張艷 王旭東 金愛(ài) 何艷 詹云惠 沈敬堃 董宇華 宛蕾

摘 要 目的：研究鈣激活中性蛋白酶（Calpain）抑制劑Calpeptin對(duì)雌二醇（E2）誘導(dǎo)人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A轉(zhuǎn)化及干性標(biāo)志物表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：以人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A為研究對(duì)象，采用E2誘導(dǎo)制備轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型。將細(xì)胞分為對(duì)照組[0.1%二甲基亞砜（DMSO）]、E2轉(zhuǎn)化組（50 nmol/L）、E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組（50 nmol/L E2+1 μmol/L Calpeptin），以相應(yīng)含藥培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)15代。然后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率（24、48 h），采用平板克隆試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成率，采用懸浮成球試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的成球數(shù);采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)細(xì)胞中干性標(biāo)志物（CD44、Nanog、OCT4）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）mRNA表達(dá)水平，并采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表達(dá)水平。另取E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞分為對(duì)照組（0.1%DMSO）和U0126（ERK抑制劑）組（10 μmol/L），按上述方法測(cè)定細(xì)胞的克隆形成率、成球數(shù)以及細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表達(dá)水平，以驗(yàn)證ERK表達(dá)抑制與轉(zhuǎn)化細(xì)胞生物學(xué)行為及干性標(biāo)志物表達(dá)之間的關(guān)系。結(jié)果：與對(duì)照組比較，E2轉(zhuǎn)化組細(xì)胞的增殖率（24、48 h）、克隆形成率均顯著升高（P<0.01），細(xì)胞成球數(shù)均顯著增加（P<0.01），細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK mRNA表達(dá)水平及CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與E2轉(zhuǎn)化組比較，E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組細(xì)胞的增殖率（24、48 h）、克隆形成率均顯著降低（P<0.01），細(xì)胞成球數(shù)顯著減少（P<0.05），細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA表達(dá)水平及CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。加入ERK抑制劑U0126后，E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞的克隆形成率、成球數(shù)以及細(xì)胞中p-ERK、CD44、Nanog、OCT4蛋白表達(dá)水平均顯著增加或升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：Calpeptin可抑制E2誘導(dǎo)的人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A轉(zhuǎn)化及干性標(biāo)志物表達(dá)，其機(jī)制可能與抑制Calpain-ERK信號(hào)通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞 Calpeptin;雌二醇;人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A;細(xì)胞轉(zhuǎn)化;干性標(biāo)志物;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶;機(jī)制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of Calpeptin inhibitor Calpeptin on the transformation and stemness markers expression induced by estradiol （E2）， and to investigate its mechanism. METHODS： Taking human mammary epithelial cells MCF-10A as research object， transformed cells were induced by E2 treatment. Cells were divided into control group（0.1%DMSO）， E2-transformed group （50 nmol/L）， E2-transformed+Calpeptin group （50 nmol/L E2+1 μmol/L Calpeptin）， then continuously treated with corresponding drug-containing culture medium for 15 generations. Then， MTT assay was used to determine the proliferation rate of cells （24，48 h）; plate colony test was used to detect the Clone formation rate of cells; the number of sphere-forming cells was measured by suspension spheroidization test;mRNA expressions of stemness marker （CD44， Nanog， OCT4） and extracellular sigal-regulated kinase （ERK） were detected by RT-qPCR，and protein expressions of CD44， Nanog， OCT4 ， ERK and p-ERK were detected by Western blotting assay. Another E2-transformed cells were divided into control group （0.1%DMSO） and U0126 （ERK inhibitor） group （10 μmol/L）. Clone formation rate， the number of sphere-forming， protein expressions of CD44， Nanog， OCT4，ERK and p-ERK were determined with above methods， and to validate the relationship of ERK inhibition with transformed cell behavior and the expression of stemness markers. RESULTS：Compared with control group， proliferation rate and clone formation rate of E2 transformed group were increased significantly （P<0.01）， and the number of sphere-forming was increased significantly （P<0.01）; mRNA expression levels of CD44， Nanog， OCT4，ERK and protein expression levels of CD44， Nanog， OCT4 and p-ERK in cells were increased significantly （P<0.01）. Compared with E2-transformed group， proliferation rate （24， 48 h） and clone formation rate of E2-transformed+Calpeptin group were decreased significantly （P<0.01）， and the number of sphere-forming was decreased significantly （P<0.05）; mRNA expression levels of CD44， Nanog， OCT4 ， ERK and protein expression levels of CD44， Nanog， OCT4， p-ERK in cells were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After treated with ERK inhibitor U0126， clone formation rate of E2-transformed cells， the number of sphere-forming， protein expression levels of CD44， Nanog， OCT4 and p-ERK were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Calpeptin can inhibit the transformation and the expression of stemness markers of human mammary epithelial cells MCF-10A， and the mechanism of it may be associated with inhibiting the activation of Calpain-ERK signaling pathway.

