寧詩文,崔珊珊,尚宏麗

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001)

生物活性肽是對(duì)人體特定生理具有調(diào)節(jié)功能的多功能化合物總稱[1]。生物活性肽中抗氧化肽具有清除體內(nèi)自由基、提高免疫力等生理功能特性。其重要來源為植物源和動(dòng)物源兩類物質(zhì)。海洋生物蛋白不但資源豐富而且優(yōu)質(zhì),是生物活性肽重要來源之一。

大黃花魚是我國主要經(jīng)濟(jì)魚類[2]。大黃花魚體色金黃,肉質(zhì)鮮嫩,其優(yōu)質(zhì)蛋白含量高達(dá)7.6%,是宴席佳肴中的上品。大黃花魚肉蛋白是酶解制備安全性高、價(jià)格低廉生物活性肽的優(yōu)質(zhì)原料。目前在我國,大黃花魚以鮮食為主[3],產(chǎn)品的附加值低,蛋白利用率相對(duì)較低,這嚴(yán)重限制了大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,產(chǎn)量受到了一定影響,所以開展大黃花魚肉蛋白精深加工和高附加值的生物活性肽生產(chǎn)尤為必要。近年來,有報(bào)道從鯉魚[4]、金槍魚[5]、羅非魚[6]、鰱魚[7]等多種水產(chǎn)品中水解制備抗氧化肽,但是對(duì)抗氧化肽進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析和抗氧化功能同步研究很少。魚蛋白制備抗氧化肽,蛋白類成分在水解過程中,其分子量大小、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性等品質(zhì)和功效都可能受到一定影響,以往研究中魚蛋白制備抗氧化肽未見相關(guān)報(bào)道。因此本研究從四種蛋白酶中,篩選出最佳蛋白酶,通過響應(yīng)面法優(yōu)化大黃花酶解工藝,同時(shí)對(duì)酶解產(chǎn)物利用SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定分析,并研究其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性,旨在對(duì)大黃花魚肉蛋白水解物制備天然安全抗氧化肽以及蛋白成分分析提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)也為大黃花魚肉的高附加值開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃花魚 錦州市海鮮批發(fā)市場;堿性蛋白酶(20萬U·g-1)、木瓜蛋白酶(10萬U·g-1)、胃蛋白酶(1萬U·mg-1)、中性蛋白酶(2萬U·g-1) 浙江一諾生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,為AR) 天津永大化工試劑有限公司;鄰二氮菲、無水乙醇、三氯乙酸(TCA)、氯化鉀(為AR) 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;冰乙酸、甲醇(均為AR) 沈陽試劑廠;重蒸水、三蒸水 實(shí)驗(yàn)室自制。

FA1004電子天平 力辰科技;320型pH計(jì) 深圳市怡華新電子有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司;80-2高速離心機(jī) 江蘇省金壇新瑞儀器制造有限公司;752型紫外分光光度計(jì) 上海恒平儀器有限公司;164-5050電泳儀 美國伯樂Bio-Rad。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大黃花魚肉蛋白酶解工藝 將新鮮的大黃花魚去鱗、去皮、洗凈瀝干,取魚肉,絞肉機(jī)絞碎成肉漿[8]。根據(jù)酶的最適pH配制磷酸鹽緩沖液,放置于冰箱4 ℃冷藏,將冰磷酸鹽溶液加入到魚糜漿中,形成固液比為1∶2 (m/v)的大黃花魚魚肉蛋白懸浮液,加入一定量的蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng),調(diào)節(jié)恒溫振蕩水浴鍋在一定的溫度。酶解一定時(shí)間后,放置在90 ℃水浴10 min使酶失活,4000 r/min離心10 min,取上清液到EP管中待用[9],所得上清液即酶解液。

表1 酶解作用條件Table 1 Conditions of enzymatic hydrolysis

1.2.3.1 酶用量對(duì)大黃花魚肉蛋白酶解效果的影響 稱取25 g魚糜,按1.2.1節(jié)的方法進(jìn)行酶解。按照酶用量為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%分別加入到大黃花魚肉蛋白懸浮液中,在pH7.0、酶解溫度40 ℃、底物濃度20%、酶解時(shí)間6 h的條件下酶解。

1.2.3.2 酶解溫度對(duì)大黃花魚肉蛋白酶解效果的影響 稱取25 g魚糜,按1.2.1節(jié)的方法進(jìn)行酶解。將酶解溫度控制在40、45、50、55、60、65、70 ℃,在pH7.0、底物濃度20%、酶用量0.5%、酶解時(shí)間6 h的條件下酶解。

