柿葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

秦晶晶,錢慧琴,趙 媛,魏琬絜,袁鐵峰,魏 婧

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453200)

柿科植物柿(Diospyroskaki)在我國(guó)被廣泛種植,柿葉(Persimmon Leaves)為其干燥葉,具有活血止血、生津止渴等功效,是公認(rèn)的天然保健食品。研究表明,柿葉富含黃酮、三萜類、維生素類與微量元素等多種藥理活性物質(zhì)[1-4],具有抗氧化、抗癌、止血、殺菌、免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]。作為柿葉中最主要的活性成分之一的黃酮類化合物,在抗氧化、抗菌、抗衰老和調(diào)節(jié)血壓等方面具有顯著功能[7-10],具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。

目前,黃酮類化合物的提取方法主要有熱水提取、有機(jī)溶劑提取、超聲波和微波輔助提取以及酶解提取等[11]。Ji等[12]用正交法優(yōu)化柿葉總黃酮回流提取工藝及其抗氧化研究,王蘭等[13]用響應(yīng)面法優(yōu)化柿葉總黃酮提取工藝,但尚未有人探討正交和響應(yīng)面在確定最佳柿葉回流提取工藝中的優(yōu)劣。因此為獲得最佳柿葉黃酮回流提取工藝和充分開發(fā)利用柿葉中的生物活性成分[14-18],本研究以河南新鄉(xiāng)延津縣的柿葉作為研究對(duì)象,采用回流提取法在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,考察了乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)柿葉中總黃酮提取量的影響,并分別用正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面法優(yōu)化柿葉中總黃酮的提取工藝,找出最佳工藝的方法,并且在最佳工藝方法下對(duì)其清除DPPH自由基、羥自由基和超氧自由基清除的能力進(jìn)行初步研究,確定柿葉總黃酮抗氧化活性,以期為柿葉綜合利用和提取柿葉總黃酮作為天然食品抗氧化劑等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柿子葉 采自河南省延津縣豐莊鎮(zhèn)秦莊村,新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥學(xué)教研室鑒定為柿科植物柿(Diospyros kaki);蘆丁對(duì)照品 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào):100080-201408);1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH) 購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社(CAS:1898-66-4);95%乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等試劑均為分析純 購(gòu)于天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

電子分析天平 上海象平儀器儀表有限公司;SG-4054型數(shù)控精密恒溫水浴鍋 上海碩光電子科技有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;SHZ-3型循環(huán)水式真空泵 鄭州杜甫儀器廠;101-8型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 江蘇金壇市佳美儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柿葉總黃酮的提取 柿葉在60 ℃恒溫干燥箱中干燥6 h,烘至恒重,粉碎,過40目篩,得柿葉粉;稱取1.0 g柿葉粉置于圓底燒瓶中,在一定的提取溫度、乙醇液料比、乙醇濃度和提取時(shí)間的條件下進(jìn)行總黃酮的回流提取,然后將得到的提取液抽濾,用95%乙醇定容至25 mL容量瓶,備用。

1.2.2 總黃酮的測(cè)定

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁對(duì)照品25 mg,置于50 mL容量瓶中,加入少量95%乙醇溶解并定容至刻度,搖勻即得蘆丁對(duì)照品溶液(0.5 mg/mL)。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分別置于10 mL具塞試管中,各加水至5.0 mL,分別加入5%亞硝酸鈉0.6 mL,搖勻,放6 min,加入10%硝酸鋁0.6 mL,搖勻后放置6 min,加入4%NaOH 3.0 mL,加水至刻度,搖勻后放置15 min。于506 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A[9],以蘆丁濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸收度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=0.0113x+0.0171，R2=0.9998。

1.2.2.2 柿葉總黃酮的測(cè)定 準(zhǔn)確量取樣品溶液0.3 mL于10 mL比色管中,按照1.2.2.1中所述方法進(jìn)行操作,按下式計(jì)算黃酮提取量。

式中:W表示黃酮提取量,mg/g;c表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度,mg/mL;D表示溶液稀釋倍數(shù);m表示藥材取樣量,g。

1.2.3 單因素對(duì)黃酮提取量的影響 以乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間為要素因子,研究各因素對(duì)柿葉中總黃酮提取量的影響。

1.2.3.1 乙醇濃度 按1.2.1方法,固定料液比為1∶50 (g/mL),提取溫度為60 ℃,提取時(shí)間為60 min,考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)對(duì)柿葉總黃酮提取量的影響。

1.2.3.2 提取溫度 在上述優(yōu)化乙醇濃度的基礎(chǔ)上,固定乙醇濃度50%,料液比為1∶50 (g/mL),提取時(shí)間為60 min,考察提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對(duì)柿葉總黃酮提取量的影響。

