陳 斌

(上海百雀羚日用化學(xué)有限公司第三分公司，上海 201400)

石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，性甘，微寒。歸胃、腎經(jīng)，具有益胃生津，滋陰清熱的功效。主治熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔等癥[2]。

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)在《中國(guó)藥典(2015年版)》中列為藥用石斛的首要來(lái)源[2]。原植物為石斛(Dendrobiumloddigesii，別名吊蘭花、扁金釵、小黃草、金釵石斛)、矩唇石斛(D.linawianum，別名金石斛)[3]?！敖疴O石斛”之名可能最早載于唐代《道藏》之《太上肘后玉經(jīng)方》[4-5]，《本草綱目》[6]正式將“金釵”作為石斛的別名而收載，并稱(chēng)“其莖狀如金釵之股，故古有金釵石斛之稱(chēng)”。

金釵石斛的化學(xué)成分主要有生物堿類(lèi)、多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、香豆素類(lèi)及甾體糖苷類(lèi)化合物[7]。生物堿類(lèi)成分是最早從石斛屬植物中分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的化合物[8]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)金釵石斛中的生物堿類(lèi)成分進(jìn)行了大量的研究，已鑒定出的生物堿以石斛堿、石斛次堿等倍半萜類(lèi)生物堿為主[9]。金釵石斛多糖類(lèi)成分含量大約為4%[9]，Luo等[10]從金釵石斛粗多糖中分離出多個(gè)組分，主要包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖和少量的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖。此外，從金釵石斛中還分離得到13個(gè)酚酸類(lèi)化合物、15個(gè)聯(lián)芐類(lèi)化合物、8個(gè)菲類(lèi)化合物和2個(gè)芴酮類(lèi)成分[11-13]。

近年來(lái)，金釵石斛在化妝品中應(yīng)用日益增多，主要集中在保濕、延緩衰老、美白等方面[7]。本研究旨在對(duì)以金釵石斛為主要成分的植物復(fù)方在化妝品中的應(yīng)用情況進(jìn)行研究，為其在化妝品中的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CM 825水分含量測(cè)試儀(Courage and khazaka，德國(guó))；VC98皮膚測(cè)試儀(Visioscan)；T6新世紀(jì)型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Herocell 180 CO2培養(yǎng)箱(上海潤(rùn)度生物科技有限公司)；CellInsight CX5激光共聚焦顯微鏡(Thermo fisher scientific)；Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀(Thermo fisher scientific)；T100梯度PCR儀器(Bio-rad)；HH-4恒溫水浴鍋(常州容冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠)；人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(NHEK-C1809，上海冠導(dǎo)生物工程有限公司)；ABTS自由基清除能力檢測(cè)法使用試劑、MTT比色法使用試劑、乙醇、二甲基亞砜(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；Trizol(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金釵石斛提取液的制備

金釵石斛用25倍量的蒸餾水進(jìn)行熱回流提取2次，溫度70℃，提取時(shí)間150 min，合并2次提取液，60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到干粉為金釵石斛水提物。

1.2.2 保濕性能測(cè)試

選取12名的志愿者，分別以5%金釵石斛提取液(S1)、10%金釵石斛提取液(S2)、對(duì)照組為去離子水(CK)進(jìn)行測(cè)試，取測(cè)試樣品5mL均勻涂抹于志愿者左右前臂屈側(cè)，在使用0、 1 、2、4 h后，分別使用水分含量測(cè)試儀對(duì)測(cè)試區(qū)域進(jìn)行皮膚水分含量精密測(cè)試，皮膚水分含量值越大，說(shuō)明皮膚含水量越高。與CK組進(jìn)行對(duì)照分析，評(píng)價(jià)S1和S2的保濕效果。

測(cè)試結(jié)果中涉及的名詞定義及相關(guān)計(jì)算公式如下：

初始值：指未使用任何產(chǎn)品時(shí)的基礎(chǔ)值。

1.2.3 水通道蛋白3(AQP3)測(cè)試

(1)基于角質(zhì)形成細(xì)胞的MTT檢測(cè)