KEYWORDS? ?Calpeptin; Estradiol; Human mammary epithelial cells MCF-10A; Cell transformation; Stemness marker; Extracellular sigal-regulated kinase; Mechanism

雌二醇（E2）是誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[1]，其可通過(guò)激活雌激素受體（ER）或代謝產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物，從而誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及癌變發(fā)生[2-3]。相關(guān)研究顯示，乳腺腫瘤干細(xì)胞（BCSCs）在乳腺癌的發(fā)生、維持、轉(zhuǎn)移、治療抵抗和復(fù)發(fā)中起著重要作用，而E2與BCSCs的產(chǎn)生密切相關(guān)[4]。人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A是一種非致瘤性乳腺上皮細(xì)胞，正常情況下其呈不規(guī)則多邊形貼壁生長(zhǎng)，且增殖緩慢;但經(jīng)E2長(zhǎng)期誘導(dǎo)后，MCF-10A細(xì)胞將失去上皮細(xì)胞相關(guān)特性，胞體變大，呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，增殖能力增強(qiáng)，且具有一定的間質(zhì)特征[5]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，E2能誘導(dǎo)人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的自我更新、多潛能分化等干性特征增強(qiáng)，促進(jìn)該細(xì)胞向BCSCs轉(zhuǎn)化[6]。

鈣激活中性蛋白酶（Calcium-activated neutral protease，縮寫為“Calpain”）是一種Ca2+依賴型半胱氨酸蛋白酶，主要成員有Calpain-1和Calpain-2，可參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的多種惡性生物學(xué)行為[7-8]。Calpeptin是一種具有細(xì)胞穿透性的Calpain抑制劑，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，Calpeptin可通過(guò)抑制ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Calpain的活性，從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在E2誘導(dǎo)人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，通常伴隨著Calpain活性的增強(qiáng)[10]。而Calpain活性增強(qiáng)在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其參與介導(dǎo)了上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及癌細(xì)胞的遷移、增殖[10-12]。但有關(guān)Calpain是否介導(dǎo)了E2誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A干性特征增強(qiáng)，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。另有研究顯示，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路的激活與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[13]。但Calpeptin是否能通過(guò)ERK通路干預(yù)乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A轉(zhuǎn)化以及干性特征增強(qiáng)，也同樣尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究旨在通過(guò)探討Calpain抑制劑Calpeptin對(duì)E2誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A轉(zhuǎn)化及干性標(biāo)志物（CD44、OCT4、Nanog）表達(dá)的影響，并通過(guò)探究Calpain-ERK信號(hào)通路在其中的介導(dǎo)作用，為闡明Calpeptin抑制E2誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ND2000型超微量紫外分光光度計(jì)、2001HY-6003型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;HH-W21-Cr600型電熱恒溫水溫箱、DW-86L486型立式超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）;SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;FA2204N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）;ZHWY-103D型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）;DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）;Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）;CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;TI-U-DS-RI2型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）;Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）;TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床、VORTEX-5型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;Step One PlusTM型實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 藥品與試劑

E2標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：WXBC5362V，純度：>98%）、Calpeptin（批號(hào)：C8999，純度：>98%）、氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：PHR1014，純度：100%）、霍亂毒素（批號(hào)：C8052，純度：95%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;U0126（ERK抑制劑，美國(guó)Med Chem Express公司，批號(hào)：HY-12031，純度：>98%）;馬血清、0.25%胰蛋白酶、B-27添加物（50×）（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)分別為：1893656、2046777、2046964）;表皮生長(zhǎng)因子（ EGF，美國(guó)PeproTech公司，批號(hào)：0515AFC05）;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFB，中國(guó)近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，批號(hào)：0331504）;重組人胰島素（上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)：11820131，含量：95%～105%）;磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末、1%結(jié)晶紫染色液、5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒、高效RIPA組織/快速裂解液、膜再生液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為：1022Q021、20180627、20190328、20191104、20190711、20190715）;青鏈霉素、DMEM/F12培養(yǎng)基（美國(guó) Hyclone 公司，批號(hào)分別為：J150038、AE28870264）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：UD277257）;MTT試劑盒（北京博奧拓科技有限公司，批號(hào)：298-93-1）;Trizol試劑（美國(guó)Ambion Life Technologies公司，批號(hào)：149002）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、PCR反應(yīng)試劑SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本Takara公司，批號(hào)分別為：AK6301、AIG2363A）;CD44小鼠單克隆抗體、ERK兔多克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technolog公司，批號(hào)分別為：3570S、4695S）;Nanog、OCT4兔單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為：ab109250、ab109183）;磷酸化ERK（p-ERK）小鼠多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：SC-7383）;α-微管蛋白（α-tubulin）兔多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG二抗（美國(guó) Bioworld 公司，批號(hào)分別為：BS1699、MB001、BS13278、BS12478）;甲醇、二甲基亞砜（DMSO）、乙醇等均為分析純，水為雙蒸水。CD44、Nanog、OCT4、ERK和GAPDH引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 細(xì)胞

