溫陳金 薛程 柯美玉

摘 ? 要：研究將FvREM2.1基因異源過(guò)表達(dá)到擬南芥中，結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)FvREM2.1基因能明顯抑制擬南芥根生長(zhǎng)，引起根的向重性失衡，且在pSUC2：GFP背景下過(guò)表達(dá)FvREM2.1導(dǎo)致GFP在根部卸載受抑制，表明FvREM2.1通過(guò)調(diào)控胞間連絲的通透性，參與了草莓根的發(fā)育。

關(guān)鍵詞：草莓Remorin家族;全基因組;鑒定;功能

草莓果實(shí)主要由其膨大的花托和種子構(gòu)成，具有濃郁的特殊香氣，被譽(yù)為“水果皇后”。對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，健康且發(fā)達(dá)的根系是保障其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要前提。從育種上提高草莓根系的生命活力，是解決上述問(wèn)題的有效方法之一。解析草莓根系發(fā)育的分子機(jī)制，可為草莓的分子輔助育種和基因工程改良提供重要的理論與應(yīng)用基礎(chǔ)。

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，同化物的運(yùn)輸效率影響著植物的生長(zhǎng)和果實(shí)的發(fā)育[1]。闡明胞間連絲通透性的調(diào)控機(jī)制，可進(jìn)一步揭示草莓根中的同化物運(yùn)輸機(jī)制，為草莓分子輔助育種和基因工程改良提供理論依據(jù)。Remorin（REM）蛋白定位在胞質(zhì)膜上，參與調(diào)控植物多個(gè)生理通路，而成為一個(gè)重要的研究對(duì)象[2]。

本研究利用生物信息學(xué)軟件，對(duì)FvREM基因家族進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析、序列特征分析和聚類分析等，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到了在根部特異高表達(dá)的FvREM2.1。擬南芥中過(guò)量表達(dá)FvREM2.1，表現(xiàn)為明顯根的伸長(zhǎng)受抑制及向重性缺失。解析草莓FvREM基因家族成員的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步闡述草莓根系發(fā)育的機(jī)制研究提供了重要的基因資源，并且對(duì)草莓進(jìn)行分子輔助育種和基因工程改良等均具有重要意義。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 試驗(yàn)材料

植物材料和生長(zhǎng)條件：所用的植物材料有二倍體草莓品種，為森林草莓（Fragaria vesca Ruegen紅果），及pSCU2：GFP背景株系為野生型的擬南芥（Arabidopsis thaliana）。這些草莓和擬南芥植物種植于人工培養(yǎng)室中，室溫為恒溫22 ℃，光照強(qiáng)度為8 000 lx，光周期為光照16 h、黑暗8 h。

1.2 ? 草莓REM家族成員進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及其在蛋白質(zhì)位置的分析

草莓REM基因的鑒定，使用來(lái)自擬南芥的REM蛋白序列作為查詢條件，在PHYTOZOME V12.0網(wǎng)站上進(jìn)行BLASTp搜索，通過(guò)同源比對(duì)法鑒定得到了草莓REM基因家族成員。擬南芥AtREM基因文件從TAIR網(wǎng)站（擬南芥信息資源，http：//www.arabidopsis.org）下載。為了探討草莓與擬南芥之間的進(jìn)化關(guān)系，將擬南芥AtREM（16個(gè)）和FvREM（11個(gè)）進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用MEGA X構(gòu)建了擬南芥與草莓的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[3]。

FvREM基因的基因結(jié)構(gòu)通過(guò)在線網(wǎng)站：Gene Structure Display Server（GSDS）[4]進(jìn)行呈現(xiàn)。

使用Motif analysis tool Multiple Em for motif Elicitation（MEME：http：//meme-suite.org/tools/meme）（Bailey et al.，2009）對(duì)FvREM家族成員進(jìn)行保守motif檢測(cè)，默認(rèn)參數(shù)為motif位點(diǎn)分布、順序分布為每個(gè)序列出現(xiàn)0次或1次（zoops）。

基因表達(dá)分析：不同草莓品種的RNA-Seq數(shù)據(jù)[5-6]來(lái)自以對(duì)數(shù)（1og2）轉(zhuǎn)化每個(gè)REM基因每千堿基每百萬(wàn)分（RPKM）值，用R繪制表達(dá)量熱圖。

1.3 ? DNA、RNA的提取及cDNA的合成

森林草莓Ruegen總DNA的提取，采用改良CTAB（Lade et al.，2014）的方法。森林草莓Ruegen總 RNA 提取用（DP441）RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行。RNA 樣品核酸濃度測(cè)定和質(zhì)量檢測(cè)用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行?？俁NA 的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TransScript One-Step RT-PCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.4 ? CDS克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