1.2.3.3 料液比 在上述優(yōu)化乙醇濃度和提取溫度的基礎(chǔ)上,固定乙醇濃度50%,提取溫度為60 ℃,提取時(shí)間為60 min,考察料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL)對(duì)柿葉總黃酮提取量的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間 在上述優(yōu)化乙醇濃度、提取溫度和料液比的基礎(chǔ)上,固定乙醇濃度50%,提取溫度為60 ℃,料液比為1∶60 (g/mL),考察提取時(shí)間(40、60、80、100、120、140 min)對(duì)柿葉總黃酮提取量的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了獲得以乙醇作為溶劑,回流提取柿子葉總黃酮的最佳工藝條件,在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,以柿子葉總黃酮提取量為考察指標(biāo),進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn),具體因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)的因素與水平Table 1 The factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,按照Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以總黃酮提取量為響應(yīng)值,選取乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時(shí)間(D)四因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平見表2。

表2 因素水平編碼Table 2 Code of factors and levels

1.2.6 柿葉總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.6.1 柿葉總黃酮對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定 將正交試驗(yàn)(乙醇濃度為40%,提取溫度50 ℃,料液比為1∶50 (g/mL)和提取時(shí)間為120 min)得到的柿葉總黃酮濃縮液為原料液,并加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.002、0.006、0.008、0.010、0.014、0.016、0.03、0.05 mg/mL的樣品溶液。參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行DPPH自由基清除活性的測(cè)定,并以抗壞血酸作為參照比較效果,按以下公式計(jì)算清除率及IC50。

式中：A樣品為DPPH溶液+柿葉黃酮提取液的吸光度值;A空白為無水乙醇+柿葉黃酮提取液的吸光度值;A對(duì)照為DPPH溶液+無水乙醇的吸光度值。

1.2.6.2 柿葉總黃酮對(duì)羥自由基清除活性的測(cè)定 將最佳工藝條件下得到的柿葉總黃酮濃縮液加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.002、0.006、0.008、0.03、0.05、0.10、0.60、0.80 mg/mL的樣品溶液。參考文獻(xiàn)[18-20]進(jìn)行羥自由基清除活性測(cè)定,同時(shí)與抗壞血酸對(duì)比,按以下公式計(jì)算清除率及IC50。

式中：A樣品為2.00 mL 6 mmol/L FeSO4+2.0 mL 柿葉黃酮提取液+2.00 mL 6 mmol/L H2O2+2.00 mL 6 mmol/L水楊酸的吸光度值;A空白為2.00 mL 6 mmol/L FeSO4+2.0 mL 柿葉黃酮提取液+2.00 mL 6 mmol/L 蒸餾水+2.00 mL 6 mmol/L水楊酸的吸光度值;A對(duì)照為2.00 mL 6 mmol/L FeSO4+2.0 mL 蒸餾水+2.00 mL 6 mmol/L H2O2+2.00 mL 6 mmol/L水楊酸的吸光度值。

1.2.6.3 柿葉總黃酮對(duì)超氧自由基清除活性的測(cè)定 將最佳工藝條件下得到的黃酮濃縮液為原料液,并加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.03、0.06、0.12、0.14、0.20、0.24、0.26 mg/mL的樣品溶液。采用鄰苯三酚自氧化法,參考文獻(xiàn)[21-23]進(jìn)行超氧自由基清除活性測(cè)定并與抗壞血酸作比較,按以下公式計(jì)算清除率及IC50。