金釵石斛提取液設(shè)置8個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度設(shè)置8個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)置溶劑對(duì)照孔和調(diào)零孔，采用MTT細(xì)胞活性檢測(cè)方法，篩選樣品在角質(zhì)形成細(xì)胞中的最大安全劑量。

細(xì)胞接種：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞消化后接種至96孔板。

樣品配制：精密稱(chēng)取石斛水提物適量，分別配制成濃度為2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 mL/kg的樣品。

給藥：待細(xì)胞鋪板率達(dá)到40%時(shí)，開(kāi)始給予樣品。

培養(yǎng)：給藥完成后，將培養(yǎng)板放置在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

檢測(cè)：細(xì)胞孵育培養(yǎng)24 h后，棄掉上清，加入事先配好的MTT，37℃避光孵育。4 h后棄掉上清，每孔加150 μL二甲基亞砜，酶標(biāo)儀490 nm讀取OD值。

細(xì)胞活性的計(jì)算方法見(jiàn)公式(1-1)：

(1-1)

(2)基于角質(zhì)形成細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)

接種：以3×104個(gè)/孔的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞接種密度接種至含有蓋玻片的24孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜。

配液：精密稱(chēng)取石斛水提物適量配制成濃度500 mL/kg的樣品(根據(jù)MTT檢測(cè)試驗(yàn)所得)。

給藥：待24孔板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到30%時(shí)，開(kāi)始給予樣品。

收樣：孵育培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，4℃冰箱保存。

免疫熒光檢測(cè)：對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透、封閉等操作后，AQP3抗體按照1∶500的工作濃度進(jìn)行孵育，進(jìn)行免疫熒光染色。

拍照：激光共聚焦顯微鏡40倍鏡下拍照。

1.2.4 絲聚蛋白(FLG)及緊密連接蛋白(CLDN-

1 mRNA)表達(dá)檢測(cè)

(1)基于角質(zhì)形成細(xì)胞的MTT檢測(cè)

參考1.2.3(1)MTT檢測(cè)方法

(2)基于角質(zhì)形成細(xì)胞的熒光定量PCR檢測(cè)

接種：以1.8×105個(gè)/孔的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞接種密度接種6孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜。

配液：精密稱(chēng)取石斛水提物適量配制成濃度500 mL/kg(根據(jù)MTT檢測(cè)試驗(yàn)所得)。

給藥：待6孔板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到40%時(shí)，開(kāi)始給予樣品。

培養(yǎng)：給藥完成后，將培養(yǎng)板放置在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

收樣：孵育培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液每孔加入1 mL Trizol，吹打裂解細(xì)胞后，收樣。

PCR 檢測(cè)：采用異硫氰酸胍裂解法，利用RNA提取試劑盒(T2654，北京華越洋生物科技有限公司)經(jīng)裂解、離心、上清吸附、孵育、洗脫、回收后提取獲得RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(WD3126，北京華越洋生物科技有限公司)配置反應(yīng)體系，經(jīng)渦旋離心后在42℃孵育40 min，85℃孵育5 min，短暫離心后獲得cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.5 皮膚表面活性分析方法

試驗(yàn)分為兩組，試驗(yàn)組添加S1；對(duì)照組為去CK。取測(cè)試樣品5 mL均勻涂抹于志愿者左右前臂屈側(cè)，等待4 h后使用皮膚測(cè)試儀測(cè)試受試者使用試驗(yàn)組與對(duì)照組后肌膚鱗屑(角質(zhì)脫落)情況。

1.2.6 抗氧化能力檢測(cè)

本試驗(yàn)采用ABTS法測(cè)定金釵石斛提取液總抗氧化能力，其原理是：ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS·+，在抗氧化物存在時(shí)ABTS·+的產(chǎn)生會(huì)被抑制，在732 nm或405 nm測(cè)定ABTS的吸光度即可測(cè)定并計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。

