韓丹 余文華 張蓉

摘要：姬蛙是一大類常見的農(nóng)田物種，通常個體較小，蝌蚪間差異不明顯，難以準(zhǔn)確鑒定。本研究對采自貴州省黔東南州麻江縣姬蛙類蝌蚪標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，使用PCR技術(shù)擴增線粒體16S rRNA基因片段，參照GenBank中同源序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系對其進(jìn)行初步分子鑒定。結(jié)果表明，標(biāo)本16S rRNA基因片段與27條小弧斑姬蛙（Microhyla heymonsi）同源序列聚為一個單系，該單系內(nèi)部序列間遺傳距離小于本研究所用參考序列的種間遺傳距離，因此，初步鑒定標(biāo)本為小弧斑姬蛙蝌蚪。同時，本研究中小弧斑姬蛙支系的序列間遺傳距離略高于所有參考序列的種內(nèi)遺傳距離，并且在單倍型網(wǎng)絡(luò)中被分割為6個獨立網(wǎng)絡(luò)，暗示分布廣泛的小弧斑姬蛙種內(nèi)存在較大的支系分化。另外，本研究對參考序列中的可疑序列進(jìn)行了初步探討。

關(guān)鍵詞：小弧斑姬蛙;16S rRNA基因;克隆;分子鑒定;可疑序列

小弧斑姬蛙（Microhyla heymonsi），隸屬姬蛙科（Microhylidae）、姬蛙屬（Microhyla）[1]，是常見的農(nóng)田蛙類。因其具有多樣的環(huán)境適應(yīng)能力，而廣泛分布于中國、印度、緬甸、泰國、老撾、越南、柬埔寨、馬來半島、印度尼西亞等地區(qū)[1-2]。國內(nèi)主要分布于四川、重慶、云南、貴州、河南、安徽、江蘇、浙江、江西、湖南、福建、臺灣、廣東、海南、廣西等地區(qū)[1]。小弧斑姬蛙在貴州省內(nèi)多地均有分布，如綏陽、仁懷、赤水、大方、金沙、江口、印江、松桃、貴陽、貴定、荔渡、羅甸、雷山、興義、安龍、德江、劍河等地區(qū)[3]。然而，目前并沒有明確的文獻(xiàn)記載該物種在麻江縣是否有分布。2016年6月，筆者于貴州省黔東南州麻江縣壩芒鄉(xiāng)采集到疑似小弧斑姬蛙蝌蚪標(biāo)本3號，但因蝌蚪較小，形態(tài)特征不明顯，且與貴州分布的其他姬蛙蝌蚪極為相似，因此有必要對該標(biāo)本使用分子鑒定手段作進(jìn)一步的物種鑒定。本研究擬對所采集的姬蛙蝌蚪標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，擴增其線粒體16S rRNA基因（以下簡稱16S基因），并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析從而對其物種歸屬進(jìn)行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本信息

小弧斑姬蛙標(biāo)本為2016年6月25日采自貴州省黔東南州麻江縣壩芒鄉(xiāng)的3個蝌蚪幼體，保存于六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動物標(biāo)本館。參考序列[4-11]見表1。

1.2 總DNA提取及線粒體16S rRNA基因片段擴增

取蝌蚪尾部肌肉，使用動物組織DNA提取試劑盒（Foregene，DE-05011：250 Preps）提取總DNA。擴增引物為1對脊椎動物線粒體16S基因片段擴增通用引物（P7/P8）[12-13]。PCR反應(yīng)條件與華西雨蛙、寒露林蛙同源基因擴增條件相同[13-14]，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 參考基因序列下載及系統(tǒng)發(fā)育分析

將所測得的小弧斑姬蛙線粒體16S基因序列經(jīng)過上傳GenBank進(jìn)行搜索比對（Mega Blast）獲得100條參考序列，與本研究所得基因序列一起構(gòu)成數(shù)據(jù)集A。用Muscle軟件[15]對序列進(jìn)行比對，在Mtga X[16]中輔以人工校對并將首尾不整齊片段刪除。進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時不預(yù)先設(shè)定外群，構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹。使用jModel Test[17]中赤池信息量準(zhǔn)則（akaike information criterion，簡稱AIC）篩選適合數(shù)據(jù)集A的最優(yōu)模型，并使用相應(yīng)的最優(yōu)模型樹（best model tree）作為拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基準(zhǔn)。根據(jù)AIC，適合該數(shù)據(jù)集的模型為GTR+I+G模型，其中 G=0.885，I=0.605。使用raxmlGUI軟件[18]構(gòu)建最大似然樹（maximum likelihood tree，簡稱ML tree），自舉檢驗支持率>70%表明該支系關(guān)系得到充分解決。使用Mrbayes 3.2[19]構(gòu)建貝葉斯樹（bayesian inference tree，簡稱BI tree），堿基替換模型設(shè)置為GTR+G+I，以后驗概率（posterior probability，簡稱PP）來表示各分支的可信度（支持率），貝葉斯后驗概率≥95%說明其支系支持率得到充分解決。使用Mega X軟件構(gòu)建鄰接樹（neighbor-joining tree，簡稱NJ tree）和最大簡約樹（maximum parsimony tree，簡稱MP tree），自舉檢驗支持率>70%表明該支系關(guān)系得到充分解決，支持率在50%～70%之間為中度支持，否則視為未解決。