人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A由陸軍軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)教研室饋贈(zèng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A培養(yǎng)于DMEM/F12全培養(yǎng)基中（含有10%馬血清、10 ng/mL霍亂毒素、50? ? ng/mL氫化可的松、10 μg/mL胰島素、20 ng/mL EGF以及1%青鏈霉素，下同），在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱（后文條件相同）中進(jìn)行培養(yǎng)，每48 h更換1次培養(yǎng)液。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

將乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A隨機(jī)分為對(duì)照組、E2轉(zhuǎn)化組（DMSO終體積分?jǐn)?shù)為0.1%，下同）和E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組（DMSO終體積分?jǐn)?shù)為0.1%，下同）。3組細(xì)胞分別以0.1%DMSO、E2（50 nmol/L）、E2（50 nmol/L）+Calpeptin（1 μmol/L）連續(xù)處理15代，每次傳代時(shí)均加入相應(yīng)藥物處理，然后按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。細(xì)胞轉(zhuǎn)化標(biāo)志：細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化（細(xì)胞胞體變大，胞內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒，排列紊亂，呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，具有一定的間質(zhì)細(xì)胞樣特性），生長(zhǎng)加速，克隆形成能力增強(qiáng)[5]。

2.3 MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

取“2.2”項(xiàng)下3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min離心5 min，用DMEM/F12全培養(yǎng)基重懸并調(diào)整各組細(xì)胞密度至4×104個(gè)/mL，然后接種于96孔板中，每孔200 μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。另外設(shè)置不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的調(diào)零孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，吸棄培養(yǎng)液，每孔中加入200 μL不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔中均避光加入5%MTT試液20 μL，混勻，培養(yǎng)3 h后，終止培養(yǎng);棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO溶液，低速振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率（%）=（給藥組OD值-調(diào)零孔OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 平板克隆試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力

取“2.2”項(xiàng)下3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別按400個(gè)/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每孔中加入4 mL DMEM/F12全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d;棄去培養(yǎng)液，以PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛溶液固定30 min;以0.1%結(jié)晶紫染色30 min后，洗去染色液，常溫晾干。用相機(jī)拍照并觀察其克隆集落形成情況，使用Image J 1.8.0軟件對(duì)克隆集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算其克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=（克隆集落形成數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù)）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 懸浮成球試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的自我更新能力

取“2.2”項(xiàng)下3組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別按? ? ? ?5 000個(gè)/孔接種于24孔超低黏附板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每孔中加入2 mL懸浮成球試驗(yàn)培養(yǎng)基（含5 μg/mL胰島素、2%B-27添加物、20 ng/mL EGF、20 ng/mL FGFB、1 μg/mL氫化可的松和1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后，于顯微鏡下拍照并對(duì)每組的成球情況進(jìn)行計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量-PCR試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA的表達(dá)情況

取“2.2”項(xiàng)下3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，以DMEM/F12培養(yǎng)基（不含血清）于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按照Trizol說(shuō)明書(shū)方法操作，分離提取細(xì)胞中的總RNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定各組RNA濃度。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒并按說(shuō)明書(shū)方法操作，將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ 10.4 μL、無(wú)酶水6 μL，總體系為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔct法計(jì)算CD44、Nanog、OCT4和ERK mRNA的表達(dá)水平（其中ct表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。試驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