式中：A樣品為2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8)+1 mL柿葉黃酮提取液+0.2 mL經(jīng)37 ℃預(yù)熱過的7.0 mmol/L鄰苯三酚+加入0.1 mL 8.0 mol/L HCl的吸光度值;A空白為2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8)+1 mL蒸餾水+0.2 mL經(jīng)37 ℃預(yù)熱過的7.0 mmol/L鄰苯三酚+加入0.1 mL 8.0 mol/L HCl的吸光度值;A對(duì)照為2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8)+1 mL柿葉黃酮提取液+0.2 mL蒸餾水+加入0.1 mL 8.0 mol/L HCl的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPASS 20.0、Design-Expert 8.0.6、Microsoft Excel 2007進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同乙醇濃度對(duì)柿葉黃酮提取工藝的影響 由圖1可知,黃酮提取量隨乙醇濃度遞增呈先增加后減少的變化趨勢(shì),在乙醇濃度為50%時(shí),總黃酮的提取量達(dá)到最大值,為16.11 mg/g。這可能的原因是:一方面,根據(jù)相似相溶的原理,極性越接近,溶解度越大,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),溶劑的極性和黃酮的極性最為接近,另一方面當(dāng)乙醇濃度過高時(shí),一些醇溶性雜質(zhì)成分溶出量增加,反而導(dǎo)致黃酮類化合物的提取量下降。因此,選擇乙醇濃度40%～60%進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同乙醇濃度對(duì)柿葉黃酮提取量影響Fig.1 The effects of ethanol concentration on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.1.2 不同提取溫度對(duì)柿葉黃酮提取工藝的影響 由圖2可知,隨提取溫度的升高,柿葉黃酮提取量先升高后下降,在60 ℃時(shí),總黃酮的提取率達(dá)到最大值,為13.67 mg/g,可能是由于當(dāng)溫度升高時(shí),柿葉黃酮在乙醇溶液中溶解度升高,因而提取量增加,但是溫度過高時(shí),部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,會(huì)分解,從而導(dǎo)致黃酮提取量降低。因此,選擇50～70 ℃進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同溫度對(duì)柿葉黃酮提取工藝影響Fig.2 The effects of extraction temperature on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.1.3 不同料液比對(duì)柿葉黃酮提取工藝的影響 由圖3可知,隨著料液比的增加,黃酮提取量逐漸增大,當(dāng)料液比大于1∶60 (g/mL)之后,黃酮提取量增速平緩。其主要原因是當(dāng)料液比大于1∶60 (g/mL)后,黃酮大部分已經(jīng)溶出,其次,隨著提取液所占比例的進(jìn)一步增加,大量雜質(zhì)溶出,黃酮提取量緩慢降低,故提取量不再急劇增加。為節(jié)約提取成本,因此選擇料液比為1∶50～1∶70 (g/mL)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同料液比對(duì)柿葉黃酮提取工藝影響Fig.3 The effects of material-liquid ratio on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.1.4 不同提取時(shí)間對(duì)柿葉黃酮提取工藝的影響 由圖4可知,提取時(shí)間在40～100 min 內(nèi)總黃酮提取得量不斷增大,在提取時(shí)間100 min 時(shí),柿葉總黃酮的提取量接近最大值,為15.39 mg/g;當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,提取量不再明顯增大,其原因可能是黃酮類化合物基本達(dá)到飽和,不再明顯溶出。因此選擇提取時(shí)間80～120 min進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)柿葉黃酮提取工藝影響Fig.4 The effects of extraction time on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表3可知,R值越大,說明該因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大,影響柿子葉黃酮提取四個(gè)因素順序?yàn)榱弦罕?C)>提取溫度(B)>乙醇濃度(A)>提取時(shí)間(D)。方差分析表4顯示,乙醇濃度和料液比對(duì)黃酮提取量的影響存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而提取溫度對(duì)黃酮提取量的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。綜合考慮黃酮的最佳提取工藝條件組合為A1B1C1D3,即乙醇濃度為40%,提取溫度50 ℃,料液比為1∶50 (g/mL)和提取時(shí)間為120 min。根據(jù)最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),總黃酮平均提取量為18.11 mg/g,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.69%,總黃酮提取量較高,重現(xiàn)性較好,表明此提取工藝穩(wěn)定合理。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析Table 3 Visual analysis of orthogonal experiment results

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面回歸模型建立與分析 采用Box-Behnken的中心原理為依據(jù),以乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時(shí)間(D)為自變量,總黃酮提取量為因變量,采用四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Design-Expert 8.0.6建立數(shù)學(xué)回歸模型,確定柿葉最佳提取工藝條件,結(jié)果見表5。獲得回歸模型方程如下:Y=12.96+0.017A+0.85B-1.25C-0.069D-0.14AB+0.13AC+0.18AD+0.46BC-0.69BD-0.062CD-0.84A2-0.62B2-1.08C2+0.30D2,式中:Y為總黃酮提取量(mg/g)。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 5 Results and analysis of response surface experiment

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

由4個(gè)影響因素的F值大小可以得出,各因素對(duì)柿子葉總黃酮提取量的影響順序?yàn)?

料液比>提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間,料液比對(duì)柿子葉總黃酮提取量有較大影響。模型一次項(xiàng)D與交互項(xiàng)AB、AD、BC、BD、CD差異不顯著(P>0. 05),一次項(xiàng)A、并互項(xiàng)AC對(duì)柿子葉總黃酮提取量具有顯著影響(P<0.05),一次項(xiàng)B、C以及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)柿子葉總黃酮提取量均有極顯著的影響(P<0.01)。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 響應(yīng)曲面坡度越陡峭,說明響應(yīng)值對(duì)于該因素的改變?cè)矫舾?而曲面坡度越平滑,該因素的改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小,各因素交互作用對(duì)柿葉中總黃酮提取量影響的響應(yīng)曲面以及等高線如圖5所示。在有交互作用的影響下,乙醇濃度和料液比對(duì)柿葉總黃酮的提取的交互影響作用顯著,而提取時(shí)間和提取溫度、乙醇濃度和提取時(shí)間、乙醇濃度和提取溫度、料液比和提取溫度、料液比和提取時(shí)間交互影響作用不顯著,這與表6中交互項(xiàng)P值的分析一致。