(1)準(zhǔn)備評(píng)價(jià)金釵石斛提取液試樣0.01 mL，在室溫下孵育10 min。接著添加ABTS的50%乙醇溶液(0.1 mM)1 mL，在室溫下孵育20 min后，利用分光光度計(jì)測(cè)定732 nm下的吸光度A；

(2)準(zhǔn) 備50%乙醇(體積分?jǐn)?shù)，下同)0.01 mL，在室溫下孵育10 min。接著添加ABTS的50%乙醇溶液(0.1 mM)1 mL，在室溫下孵育20 min后，利用分光光度計(jì)測(cè)定732 nm下的吸光度B；

(3)準(zhǔn)備評(píng)價(jià)金釵石斛提取液試樣0.01 mL，在室溫下孵育10 min。接著添加50%乙醇1 mL，在室溫下孵育20 min后，利用分光光度計(jì)測(cè)定732 nm 下的吸光度C。ABTS自由基清除率計(jì)算公式見(jiàn)式(2-2)

(2-2)

式(2-2)中：

A為試樣溶液與ABTS溶液混合后OD值；

B為50%乙醇與ABTS溶液混合后OD值；

C為50%乙醇與試樣溶液混合后OD值。

2 結(jié)果

2.1 金釵石斛植物提取液的保濕性能和效果

由表1可見(jiàn)，與使用前相比，S1在使用1 h后和 2 h后皮膚水分含量均顯著性增加，S2在使用 1 h后皮膚水分含量顯著性增加，CK組在使用后各時(shí)間點(diǎn)皮膚水分含量均無(wú)顯著性變化。

與CK組相比，S1和S2在使用 1 、2 、4 h后，皮膚水分含量的上升率均大于CK組，且在各時(shí)間點(diǎn)均與CK組間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

S1與S2相比，在使用后各時(shí)間點(diǎn)，兩組間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無(wú)顯著性差異。

表1 皮膚水分含量檢測(cè)結(jié)果

2.2 金釵石斛植物提取液對(duì)角質(zhì)形成AQP3表達(dá)效果的影響

試驗(yàn)采用熒光顯微鏡拍照，其中綠色熒光部分顯示的是AQP3蛋白表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)，使用金釵石斛提取液后熒光強(qiáng)度明顯增高，說(shuō)明金釵石斛提取液可以有效的提高角質(zhì)形成細(xì)胞水通道蛋白 AQP3的表達(dá)。

圖1 金釵石斛提取液對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中水通道蛋白AQP3的表達(dá)的影響Fig.1 The effect of D. mobile extraction on the expression of aquaporin AQP3 in keratinocytes

2.3 金釵石斛植物提取液對(duì)FLG及CLDN-1 mRNA表達(dá)效果的影響

構(gòu)建以上角質(zhì)形成細(xì)胞模型，采用qRT-PCR方法分析金釵石斛提取液對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞絲聚蛋白FLG及緊密連接蛋白CLDN-1 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明(圖2、圖3)，0.25 mL/L處理組較空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，0.5 mL/L處理組的mRNA擴(kuò)增倍數(shù)遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組，故高濃度金釵石斛提取液可有效提高角質(zhì)形成細(xì)胞絲聚蛋白FLG及緊密連接蛋白LDN-1 mRNA的表達(dá)。

圖2 金釵石斛提取液對(duì)角質(zhì)形成FLG mRNA的表達(dá)的影響Fig.2 Effects of liquid addition on mRNA expression of filaggrin FLG in keratinocytes

圖3 金釵石斛提取液對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞緊密連接蛋白CLDN-1 mRNA的表達(dá)的影響Fig.3 Effects of liquid enrichment element on the expression of CLDN-1 mRNA in keratinocytes