1.4 遺傳距離的計算

選用軟件Mtga X，分析數(shù)據(jù)集A中各序列間差異，依據(jù)Kimura 2-parameter模型計算兩兩序列間的遺傳距離以及主要支系間的平均遺傳距離。使用R語言基礎(chǔ)包（base）繪制種間及種內(nèi)遺傳距離數(shù)據(jù)的密度分布曲線，探明小弧斑姬蛙及近緣物種在16S基因上的種間及種內(nèi)遺傳距離的主要分布區(qū)域。

1.5 單倍型網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)雙重單系法[5，20]，在數(shù)據(jù)集構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，以自測序列為起點向根部回溯2個單系中間節(jié)點，從而得到包含自測序列及其近緣物種同源基因序列構(gòu)成數(shù)據(jù)集B。使用R語言程序包haplotypes[21]分析數(shù)據(jù)集B的單倍型類型并繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)（圖1-A）。設(shè)置簡約上限（parsimony limit）時，默認(rèn)值為0.95，考慮到要將不同的物種劃分到獨立的網(wǎng)絡(luò)中去，本研究中簡約上限設(shè)置為0.97。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增及測序結(jié)果

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物P7/P8擴增到550 bp左右的基因片段。經(jīng)測序，獲得長度為544～555 bp DNA序列（GenBank索取號為MH544145～MH544147）。序列堿基組成存在明顯的偏向性：AT含量較高（A含量為31.1%，T含量為25.5%）;GC含量較低（G含量為20.9%，C含量為22.6%）。所擴增最長序列MH544146（555 bp），對應(yīng)小弧斑姬蛙線粒體基因組的（GenBank索取號為AY458596）2 161～2 703 bp區(qū)間位置，對應(yīng)小弧斑姬蛙16S rRNA全基因（位于線粒體基因組AY458596的1 288～2 861 bp區(qū)域）874～1 416 bp區(qū)間位置，因此擴增目的序列為小弧斑姬蛙16S rRNA編碼基因的下游區(qū)域。

2.2 序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

將所測得16S基因序列與100條同源序列一起構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖1-B），3條自測序列與27條小弧斑姬蛙同源序列聚為1個單系（小弧斑姬蛙支系，圖1-C中節(jié)點N11），同時得到NJ（97%）、MP（90%）、ML（88%）以及BI（100%）等方法的較高支持率支持（表2）。在其內(nèi)部，進(jìn)一步分化為5個主要支系（節(jié)點N04、N05、N06、N09所在支系以及單序列支系MG935906）。N05、N06、N09均得到了4種系統(tǒng)發(fā)育推斷方法較高支持（表2）。本研究中3條自測序列與自懷、越南等種群的6條序列聚為1個支系（N04），但支持率較低（表2）。

2.3 單倍型網(wǎng)絡(luò)

提取小弧斑姬蛙支系序列構(gòu)建數(shù)據(jù)集B，以之構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)，在將簡約上限設(shè)置為默認(rèn)值0.95時，并未將所有序列包括在同一個單倍型網(wǎng)絡(luò)中，其中支系N06中的3條序列（AB530636、AB530637、HM359091）單獨構(gòu)成1個獨立網(wǎng)絡(luò)。為進(jìn)一步將主要支系都分割成獨立的網(wǎng)絡(luò)，更清晰地觀察自測序列單倍型所屬網(wǎng)絡(luò)情況，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的主要支系分化的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，將簡約上限設(shè)置為 0.97，以得到更多的相互獨立的單倍型網(wǎng)絡(luò)（6個單倍型網(wǎng)絡(luò)分別為Net01、Net02、Net03、Net04、Net05，Net06，圖1-C）。然而，當(dāng)所有支系都獨立成單獨的單倍型網(wǎng)絡(luò)時，支系N01絕大部分序列構(gòu)成單倍型網(wǎng)絡(luò)Net01（圖1-A），而序列DQ283382單獨構(gòu)成一個單倍型網(wǎng)絡(luò)Net05（圖1-C）。初步推定該序列為一條可疑序列，為探究其對系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系構(gòu)建的影響，從數(shù)據(jù)集A中剔除DQ283382，重新構(gòu)建序列間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，探究該序列對系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和節(jié)點支持率的影響（表2）。

