膽管癌中轉(zhuǎn)錄因子EB和自噬相關(guān)蛋白Beclin 1的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

阮 萍，何婷婷，彭忠異，姚 平

膽管癌的手術(shù)治療切除率低，缺乏有效的輔助化療藥物，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高[1]。尋找標(biāo)志性致癌分子，深入探討膽管癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，是提高膽管癌治療效果和預(yù)后的關(guān)鍵所在。細(xì)胞自噬(autophagy)對(duì)于腫瘤來(lái)說(shuō)是一柄雙刃劍[2]。轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB, TFEB)可通過(guò)調(diào)節(jié)從自噬小體形成到降解的整個(gè)過(guò)程中各種相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)自噬水平[3]。但關(guān)于TFEB在膽管癌中與自噬關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)TFEB和自噬相關(guān)蛋白Beclin 1在膽管癌中的表達(dá)，探討TFEB和Beclin 1作為膽管癌預(yù)后指標(biāo)的可能性。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2011年1月～2017年12月廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院手術(shù)切除并確診的75例膽管癌手術(shù)標(biāo)本(其中肝內(nèi)膽管癌24例、肝外膽管癌51例)。同時(shí)收集所有病例完整的臨床資料與隨訪信息，患者術(shù)前均未行放、化療及生物治療。隨訪截至2018年1月。手術(shù)日期至復(fù)發(fā)日期或末次隨訪日期為無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間，手術(shù)日期至死亡日期或末次隨訪日期為總生存時(shí)間。肝內(nèi)膽管癌隨機(jī)選取同期手術(shù)切除的20例肝細(xì)胞癌(無(wú)病毒性肝炎感染史、肝硬化病變及膽道結(jié)石病史)的癌旁正常膽管作對(duì)照分析，肝外膽管癌隨機(jī)選取同期手術(shù)切除的20例經(jīng)病理學(xué)證實(shí)未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的陰性切緣標(biāo)本作為對(duì)照分析。本組所有組織標(biāo)本的獲取均取得患者知情同意，簽訂由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的患者知情同意書。

1.2 主要試劑兔抗人TFEB和Beclin 1多克隆抗體為美國(guó)Novus公司產(chǎn)品、PV 9000兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒及濃縮型DAB染色試劑盒均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品，其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋。切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇至水化；按抗體說(shuō)明書進(jìn)行檸檬酸鹽或EDTA高溫高壓修復(fù)；3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加適當(dāng)濃度的一抗工作液，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；按試劑盒說(shuō)明書EnVision兩步法滴加二抗；滴加DAB顯色。對(duì)照設(shè)計(jì)：每批染色分別用一抗說(shuō)明書建議的組織切片作陽(yáng)性對(duì)照；以非免疫正常兔血清代替一抗作為陰性對(duì)照；空白對(duì)照以PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判定Beclin 1以胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性，TFEB以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400×)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占5%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加作為最終結(jié)果：>4分為高表達(dá)，≤4分為低表達(dá)[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的描述采用率或構(gòu)成比。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線及總生存曲線，Log-rank法對(duì)組間生存率進(jìn)行比較。初步篩選無(wú)復(fù)發(fā)生存率和總體生存率的影響因素。將各臨床病理因素納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，確定預(yù)后影響因素。Beclin 1和TFEB的表達(dá)相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽管癌中TFEB及Beclin 1表達(dá)TFEB蛋白表達(dá)主要定位于膽管癌組織與癌旁正常膽管上皮細(xì)胞的胞核。在肝內(nèi)膽管癌中TFEB蛋白高表達(dá)12例(50.00%)，癌旁正常膽管上皮高表達(dá)2例(10.00%)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.046，P=0.005)。在肝外膽管癌中TFEB蛋白高表達(dá)24例(47.06%)，癌旁正常膽管上皮高表達(dá)1例(5.00%)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.14，P=0.001，圖1A、B)。