2.4 金釵石斛植物提取液對(duì)皮膚表面活性的影響

使用皮膚測(cè)試儀評(píng)估受試者使用金釵石斛提取液前后肌膚鱗屑的改善情況，圖像中白色代表剝落的角質(zhì)。結(jié)果表明(圖4)，試驗(yàn)組測(cè)試區(qū)域涂抹含S1 4 h后，肌膚的鱗屑狀態(tài)相對(duì)于涂抹前有顯著改善(圖4A、圖4B)；而空白組測(cè)試區(qū)域在涂抹CK 4 h后，肌膚因水分蒸發(fā)起屑狀態(tài)相對(duì)于涂抹前更加嚴(yán)重(圖4C、圖4D)。說(shuō)明金釵石斛提取液可即時(shí)撫平肌膚因干燥引起的鱗屑，潤(rùn)澤肌膚。

圖4 金釵石斛提取液撫平肌膚因干燥引起的鱗屑的效果Fig. 4 The effect of D. mobile extraction on smoothing the scale of skin caused by dryness

2.5 金釵石斛植物提取液的抗氧化活性能力

由圖5可知，金釵石斛提取液具有一定的清除ABTS自由基活性，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著受試濃度的增加，對(duì)ABTS自由基的清除率越大。結(jié)果說(shuō)明金釵石斛提取液在生化水平具有一定的抗氧化活性。

圖5 金釵石斛提取液對(duì)ABTS自由基清除率Fig.5 Scavenging rate of ABTS free radical by D. mobile extraction

3 討論

生物細(xì)胞在其代謝過(guò)程中可連續(xù)不斷地產(chǎn)生大量自由基。在正常情況下，機(jī)體會(huì)不斷產(chǎn)生多種內(nèi)源性抗自由基的活性物質(zhì)，但在光輻射或其他內(nèi)外環(huán)境異常情況下，體內(nèi)抗自由基系統(tǒng)平衡破壞，引起生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞生物膜的功能和結(jié)構(gòu)完整性，最終會(huì)導(dǎo)致皮膚的損傷和衰老[18]。而研究表明石斛有效成分包括生物堿、多糖、微量元素和氨基酸等成分[14]，作用于肌膚可發(fā)揮良好的保濕功效。有研究表明[15]，金釵石斛復(fù)方提取液可以促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白AQP3、緊密連接蛋白ZO-1及Claudin-1的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的滲透能力，具有良好的鎖水、保濕作用，這與本研究發(fā)現(xiàn)的金釵石斛可以促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白AQP3的表達(dá)結(jié)果一致。翟東輝等[17]研究表明，石斛多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的活性，起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用。本試驗(yàn)補(bǔ)充了金釵石斛提取液對(duì)ABTS自由基清除的能力，這與黃小燕等[19]發(fā)現(xiàn)的金釵石斛提取物具有良好的抗氧化能力的結(jié)果相符。此外，本試驗(yàn)也證明了金釵石斛還可以提高絲聚蛋白FLG及緊密連接蛋白CLDN-1 mRNA表達(dá)效果，足以說(shuō)明金釵石斛可以充分利用于化妝品的開(kāi)發(fā)和研究。

金釵石斛的現(xiàn)代研究已有幾十年歷史，在化妝品領(lǐng)域中應(yīng)用也日益增多。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外一些著名化妝品公司已推出一系列含有金釵石斛提取液的護(hù)膚品。研究表明金釵石斛作用于皮膚，確有保濕、美白、延緩衰老等作用，但至今還未發(fā)現(xiàn)具有這些作用的化學(xué)成分，其保濕、免疫抑制、鈣通道抑制、抗氧化和延緩衰老、抗炎美白等作用在化妝品中的應(yīng)用研究仍有很大發(fā)展空間。相信隨著分離技術(shù)的提高和研究?jī)?nèi)容的深入，金釵石斛及其復(fù)方作為天然植物活性添加劑在化妝品中應(yīng)用將越來(lái)越廣。