1.2.3.3 底物濃度對(duì)大黃花魚肉蛋白酶解效果的影響 稱取25 g魚糜,按1.2.1節(jié)的方法進(jìn)行酶解。將底物濃度控制在5%、10%、15%、20%、25%、30%,在pH7.0、酶用量0.5%、酶解時(shí)間6 h、酶解溫度40 ℃的條件下酶解。

1.2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)大黃花魚肉蛋白酶解效果的影響 稱取25 g魚糜,按1.2.1節(jié)的方法進(jìn)行酶解。在酶解時(shí)間0～10 h之間,pH7.0、底物濃度20%、酶用量0.5%、酶解溫度40 ℃的條件下,每1 h取樣一次。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化酶解法工藝條件 選擇酶解時(shí)間、酶解溫度和底物濃度為三個(gè)自變量,以蛋白酶解液的還原力為響應(yīng)值,對(duì)酶解法大黃花魚肉蛋白工藝條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平編碼如表2所示[11]。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素及水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels of response surface test

1.2.5 大黃花魚肉蛋白酶解液指標(biāo)測定

1.2.5.1 酶解液DH的測定 計(jì)算公式如下:

總氮量和游離氨基氮兩指標(biāo)測定分別采用GB 5009.5-2010凱氏定氮法[12]和GB/T 5009.39-2003甲醛滴定法[13]進(jìn)行測定。

1.2.5.3 酶解液還原力分光光度法測定 實(shí)驗(yàn)分別配制0.2 mol/L,pH6.6磷酸鹽緩沖液、1%鐵氰化鉀溶液;10%三氯乙酸溶液;0.1%的三氯化鐵溶液。各取2.0 mL磷酸鹽緩沖液、酶解液和鐵氰化鉀溶液混勻,50 ℃水浴反應(yīng)20 min,然后加入2 mL 10%(w/v)三氯乙酸(TCA)溶液,混合均勻后以3000 r/min離心10 min后,取上清液1.0 mL,分別加入1.0 mL蒸餾水、0.5 mL三氯化鐵溶液,室溫下反應(yīng)靜置10 min,在700 nm處測定吸光值。以2.0 mL蒸餾水代替酶解液作為空白對(duì)照[15]。酶解液的吸光值越高,表示酶解液的還原力越強(qiáng)。

1.2.6 大黃花魚肉蛋白酶解液SDS-PAGE分析 按1.2.1中酶解液的處理方法在優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝下酶解。將酶解液與2×loading buffer 1∶1混合后置于1.5 mL離心管中,點(diǎn)樣前沸水浴煮沸4 min。按照SDS不連續(xù)電泳法,用10%分離凝膠和5%濃縮凝膠進(jìn)行試驗(yàn),上樣量為20 μL[16]。

1.2.7 大黃花魚肉蛋白多肽的超濾分離及其分離組分體外抗氧化性測定

1.2.7.1 多肽的超濾分離 將上述最優(yōu)工藝方法制備所得的大黃花魚肉蛋白多肽經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,并采用超濾膜超濾分離,截留的分子量為30、10、5 kDa。得到四個(gè)不同分子量組分為:YCP-Ⅰ(<5 kDa,Yellow Croaker Protein的縮寫)、YCP-Ⅱ(5～10 kDa)、YCP-Ⅲ(10～30 kDa)、YCP-Ⅳ(>30 kDa),進(jìn)行冷凍干燥。用蒸餾水分別配制濃度為5、10、15、20 mg/mL的多肽溶液,分別測定各組分DPPH自由基清除能力、還原力以及Cu2+的金屬螯合能力。

1.2.7.2 自由基清除能力(DPPH·)的測定 將2 mL 0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液與1 mL最優(yōu)工藝下的酶解液混合,將混合物在室溫下黑暗放置30 min,再于3500 r/min離心10 min,空白組用乙醇代替DPPH,對(duì)照組用蒸餾水代替樣品[17],波長517 nm的吸光度讀數(shù)為A1。

式中:A1是酶解液的吸光度;A2是空白組的吸光度;A3是對(duì)照組的吸光度。

1.2.7.3 還原力的測定 試驗(yàn)方法同1.2.5.3。

1.2.7.4 金屬Cu2+螯合能力的測定 選取鄰苯二酚紫(PV)作為對(duì)Cu2+進(jìn)行螯合反應(yīng)時(shí)的指示劑。取2 mmol/L CuSO4溶液l mL、1 mL 10%吡啶與20 μL 10% PV制成混合物,再加入1 mL大黃花魚魚肉蛋白酶解液,待溶液藍(lán)色消失,在632 nm波長處測定吸光度值[18]。用蒸餾水代替樣品為空白組。以螯合能力表示,計(jì)算公式為:

式中:A1為樣品酶解液的吸光度;A2為空白組的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理選用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA),P<0.05為差異性顯著。所有指標(biāo)檢測均測定三次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適用酶的篩選結(jié)果

圖1 四種蛋白酶對(duì)蛋白DH、酶解液 還原力以及清除力的影響Fig.1 Effects of four proteases on DH,reductive power of enzymatic hydrolysate and scavenging power

2.2 中性蛋白酶單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 酶用量對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Effect of enzyme dose on enzymatic hydrolysis

2.2.2 酶解溫度對(duì)大黃花魚肉蛋白酶解效果的響 溫度對(duì)酶的催化反應(yīng)有很大影響,酶的較高催化活性只能維持在一定的溫度范圍內(nèi)[22]。由圖3可知,酶解溫度在45 ℃時(shí),三種指標(biāo)出現(xiàn)最高值。在酶解溫度60 ℃后,三個(gè)指標(biāo)顯著下降(P<0.05),說明酶的構(gòu)象已經(jīng)發(fā)生變化,酶活性降低導(dǎo)致與底物的反應(yīng)效率降低。因此,選擇45 ℃為適宜的酶解溫度。

圖3 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis effect

圖4 底物濃度對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on hydrolysis effect

圖5 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis effect

2.3 響應(yīng)面對(duì)酶解工藝的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 方差和回歸分析 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental designs and results for response surface analysis

使用Design-Expert響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件,對(duì)因素和水平進(jìn)行設(shè)計(jì)后,測定所有設(shè)定組響應(yīng)值,擬合和優(yōu)化出以響應(yīng)值為函數(shù)的二次多元回歸方程為:

Y=0.92+0.041A-0.017B+0.088C-0.027AB+0.063AC-6.750×10-3BC-0.089A2-0.031B2-0.11C2

許多研究表明,抗氧化劑的活性與其還原力呈正相關(guān),因此常通過測定物質(zhì)的還原力評(píng)估其潛在的抗氧化活性[24]。方程中,Y表示還原力預(yù)測值,A表示酶解時(shí)間編碼值、B表示酶解溫度編碼值、C表示底物濃度編碼值。

從表4的方差分析可以看出:模型的P<0.0001,說明以還原力建立的回歸模型的顯著性表現(xiàn)為極顯著;失擬項(xiàng)(P=0.2954)不顯著,說明回歸方程擬合程度較高;調(diào)整回歸系數(shù)R2=0.9868,表明回歸方程模型建立合理;一次項(xiàng)A、C對(duì)還原力的影響極顯著(P<0.01),B表現(xiàn)為顯著(P<0.05);在交互作用中,AC表現(xiàn)為極顯著(P<0.01),AB表現(xiàn)為顯著(P<0.05);二次項(xiàng)A2、C2表現(xiàn)為極顯著(P<0.01),B2表現(xiàn)為顯著(P<0.05),綜上所述,利用該模型來測酶解的時(shí)間、溫度和底物濃度對(duì)還原力的影響是可行的。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

2.3.2 響應(yīng)面圖譜分析 三維圖譜和等高線圖能夠更加直觀地研究交互因素間的相互作用情況。繪制出響應(yīng)面交互作用曲線圖如圖6～圖8。

圖6 酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)酶解液還原力影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of influence of hydrolysis time and hydrolysis temperature on reducing ability

圖7 酶解時(shí)間和底物濃度對(duì)酶解液還原力影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of influence of hydrolysis time and substrate concentration on reducing ability

圖8 酶解溫度和底物濃度對(duì)酶解液還原力影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.8 Respouse surface plot and contour diagram of the effect of enzymatic hydrolysis temperature and substrate concentration on the reducing power of enzymatic hydrolysis solution

從圖6中可以看出,等高線呈橢圓型,表明酶解溫度與酶解時(shí)間兩者交互作用顯著。當(dāng)酶解時(shí)間小于5 h時(shí),等高線密集,表明酶解時(shí)間對(duì)還原能力影響顯著(P<0.05);酶解時(shí)間曲線在6～7 h較為平穩(wěn),此時(shí)等高線稀疏,說明隨著酶解時(shí)間的不斷增加,影響還原力的值越來越小。

由圖7可以看出,隨著3D圖變化趨勢的劇烈增加,其顏色加深坡度變陡[25],表明酶解時(shí)間與底物濃度的交互作用顯著(P<0.05)。酶解時(shí)間和底物濃度在0水平時(shí),酶解液的還原力為較大值,并且保持不變;當(dāng)酶水解時(shí)間和底物濃度低于0水平時(shí),酶解液的還原能力隨著兩者的增加而增加,且上升趨勢明顯。