在PHYTOZOME V12.1數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得森林草莓FvREM2.1基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物 FvREM2.1-F 和 FvREM2.1-R（表1），進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。利用PrimerSTAR GXL DNA聚合酶（TaKaRa， Japan）以Ruegen的gDNA為模板，擴(kuò)增出FvREM2.1基因片段。擴(kuò)增體系為50 μL：2× PrimeSTAR 酶1 μL;dNTP Mixture（2.5 mM each）4 μL;5× PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL;Steril-ized ddH2O 32 μL;引物 FvREM2.1-F 和FvREM2.1-R各1 μL;模板1 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性 5 min;98 ℃變性30 s，58 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將回收的片段亞克隆連接到pDONR221中，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證后，挑取測(cè)序正確的質(zhì)粒。利用Gateway技術(shù)將FvREM2.1片段與pDONR221重組載體插入pMDC7B中。用擴(kuò)增引物（表1）鑒定最終載體的陽(yáng)性克隆，得到FvREM2.1基因目的條帶，表明已成功轉(zhuǎn)入，最終誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)載體。

1.5 ? 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥

將克隆好的XVE：FvREM2.1載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌株GV3101，用GRS（慶大霉素、利福平霉素、壯觀霉素）抗性篩選出目的菌株，挑取菌點(diǎn)加在10 mL帶GRS抗性的YEB液體中，在28 ℃ 200 rpm搖床培養(yǎng)16 h后，用電泳凝膠鑒定菌液中的目的條帶。選取正確的菌，加到50 mL帶GRS抗性的YEB液體中，在28 ℃ 200 rpm搖床培養(yǎng)16 h后，對(duì)擬南芥花序進(jìn)行浸花法侵染。將獲得的 T0代擬南芥種子消毒后播種在含有HYG（潮霉素）抗性的 1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，初步篩選出綠色抗性苗并移入土中。提取 T1代抗性苗的DNA和RNA，進(jìn)行PCR和qRT檢測(cè)（檢測(cè)引物FvREM2.1-F和FvREM2.1-R，表1）轉(zhuǎn)基因株系。

1.6 ? 擬南芥表型分析

轉(zhuǎn)基因株系與背景株系種植在1/2 MS培養(yǎng)基上和在1/2 MS+5 μM ES（雌二醇）培養(yǎng)基上，觀察植物生長(zhǎng)狀況。用激光共聚焦顯微鏡觀察在ES誘導(dǎo)下的植株根尖pSUC2：GFP的分布情況。激發(fā)共聚焦的激發(fā)參數(shù)和檢測(cè)參數(shù)設(shè)置分別為GFP：488 nm，505～550 nm。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 草莓REM基因家族的全基因組成員鑒定與進(jìn)化樹(shù)分析

根據(jù)16個(gè)擬南芥REM 基因（AtREM）與11個(gè)草莓 REM 基因（FvREM）的氨基酸序列，利用 MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，擬南芥和草莓的REM成員被分為4組，系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析探討了它們之間的進(jìn)化關(guān)系。Group4中成員最多，共有12個(gè)成員，其中AtREM和FvREM各有6個(gè);Group3僅有擬南芥成員：1個(gè)AtREM3.1和2個(gè)AtREM6s成員，不包含草莓基因;FvREM2.1與AtREM4.1，F(xiàn)vREM4.2組成了Group2，該簇的擬南芥成員在功能上已有報(bào)道，參與抗病毒防御;Group1主要包括了FvREM1s及AtREM1s全部成員和AtREM3.2。

2.2 ? 基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

為分析草莓REM的基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)獲得的基因組及CDS序列，繪制成顯示外顯子-內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)圖（圖2）。結(jié)果表明，REM家族基因都含有內(nèi)含子，F(xiàn)vREM2.1只有1個(gè)內(nèi)含子，其他成員最多可達(dá)6個(gè)內(nèi)含子。該家族成員的特征是含有一個(gè)高度保守的

C端區(qū)域，該區(qū)域包含一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域和一組保守的正電荷和脂肪族氨基酸殘基，與質(zhì)膜（PM）的低聚化和定位相關(guān)[7]。相比之下，在不同的FvREM中，N-末端區(qū)域是高度可變的或缺失的。其中，僅有FvREM1.2的序列含有N端，其他序列則主要含C端。FvREM基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度在965～9 681堿基，編碼的多肽鏈長(zhǎng)度在160～747氨基酸。經(jīng)MEME在線軟件的分析，得到10個(gè)保守motif，其中，F(xiàn)vREM家族基因都含有保守的motif 1，除了基因FvREM2.2外，其他家族基因都含有motif 2。FvREM1所有的成員，F(xiàn)vREM2.1及FvREM4.1都含有motif 2-motif 1-motif 3緊密排列的結(jié)構(gòu)（圖3），推測(cè)它們?cè)诠δ苌陷^相近。