2.4 遺傳距離

基于16S基因序列的遺傳距離表明，小弧斑姬蛙支系內(nèi)遺傳距離為0.0%～1.6%，其內(nèi)部支系Net01、Net02、Net03、Net04的內(nèi)部序列間平均遺傳距離分別為1.12%、0.87%、0.15%、0.33%，亞支系間的遺傳距離為3.6%（2.2%～5.6%）;亞支系和非小弧斑姬蛙序列間的遺傳距離為7.7%（7.2%～8.7%）。種間及種內(nèi)遺傳距離數(shù)據(jù)的密度分布曲線（圖1-D）表明，相比所有序列種間遺傳距離分布曲線，小弧斑姬蛙支系內(nèi)部序列間的遺傳距離分布曲線和種內(nèi)遺傳距離分布曲線重合較多，但總體高于種內(nèi)遺傳距離。

3 討論

3.1 小弧斑姬蛙的分子鑒定

本研究系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，3條自測序列與27條小弧斑姬蛙同源序列聚為1個單系，既使去掉可疑序列（DQ283382）后，仍與26條小弧斑姬蛙同源序列聚為1個單系（表2）。3條自測序列與來自我國自懷以及越南的小弧斑蛙同源序列聚為1個亞支系，內(nèi)部序列間平均遺傳距離分別為1.12%，遠(yuǎn)低于本研究中所有序列的種間遺傳距離（圖1-D）。因此，初步判定本研究所采集蝌蚪標(biāo)本屬于小弧斑姬蛙（Microhyla heymonsi）。但本研究涉及的麻江、自懷種群均距離模式產(chǎn)地臺灣[3]較遠(yuǎn)，且缺乏其他種群數(shù)據(jù)（臺灣種群、東部種群等），因此鑒定結(jié)果有待進(jìn)一步證實。

3.2 小弧斑姬蛙內(nèi)部支系分化

在本研究中，小弧斑姬蛙支系進(jìn)一步分化為6個亞支系，各支系在單倍型網(wǎng)絡(luò)分析中被分割為獨立的網(wǎng)絡(luò)（排除1條可疑序列后，仍有5個支系）。且部分支系單系性在多種系統(tǒng)發(fā)育分析方法中得到較高的支持率，如支系Net02、Net03。亞支系間的遺傳距離與種內(nèi)距離不完全重合，偏高，但并沒有超越種間距離（圖1-D），說明小弧斑姬蛙物種內(nèi)部種群間有了較大的遺傳分化?？紤]其較為廣闊的分布范圍[3]，這種分化可能在一定程度上是由于種群間相距較遠(yuǎn)，基因交流頻率較低所致，詳細(xì)的種內(nèi)支系分化關(guān)系以及分化水平有待更為充分的抽樣研究支撐。

3.3 可疑序列剔除方法初探

在本研究使用的參考序列中DQ283382在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建中聚在支系N04內(nèi)部，但在單倍型網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中，其并未與該支系的其他序列鏈接為一個共同的網(wǎng)絡(luò)（Net01），而是獨立成為1個單獨網(wǎng)絡(luò)（Net05）。鑒于該序列所在種群未有其他同源序列[4]（生物重復(fù)），初步判定為一條可疑序列。為探究該可疑序列對于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建的影響，本研究將其剔除后重新構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與未剔除時的系統(tǒng)發(fā)育樹作對比。結(jié)果（表2）表明，剔除該序列后，不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)更趨一致，如在剔除前，節(jié)點N03同時得到了MP、ML、BI方法的支持，但沒有得到NJ的支持，在剔除后，同時得到了4種方法的支持;又如節(jié)點N10的聚類關(guān)系只得到了ML、BI的支持，剔除DQ283382后，增加了MP方法的支持。另外，剔除序列DQ283382后，系統(tǒng)發(fā)育樹的大多數(shù)節(jié)點支持率都有所提高。例如N01節(jié)點，MP的支持率由49%上升為94%，BI的支持率由<50%上升至82%;又如N03節(jié)點，ML樹的支持率由60%上升到75%;N04節(jié)點的NJ樹的支持率由57%上升至73%。

綜上所述，可疑序列DQ283382在一定程度上影響了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的重建，而對比單倍型網(wǎng)絡(luò)與系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的一致性，提供了識別類似可疑序列的一個視角，當(dāng)然其適用性還有待更多的案例研究加以檢驗。

參考文獻(xiàn)：

[1]費 梁，葉昌媛，江建平. 中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒[M]. 成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2012：568-569.

[2]Sheridan J A，Bickford D，F(xiàn)eng K，et al. An examination of call and genetic variation in three wide-ranging Southeast Asian anuran species[J]. The Raffles Bulletin of Zoology，2010，58（2）：369-379.