2.7 Western bloting試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和p-ERK蛋白的表達(dá)情況

取“2.2”項(xiàng)下3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞接種、培養(yǎng)，然后以RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，再以BCA法進(jìn)行蛋白定量后進(jìn)行制樣。蛋白樣品在80 V電壓下電泳30 min后，調(diào)節(jié)電壓至120 V繼續(xù)電泳1 h;然后以電流300 mA轉(zhuǎn)膜[聚偏氟乙烯（PVDF）膜]1.5 h，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;分別加入稀釋比例均為1 ∶ 1 000的CD44、Nanog、OCT4、ERK、p-ERK一抗和稀釋比例為1 ∶ 10 000的GAPDH一抗，4 ℃下孵育過(guò)夜;以1×TBST溶液洗膜3次，每次10 min;加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1 ∶ 10 000），室溫下孵育1 h;以1×TBST溶液洗膜3次，每次10 min，再用ECL發(fā)光試劑盒顯色。以凝膠成像系統(tǒng)成像，并用Image J 1.8.0軟件分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 U0126抑制ERK蛋白表達(dá)后對(duì)E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆形成能力、自我更新能力以及干性標(biāo)志物表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組（含0.1%DMSO）和U0126（ERK抑制劑）組（10 μmol/L）。分別按“2.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力，按“2.7”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4和p-ERK蛋白的表達(dá)情況（以α-tubulin為內(nèi)參，稀釋比例為1 ∶ 10 000）。試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和分析。數(shù)據(jù)以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩獨(dú)立樣本組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Calpeptin對(duì)E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的影響

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，E2轉(zhuǎn)化組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞體積變大，具有一定的間質(zhì)細(xì)胞樣特征;E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組接近。各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征顯微圖見(jiàn)圖1。

3.2 Calpeptin對(duì)E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖能力的影響

培養(yǎng)24、48 h后，與對(duì)照組比較，E2轉(zhuǎn)化組細(xì)胞的增殖率均顯著升高（P<0.01）;與E2轉(zhuǎn)化組比較，E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組細(xì)胞的增殖率均顯著降低（P<0.01）。各組細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 Calpeptin對(duì)E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆形成能力的影響

與對(duì)照組比較，E2轉(zhuǎn)化組細(xì)胞的克隆形成率顯著升高（P<0.01）;與E2轉(zhuǎn)化組比較，E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組細(xì)胞的克隆形成率顯著降低（P<0.01）。各組細(xì)胞克隆形成情況平板圖見(jiàn)圖2，克隆形成率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 Calpeptin對(duì)E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞自我更新能力的影響

與對(duì)照組比較，E2轉(zhuǎn)化組細(xì)胞的成球數(shù)顯著增加（P<0.01）;與E2轉(zhuǎn)化組比較，E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組細(xì)胞的成球數(shù)顯著減少（P<0.05）。各組細(xì)胞成球情況顯微圖見(jiàn)圖3，成球數(shù)測(cè)定結(jié)果表4。

3.5 Calpeptin對(duì)E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，E2轉(zhuǎn)化組細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與E2轉(zhuǎn)化組比較，E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞中4種標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

3.6 Calpeptin對(duì)E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，E2轉(zhuǎn)化組細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4和p-ERK蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與E2轉(zhuǎn)化組比較，E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;3組細(xì)胞中ERK蛋白表達(dá)水平間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組細(xì)胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)電泳圖見(jiàn)圖4，蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

3.7 ERK表達(dá)被抑制后對(duì)E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞的克隆形成能力、自我更新能力以及干性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，U0126組中p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），表明ERK蛋白表達(dá)被抑制;細(xì)胞的克隆形成率顯著降低（P<0.01），成球數(shù)顯著減少（P<0.05），干性相關(guān)蛋白（CD44、Nanog、OCT4）的表達(dá)水平也顯著降低（P<0.05）。這提示抑制ERK表達(dá)后，E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞的克隆形成能力、自我更新能力以及干性相關(guān)蛋白的表達(dá)均減弱。ERK抑制劑U0126作用下各組細(xì)胞中ERK、p-ERK蛋白和干性相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5、表7，細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞成球情況測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6、表8。