從圖8可以看出,等高線在底物濃度大于20%時(shí)稀疏,而酶解溫度在45 ℃左右的等高線密度平均,根據(jù)回歸方程中交互項(xiàng)呈現(xiàn)顯著性的情況,綜合分析,二者與還原力的交互作用不明顯。

2.4 大黃花魚肉蛋白酶解液SDS-PAGE分析

大黃花魚肉中蛋白質(zhì)主要由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白構(gòu)成的肌原纖維蛋白組成[26]。大黃花魚肉蛋白酶解液SDS-PAGE分析圖如圖9所示,圖中各條泳道分別顯示未酶解的魚肉蛋白與加了中性蛋白酶處理后的魚肉蛋白在1、3、5、7 h的蛋白分子量變化情況。泳道1為未酶解魚肉全蛋白,其中肌原纖維蛋白中肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白分布在14～98 kDa之間,其中肌動(dòng)蛋白約在42 kDa處、原肌球蛋白約在70 kDa處、肌球蛋白輕鏈分布在28 kDa之下,與李強(qiáng)等[27]報(bào)道魚肉蛋白分子分布相似。酶解1 h,泳道2中蛋白分布與對(duì)照組全蛋白無明顯變化,這說明大黃花魚肌原纖維蛋白穩(wěn)定性較好。酶解3和5 h后,泳道3和4中肌動(dòng)蛋白部分亞基條帶消失,表明大分子蛋白在酶水解過程中逐漸被水解成小分子蛋白,而酶解7 h后,泳道5中肌動(dòng)蛋白部分完全消失,新增了一條約15 kDa蛋白條帶和一條約6 kDa蛋白條帶,原肌球蛋白水解為原肌球蛋白輕鏈分子量約27 kDa蛋白條帶,這也說明大黃花魚肌動(dòng)蛋白酶解變性較肌球蛋白酶解變性快速。因此,隨著時(shí)間增長,中性蛋白酶能夠有效酶解大黃花魚肉蛋白。

圖9 SDS-PAGE電泳圖Fig.9 SDS-PAGE electrophoresis figure注:M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1-未酶解魚肉全蛋白; 2-酶解1 h的魚肉蛋白;3-酶解3 h的魚肉蛋白; 4-酶解5 h的魚肉蛋白;5-酶解7 h的魚肉蛋白。

2.5 四個(gè)分離組分多肽的體外抗氧化活性

2.5.1 各組分多肽的DPPH·清除力 各組分多肽的DPPH·清除力如圖10所示。各組分多肽均表現(xiàn)出一定的清除DPPH·能力,且都隨著多肽濃度的增加而顯著升高(P<0.05)。DPPH·清除力決定其抗氧化能力,且值越大表明該肽段的抗氧化能力越強(qiáng)[28]。分子量越小的肽段表現(xiàn)出的抗氧化能力越強(qiáng)。當(dāng)多肽濃度為20 mg/mL時(shí),YCP-Ⅰ(<5 kDa)其DPPH·清除力達(dá)到85.11%。

圖10 四個(gè)不同分子量組分多肽的DPPH·清除力Fig.10 DPPH· scavenging power of four peptides with different molecular weight components

2.5.2 各組分多肽的還原力 由圖11可知,各組分的還原力都隨多肽濃度的增加而顯著升高(P<0.05),且都具有一定的還原力。當(dāng)多肽濃度為20 mg/mL時(shí),YCP-Ⅰ(<5 kDa)的還原力為0.875,YCP-Ⅳ(>30 kDa)的還原力為0.371,說明分子量越小的肽段表現(xiàn)出的還原力越強(qiáng)。

圖11 四個(gè)不同分子量組分多肽的還原力Fig.11 Reduction force of four peptides with different molecular weight components

2.5.3 各組分多肽鰲合Cu2+能力 由圖12可知,隨著多肽濃度的增大,各組分對(duì)Cu2+均有一定的螯合作用。這可能是由于對(duì)其起作用的組成肽協(xié)同效應(yīng)的活動(dòng)結(jié)果[29]。但是隨著多肽濃度的增加,在5～10 mg/mL時(shí)各組分對(duì)Cu2+的螯合能力逐漸增強(qiáng),在10～20 mg/mL之間鰲合能力增加不明顯。這可能是因?yàn)?肽的裂解可以增強(qiáng)與金屬離子的結(jié)合,因?yàn)樗嵝院蛪A性氨基酸的分支中羧基和氨基的濃度增加,從而從系統(tǒng)中去除預(yù)氧化金屬離子。綜合上述結(jié)果,多肽的抗氧化能力與其分子量密切相關(guān),且分子量小的抗氧化活性高。

圖12 四個(gè)不同分子量組分多肽鰲合Cu2+能力Fig.12 Cu2+binding ability of four polypeptides with different molecular weight components

3 結(jié)論