Beclin 1蛋白主要定位于膽管癌組織與癌旁正常膽管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)。在肝內(nèi)膽管癌中Beclin 1蛋白高表達(dá)10例(41.27%)，癌旁正常膽管上皮高表達(dá)4例(20.00%)，兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.361，P=0.124)。在肝外膽管癌中Beclin 1蛋白高表達(dá)24例(47.06%)，癌旁正常膽管上皮高表達(dá)2例(10.00%)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.824，P<0.001，圖1C、D)。

ABCD

在12例TFEB高表達(dá)肝內(nèi)膽管癌中，Beclin 1高表達(dá)4例；12例TFEB低表達(dá)肝內(nèi)膽管癌中，Beclin 1低表達(dá)6例。24例TFEB高表達(dá)肝外膽管癌中，Beclin 1高表達(dá)2例；27例TFEB低表達(dá)肝外膽管癌中，Beclin 1低表達(dá)5例。通過(guò)Spearman相關(guān)性分析表明，肝內(nèi)及肝外膽管癌中TFEB及Beclin 1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其中肝外膽管癌中TFEB及Beclin 1的負(fù)相關(guān)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=-0.731，P<0.001)。

2.2 膽管癌中TFEB及Beclin 1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系75例膽管癌中，TFEB表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及AJCC分期呈正相關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、性別、解剖部位及分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05)；Beclin 1表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及AJCC分期呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05，表1)。

2.3 膽管癌中TFEB及Beclin 1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系75例膽管癌患者中位隨訪時(shí)間18.32個(gè)月，52例死亡，死亡原因均為腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、病情進(jìn)展導(dǎo)致的多器官衰竭，無(wú)其他死亡原因。肝內(nèi)膽管癌TFEB低表達(dá)組中位無(wú)復(fù)發(fā)生存期(6.53個(gè)月)及中位總生存期(21.80個(gè)月)均比高表達(dá)組長(zhǎng)(3.40、6.17個(gè)月)，高、低表達(dá)組中位總生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.937，P=0.026)。肝外膽管癌TFEB低表達(dá)組中位無(wú)復(fù)發(fā)生存期(23.10個(gè)月)及中位總生存期(36.77個(gè)月)均比高表達(dá)組長(zhǎng)(6.33、11.70個(gè)月)，高、低表達(dá)組的中位無(wú)復(fù)發(fā)生存期及中位總生存期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.278，P<0.001；χ2=12.955，P<0.001)。

表1 膽管癌中TFEB及Beclin 1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

肝內(nèi)膽管癌中Beclin 1高表達(dá)組中位無(wú)復(fù)發(fā)生存期(41.37個(gè)月)及中位總生存期(43.47個(gè)月)均比低表達(dá)組長(zhǎng)(4.33、6.10個(gè)月)，中位無(wú)復(fù)發(fā)生存期及中位總生存期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.816，P=0.001；χ2=17.072，P<0.001)。肝外膽管癌中Beclin 1高表達(dá)組中位無(wú)復(fù)發(fā)生存期(36.23個(gè)月)及中位總生存期(38.77個(gè)月)均比低表達(dá)組長(zhǎng)(4.97、9.93個(gè)月)，中位無(wú)復(fù)發(fā)生存期及中位總生存期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.237，P<0.001；χ2=18.516，P<0.001，圖2)。

單因素分析顯示，膽管癌的無(wú)復(fù)發(fā)生存期及總生存期與患者年齡、解剖部位、腫瘤大小、血管侵犯、AJCC分期、TFEB及Beclin 1表達(dá)等因素有關(guān)(P均<0.05，表2)。將上述單因素分析差異具有顯著性的指標(biāo)納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，分別對(duì)無(wú)復(fù)發(fā)生存期和總生存期進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，TFEB及Beclin 1表達(dá)均是影響肝內(nèi)、肝外膽管癌患者術(shù)后總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期的顯著性因素，TFEB是不良預(yù)后因素，而Beclin 1是保護(hù)因素。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響肝內(nèi)膽管癌患者術(shù)后總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期的顯著性不良預(yù)后因素，血管侵犯是影響肝內(nèi)膽管癌患者術(shù)后總生存期的顯著性不良預(yù)后因素(P=0.045)。AJCC分期是影響肝外膽管癌患者術(shù)后總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期的顯著性不良預(yù)后因素(P均<0.05，表3、4)。