圖5 各因素交互作用總黃酮提取量的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of total flavonoids

2.3.3 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證 通過軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行分析預(yù)測(cè),乙醇回流提取柿葉總黃酮的最佳提取工藝條件:乙醇濃度為47.63%,提取溫度為50.0 ℃,提取時(shí)間為120.0 min,料液比為 1∶65.97 (g/mL)。綜合考慮將其最佳工藝條件調(diào)整為乙醇濃度50%,提取溫度為50 ℃,提取時(shí)間為120 min,料液比為 1∶60 (g/mL),以此條件下對(duì)建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),獲得的柿葉總黃酮的實(shí)際測(cè)得值為(18.21±0.01) mg/g,預(yù)測(cè)值為18.12 mg/g,預(yù)測(cè)誤差為0.51%,小于3%,因此,證實(shí)了預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確可靠。

2.4 柿葉總黃酮體外抗氧化活性

2.4.1 柿葉總黃酮對(duì) DPPH·清除作用 不同濃度的柿葉總黃酮溶液、對(duì)照品抗壞血酸溶液對(duì)DPPH自由基清除率結(jié)果見圖6。在濃度0.002～0.05 mg/mL范圍內(nèi)其清除能力隨總黃酮濃度的升高而加強(qiáng),當(dāng)濃度增加為0.03 mg/mL,清除率達(dá)到91.47%,此后其清除率基本趨于平衡。根據(jù)SPSS20.0軟件數(shù)據(jù)分析,得到柿葉總黃酮IC50為8.0 μg/mL和抗壞血酸的IC50為11.0 μg/mL,可見,柿葉總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率明顯高于抗壞血酸。

圖6 不同濃度的柿葉和抗壞血酸 對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.6 DPPH· scavenging activities of VC and total flavonoids

2.4.2 柿葉總黃酮對(duì)·OH的清除作用 由圖7可知,在選定濃度0.002～0.6 mg/mL范圍內(nèi)其清除能力隨總黃酮濃度的提高而增強(qiáng),當(dāng)濃度增加到0.6 mg/mL,清除率達(dá)到91.18%,此后其清除率增加不明顯,基本趨于平衡。根據(jù)SPSS20.0軟件數(shù)據(jù)分析,得到柿葉總黃酮IC50=18.0 μg/mL和抗壞血酸的IC50=25.0 μg/mL,這說明在相同濃度下,柿葉總黃酮對(duì)·OH清除率比抗壞血酸略強(qiáng)。

圖7 不同濃度的柿葉總黃酮和抗壞血酸對(duì)·OH的清除率Fig.7 ·OH scavenging activities of ascorbic acid and total flavonoids

圖8 不同濃度的柿葉總黃酮和抗壞血酸對(duì) 的清除率 scavenging activities of ascorbic acid and total flavonoids

3 結(jié)論

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最佳提取工藝為:乙醇濃度為40%,提取溫度50 ℃,料液比為1∶50 (g/mL)和提取時(shí)間為120 min,總黃酮提取量為18.11 mg/g。響應(yīng)面法的最佳提取工藝為:乙醇濃度為50%,提取溫度50 ℃,料液比為1∶60 (g/mL)和提取時(shí)間為120 min,總黃酮提取量為18.21 mg/g。響應(yīng)面法總黃酮提取量比正交試驗(yàn)法提高了0.55%。兩種方法得到的結(jié)論也是基本一致的:料液比對(duì)總黃酮含量影響顯著,各因素對(duì)總黃酮含量的影響順序?yàn)榱弦罕?提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間,而且兩法所得最佳工藝參數(shù)中,提取溫度和時(shí)間一致,正交試驗(yàn)法所得乙醇濃度(40%)和料液比(1∶50 g/mL)低于響應(yīng)面法的乙醇濃度(50%)和料液比(1∶60 g/mL),從經(jīng)濟(jì)角度考慮,低乙醇濃度和低料液比能節(jié)約成本和能耗,而兩者提取率幾乎沒有差別。因此,正交試驗(yàn)法更適合柿葉總黃酮提取工藝。

體外抗氧化活性研究表明,柿葉總黃酮對(duì)DPPH·、羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為:8.0、18.0、76.0 μg/mL,具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性,為其在食品、藥品等領(lǐng)域開發(fā)天然抗氧化劑提供一定的理論依據(jù)。