2.3 ? FvREM不同時(shí)空的表達(dá)分析

FvREM家族基因在轉(zhuǎn)錄水平上有一定的組織特異性和時(shí)序性。其中FvREM4.2、FvREM4.3及FvREM4.5在SAM（莖尖分生組織）、FM（花分生組織）、REM（花托分生組織）有相對(duì)較高的表達(dá)。FvREM4.5在各不同時(shí)空中表達(dá)水平較穩(wěn)定。FvREM1.2整體上有相對(duì)較高的表達(dá)量;相較之下，F(xiàn)vREM1.3整體上表現(xiàn)為較低水平表達(dá)量，僅在第二時(shí)期瘦果種皮和葉片中較高表達(dá);FvREM1.4則是在特定時(shí)期的花藥和花柱中有較高表達(dá);FvREM2.1整體表達(dá)量不突出，但在根中有特異高表達(dá)。由此推測(cè)，不同F(xiàn)vREM家族基因可能參與調(diào)控不同的生物功能，而FvREM2.1在根中特異高表達(dá)，推測(cè)其可能在根中發(fā)揮著重要功能（圖4）。

2.4 ? 過(guò)表達(dá)FvREM2.1影響擬南芥pSUC2：GFP根系發(fā)育

侵染后代經(jīng)篩選獲19個(gè)獨(dú)立株系。在1/2 MS+

5 μM ES培養(yǎng)基上誘導(dǎo)T2代XVE：FvREM2.1株系過(guò)表達(dá)，T2代植株表現(xiàn)為明顯抑制根的生長(zhǎng)，與對(duì)照比較為顯著差異;并伴有向重性失衡（圖5）。

在激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)根部pSUC2：GFP的表達(dá)，其中過(guò)表達(dá)株系T2-5與T2-6株系誘導(dǎo)后表型最為明顯，pSUC2：GFP熒光被限制在中柱中，而對(duì)照中柱的熒光會(huì)擴(kuò)散到周圍皮層中（圖5）。在1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，無(wú)ES誘導(dǎo)的對(duì)照與轉(zhuǎn)基因株系無(wú)顯著差異。

3 ? 討論

本研究根據(jù)已報(bào)道的擬南芥REM基因家族信息，從PHYTOZOME上獲得FvREM家族基因序列，結(jié)合Kang和Darwish等文章中FvREM的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)該家族有較高的保守性，但不同的成員在不同的時(shí)空分布上表達(dá)量存在差異，推測(cè)該家族基因含有不同的功能。其中，F(xiàn)vREM2.1在根中特異表達(dá)，作為本研究的重點(diǎn)研究對(duì)象。

本研究中FvREM2.1在擬南芥中過(guò)表達(dá)，表現(xiàn)出明顯根的伸長(zhǎng)受抑制及向重性失衡;過(guò)表達(dá)FvREM2.1模擬了擬南芥受到生物脅迫從而響應(yīng)防御系統(tǒng)的過(guò)程，使得擬南芥根系熒光信號(hào)pSUC2：GFP被限制在中柱中，無(wú)法卸載到周圍皮層細(xì)胞，即胞間連絲的通透性受阻，表明FvREM2.1可能參與防御系統(tǒng)中胞間連絲的調(diào)控，從而影響了根系的發(fā)育，推測(cè)其在植物抗逆與生長(zhǎng)發(fā)育的平衡中有一定積極作用。

草莓的生產(chǎn)過(guò)程中容易受土傳病害、土壤養(yǎng)分失調(diào)等問(wèn)題的影響，阻礙根系的發(fā)育。同時(shí)，根系又是草莓營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的“庫(kù)”器官，地上部分合成的有機(jī)物不斷地向根運(yùn)輸，促進(jìn)良好的根系形態(tài)建成，對(duì)草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)FvREM2.1調(diào)控?cái)M南芥根中胞間連絲的通透性，影響了根系發(fā)育，揭示了FvREM2.1在草莓根系發(fā)育中參與胞間連絲的調(diào)控作用，促進(jìn)了對(duì)草莓根系防御系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制的了解，為改善草莓根際微生物域環(huán)境提供新的解決思路，對(duì)于培育具有良好根系結(jié)構(gòu)的草莓品種具有一定的借鑒意義。

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