3 討論

膽管癌是一種起源于膽管上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率占胃腸道系統(tǒng)所有惡性腫瘤的3%[5]。我國(guó)膽管癌的發(fā)病率普遍高于世界平均水平，上海市膽道癌研究協(xié)作組1997～2001年進(jìn)行的流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，上海35～74歲市民膽管癌的發(fā)病率為0.58/10萬(wàn)人，低于泰國(guó)的96.00/10萬(wàn)人，高于澳大利亞的0.20/10萬(wàn)人[6]。膽管癌發(fā)病隱匿，惡性程度高，晚期膽管癌的5年生存率為5%～15%[1]。手術(shù)治療是膽管癌的首選方案，但手術(shù)治療切除率較低，且膽管癌高度促結(jié)締組織增生的能力、多樣的腫瘤微環(huán)境及高度的異質(zhì)性決定了其易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[1]，目前尚無(wú)針對(duì)膽管癌十分有效的靶向治療藥物，因此深入研究膽管癌的發(fā)病機(jī)制，從而更為有效地治療膽管癌，提高患者預(yù)后是目前研究的重中之重。

圖2 膽管癌中TFEB及Beclin 1與患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期和總生存期的關(guān)系：A.TFEB表達(dá)與無(wú)復(fù)發(fā)生存期的關(guān)系；B.TFEB表達(dá)與總生存期的關(guān)系；C.Beclin 1表達(dá)與無(wú)復(fù)發(fā)生存期的關(guān)系；D.Beclin 1表達(dá)與總生存期的關(guān)系

表2 膽管癌患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存期及總生存期的單因素分析

自噬是細(xì)胞在各種代謝壓力下(如能量缺乏、饑餓等)的一種促使胞內(nèi)代謝廢物降解的生物學(xué)行為，是真核細(xì)胞進(jìn)行自我消化從而獲得存活機(jī)會(huì)的一種高度保守生物學(xué)過(guò)程。研究證實(shí)，自噬在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展、血管生成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥等方面有著重要影響，在膽管癌發(fā)展的最初階段表現(xiàn)為自噬的抑制，而在腫瘤發(fā)展及侵襲的過(guò)程中自噬標(biāo)記的蛋白表達(dá)增加[7]。在過(guò)去幾十年，自噬的研究主要集中在其起始階段，近年來(lái)的研究逐漸集中在溶酶體(lysosome)上。TFEB蛋白屬于基本螺旋環(huán)螺旋亮氨酸拉鏈(basic helix-loop-helix-leucine-zipper, bHLH-LZ)類轉(zhuǎn)錄因子中MiT家族成員，通過(guò)調(diào)控溶酶體途徑及細(xì)胞自噬在不少腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[8]。TFEB入核后，主要通過(guò)兩種分子作用機(jī)制發(fā)揮自噬轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用：(1)通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活多種自噬相關(guān)分子的表達(dá)，使細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)；(2)通過(guò)結(jié)合靶分子的E-box結(jié)合元件，轉(zhuǎn)錄激活溶酶體通路相關(guān)分子，尤其是溶酶體膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1, LAMP 1)的表達(dá)，促進(jìn)溶酶體外排。這種機(jī)制能夠顯著增強(qiáng)溶酶體的合成與外排，被稱為協(xié)同溶酶體表達(dá)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(coordinated lysosomal expression and regulation network, CLEAR network)[9]。許多研究提示，腫瘤發(fā)生過(guò)程中TFEB的表達(dá)和活性會(huì)發(fā)生改變，如腎細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌、惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肺小細(xì)胞癌及乳腺癌等[10-11]。那么TFEB在膽管癌發(fā)病過(guò)程中扮演著何種角色？是否參與了膽管癌細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)，與膽管癌的病程發(fā)展及侵襲性、復(fù)發(fā)等生物學(xué)行為關(guān)系如何？至今國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，肝內(nèi)、外膽管癌的TFEB均出現(xiàn)過(guò)表達(dá)。且膽管癌中TFEB高表達(dá)與腫瘤的惡性進(jìn)展和患者的預(yù)后不良有關(guān)。TFEB高表達(dá)組患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期及中位總生存期低于低表達(dá)組，且在TFEB高表達(dá)組中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管侵犯更多見(jiàn)。這與Liang等[12]在結(jié)腸癌的發(fā)現(xiàn)一致，敲除結(jié)直腸癌細(xì)胞的TFEB基因能阻止腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散。這可能與沉默TFEB后，腫瘤細(xì)胞相互間黏附能力增強(qiáng)，而侵襲力降低有關(guān)[13]。

