含量的影響

分別選取24、28、30℃進(jìn)行主發(fā)酵，溫度與甲醇的關(guān)系圖見圖3。

圖3 溫度對巨峰葡萄酒發(fā)酵過甲醇含量的變化影響Fig.3 Effect of temperature on methanol content in Jufeng wine during fermentation

從圖3可以看出，3組不同發(fā)酵溫度下巨峰葡萄酒中的甲醇含量均從0開始快速增加，發(fā)酵到第14天時，甲醇含量達(dá)到峰值，隨溫度的升高甲醇含量依次為 252.98、276.5、291.03 mg/L，發(fā)酵終止時甲醇含量依次減到232.82、254.5、267.5 mg/L，含量均在國家標(biāo)準(zhǔn)范圍。與對照組相比（232.82 mg/L），甲醇含量依次增加了 21.68、34.68 mg/L。

溫度對葡萄酒中甲醇含量有影響，甲醇含量隨著溫度的升高而逐漸增加，并隨著發(fā)酵時間的推進(jìn)甲醇含量均呈先上升后下降的變化規(guī)律。溫度升高，甲醇含量逐漸增加，這是因為溫度升高使甲酯酶活性增強[18-19]，在一定溫度范圍內(nèi)果膠酶、纖維素酶、蛋白酶等多種酶活性隨著溫度的升高而逐漸增大，從而使果膠物質(zhì)徹底分解，致使甲醇生成量增多。

2.3.2 溫度對雜醇油含量的影響

分別選取24、28、30℃進(jìn)行主發(fā)酵，溫度與雜醇油的關(guān)系圖見圖4。

圖4 溫度對巨峰葡萄酒發(fā)酵過程雜醇油含量的變化影響Fig.4 Effect of temperature on fusel oil content in Jufeng wine during fermentation

觀察圖4中3組不同溫度下發(fā)酵的巨峰葡萄酒，前2 d無雜醇油產(chǎn)生，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行在第8天雜醇油含量達(dá)到峰值，隨著溫度升高雜醇油含量依次為245.65、210.91、200.66 mg/L，發(fā)酵終止時雜醇油依次降到223.88、173.42、169.81mg/L，與對照相比（223.88mg/L），雜醇油含量依次降低了50.46、54.07 mg/L。

從圖4可以看出，巨峰葡萄酒中雜醇油的含量并不隨著溫度的升高而增加，相反其含量甚至降低，這與曾朝珍等[20]研究結(jié)果相似,但隨著發(fā)酵的進(jìn)行雜醇油含量呈上升后緩慢下降的趨勢。

3 結(jié)論

本研究主要針對巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇雜醇油的變化規(guī)律，研究發(fā)酵溫度和果膠酶添加量對巨峰葡萄酒發(fā)酵過程中甲醇及雜醇油含量的影響及一些理化指標(biāo)的檢測結(jié)果。試驗研究表明：

1）果膠酶添加量對葡萄酒發(fā)酵過程中的總酸、總糖及酒精度等指標(biāo)幾乎沒有影響，但對單寧影響較大，其含量并隨著添加量的增加而增加。自釀葡萄酒在發(fā)酵過程中總酸、總糖含量隨發(fā)酵時的推進(jìn)間先快速下降后趨于平穩(wěn)，而酒精度呈快速上升后趨于平穩(wěn)，而單寧的含量隨發(fā)酵時間均呈先快速上升后緩慢增加最后下降的趨勢。

2）添加果膠酶釀造葡萄酒時，有害物質(zhì)甲醇和雜醇油的含量均有所增加。甲醇增加量與果膠酶添加量成正比，與對照組相比，果膠酶添加到200 mg/kg時甲醇含量接近為對照組的2倍，但其含量均小于國家標(biāo)準(zhǔn)400 mg/L。而雜醇油增加量并未隨果膠酶添加量的增加而增加，相反其含量降低，但與對照組相比，其含量明顯有所增加。

3）葡萄酒在發(fā)酵過程中甲醇含量隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸增加，而雜醇油含量隨溫度升高而逐漸降低。所檢測的巨峰葡萄酒的各項指標(biāo)均符合相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)，無安全隱患。