4 討論

乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化是乳腺癌發(fā)生的必要過(guò)程。腫瘤干細(xì)胞是細(xì)胞內(nèi)具有自我更新、多潛能分化和腫瘤特殊生物學(xué)行為的一類細(xì)胞亞群，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。近期有研究顯示，E2可以促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A獲得干細(xì)胞特性[6]。CD44、Nanog和OCT4均是公認(rèn)的癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物。據(jù)報(bào)道，CD44可通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)成分、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子相互作用來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[15]。而Nanog和OCT4在多種癌癥干細(xì)胞中都呈異常高表達(dá)狀態(tài)，其高表達(dá)后能夠促進(jìn)細(xì)胞的重新編程，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、自我更新和多能性分化等干細(xì)胞特征[16-17]。本研究采用E2連續(xù)培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 15代，發(fā)現(xiàn)E2處理后細(xì)胞出現(xiàn)了一定的間質(zhì)細(xì)胞樣特征，細(xì)胞活力、克隆形成能力以及自我更新能力均顯著增強(qiáng)，這表明細(xì)胞在E2作用下發(fā)生了轉(zhuǎn)化。同時(shí)，E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞中干性標(biāo)志物CD44、Nanog、OCT4 mRNA及其蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，這提示E2不僅可誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，還可增強(qiáng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的干性特征。

Calpain的生物學(xué)活性與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其可通過(guò)修飾性剪切多種腫瘤抑制蛋白，促進(jìn)上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[18-19]。Calpain抑制劑Calpeptin是一種具有細(xì)胞滲透性的特異性抑制劑。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Calpeptin在1～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)能顯著抑制E2誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖[20]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，10? ? ? ? μmol/L Calpeptin能顯著抑制E2誘導(dǎo)的MCF-10A轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖[21]。故在本次研究的預(yù)試驗(yàn)中，筆者先是以1、5、10 μmol/L Calpeptin聯(lián)合E2連續(xù)處理細(xì)胞MCF-10A 15代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5、10 μmol/L Calpeptin的作用下細(xì)胞逐漸凋亡，只有在1 μmol/L濃度下細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)，同時(shí)能顯著抑制E2誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。所以，在本次探討Calpeptin對(duì)E2誘導(dǎo)人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A轉(zhuǎn)化和干性特征的影響機(jī)制研究中，筆者選擇1 μmol/L為干預(yù)濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該濃度下Calpeptin 可抑制E2誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的轉(zhuǎn)化和干性特征的增強(qiáng)，這提示Calpain可能參與介導(dǎo)了E2誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和干性特征增強(qiáng)。

當(dāng)ERK信號(hào)通路被激活時(shí)，非活性ERK被磷酸化為活化形式的p-ERK，并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄激活核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及癌癥發(fā)生[22]。有研究顯示，ERK信號(hào)通路的激活與乳腺癌[23-24]、肺癌[25-26]、甲狀腺癌[27]等癌癥細(xì)胞的增殖、遷移以及干細(xì)胞特性增強(qiáng)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，E2轉(zhuǎn)化組細(xì)胞可高表達(dá)ERK mRNA和p-ERK蛋白，但E2轉(zhuǎn)化+Calpeptin組細(xì)胞ERK mRNA和p-ERK蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，這提示Calpeptin抑制E2誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及干性標(biāo)志物表達(dá)的作用可能與抑制ERK信號(hào)通路的激活有關(guān)。為了驗(yàn)證以上結(jié)論，筆者進(jìn)一步以ERK特異性抑制劑U0126處理E2轉(zhuǎn)化細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)U0126處理后，細(xì)胞的增殖能力和自我更新能力均顯著減弱，干性相關(guān)蛋白的表達(dá)也顯著下調(diào)，這進(jìn)一步說(shuō)明ERK信號(hào)通路可能參與介導(dǎo)了E2誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A轉(zhuǎn)化及其干性增強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，E2可通過(guò)激活Calpain-ERK信號(hào)通路促進(jìn)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖[28]。但本研究發(fā)現(xiàn)，Calpain抑制劑Calpeptin在抑制E2誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的同時(shí)，能顯著下調(diào)E2誘導(dǎo)的p-ERK蛋白的表達(dá)。由此推測(cè)，細(xì)胞內(nèi)可能存在Calpain-ERK的正反饋環(huán)路，后者在E2作用下被激活，促進(jìn)Calpain活性增強(qiáng)，從而參與誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及其干性增強(qiáng);而當(dāng)Calpain活性被抑制時(shí)，可能反饋性調(diào)節(jié)ERK的磷酸化作用，抑制了ERK的磷酸化，從而抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及干性增強(qiáng)。

綜上所述，Calpeptin能抑制E2誘導(dǎo)的人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A轉(zhuǎn)化及干性標(biāo)志物的表達(dá)，其機(jī)制可能與抑制Calpain-ERK信號(hào)通路的激活有關(guān)，但其具體作用靶點(diǎn)和機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步確證。

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（收稿日期：2020-03-02 修回日期：2020-05-13）

（編輯：林 靜）