表3 肝內(nèi)膽管癌患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存期及總生存期的多因素分析

表4 肝外膽管癌患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存期及總生存期的多因素分析

在已發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)蛋白中，Beclin 1是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物中參與自噬的特異性基因，其在自噬泡形成過(guò)程中起重要作用。Sasaki等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤性大膽管上皮細(xì)胞相比，膽管上皮內(nèi)瘤變、膽管內(nèi)乳頭狀瘤等系列癌前病變及膽管浸潤(rùn)性癌細(xì)胞中的LC3、Beclin 1及p62表達(dá)均有顯著增高，提示自噬參與膽管癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)在探討膽管癌中Beclin 1與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系時(shí)，卻呈現(xiàn)與前述研究相反的結(jié)果。Beclin 1高表達(dá)組的患者往往呈現(xiàn)小體積腫瘤、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管侵犯、低級(jí)別的AJCC分期等，提示Beclin 1高表達(dá)組患者有更長(zhǎng)的生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期，這與Dong等[15-16]的研究結(jié)果相一致。提示Beclin 1不僅可能成為膽管癌預(yù)后良好的預(yù)示指標(biāo)，可能為膽管癌治療方案的確定提供潛在的臨床應(yīng)用。另一方面，Zhang等[17]研究證實(shí)，Beclin 1過(guò)表達(dá)不僅可通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-15和HCT-116細(xì)胞增殖下降、細(xì)胞周期紊亂、吞噬增加和凋亡來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且還可減少結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和片狀脂膜的形成從而抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)中Beclin 1低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管侵犯具有相關(guān)性，同樣提示Beclin 1表達(dá)缺失可能是腫瘤侵襲性生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。有趣的是，在Beclin 1低表達(dá)患者的分層生存分析中，肝內(nèi)膽管癌患者的總體生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期均少于肝外膽管癌，這可能提示自噬對(duì)肝內(nèi)膽管癌這一亞群的影響更大，該亞群自噬水平的下調(diào)與較差預(yù)后相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)也揭示，肝內(nèi)、外膽管癌中TFEB及Beclin 1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其中樣本例數(shù)較多的肝外膽管癌中兩者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。這提示Beclin 1低表達(dá)可能與TFEB高表達(dá)相關(guān)，TFEB通過(guò)抑制Beclin 1表達(dá)，從而調(diào)節(jié)自噬，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這兩個(gè)指標(biāo)相結(jié)合，可作為膽管癌的預(yù)后因素和潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，TFEB可能通過(guò)下調(diào)Beclin 1表達(dá)從而調(diào)控、抑制膽管癌的自噬，從而導(dǎo)致了膽管癌的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后。在未來(lái)的研究中，本課題組將深入探討自噬影響膽管癌發(fā)生、發(fā)展以及膽管癌中自噬調(diào)控的具體機(jī)制，以期為膽管癌的臨床治療領(lǐng)域提供新的基因靶點(diǎn)。