自由基聯(lián)合超聲降解法在海帶巖藻聚糖硫酸酯中的應(yīng)用

郭峰君 楊樂樂

摘要：為研究廣西海域海帶巖藻聚糖硫酸酯的基本組成，用水提醇沉法提取巖藻聚糖硫酸酯，用自由基聯(lián)合降解法降解廣西海域海帶巖藻聚糖硫酸酯，獲得低分子量雜多糖，對廣西海域海帶的硫酸根含量、巖藻糖含量等指標(biāo)進(jìn)行測定，用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對自由基降解方法獲得的低分子量多糖分子量分布進(jìn)行研究。結(jié)果表明，利用自由基氧化降解聯(lián)合超聲降解法能得到分子量較低且分布比較廣的雜多糖，說明該方法簡單、降解速率塊、無毒副作用，正交試驗(yàn)得出，當(dāng)超聲功率為400 W，溫度為60 ℃，時(shí)間為60 min，pH值為8.0時(shí)降解速率最佳。

關(guān)鍵詞：廣西海帶;巖藻聚糖硫酸酯;自由基降解;超聲降解;凝膠電泳法

海帶（Laminaria japonica），別稱綸布、昆布、江白菜，不但可以食用，其藥用價(jià)值在本草綱目等醫(yī)書中也早有記載，是生長在低溫海水中的一種多年生大型藻類[1]。廣西海岸線較長，北部灣盛產(chǎn)海帶。巖藻聚糖硫酸酯（Fucoidan），別稱褐藻膠，是褐藻、海參和海膽中特有的一種以巖藻糖為主的硫酸酯多糖[2]，主要富集在細(xì)胞壁中[3-4]。不同產(chǎn)地、不同提取方式，巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)存在差異[5]。巖藻聚糖硫酸酯主要由硫酸化的巖藻糖和少量的糖醛酸、半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖等組成，是一種水溶性雜多糖[6]。海帶中巖藻聚糖硫酸酯的分子量大，糖組成復(fù)雜，分子量分布范圍較廣。Alban等發(fā)現(xiàn)，分子量高的巖藻聚糖較難被吸收，而分子量低的則溶解性好、黏度小、吸收利用率高、生物活性較高[7]。目前，美國、日本、俄羅斯、德國、挪威等國家的巖藻聚糖產(chǎn)品均已上市或進(jìn)行臨床應(yīng)用，在中國也有巖藻聚糖硫酸酯開發(fā)上市[8-10]。巖藻聚糖硫酸酯具有多種生物活性，而生物在消化利用大分子量多糖上存在障礙[11]。

巖藻聚糖硫酸酯的藥理活性與其分子量大小、單糖組成、硫酸根含量、糖苷鍵連接方式都具有相關(guān)性[12-13]。藥理功效已被許多學(xué)者證明，但構(gòu)效關(guān)系仍需深入研究，是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，所以多糖的結(jié)構(gòu)仍然是研究熱點(diǎn)。制備安全的低分子量多糖是發(fā)展趨勢[14]。低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備，目前常采用的方法有自由基降解法、酶解法、酸降解法、堿降解法、超聲波法等[15-20]。酸、堿降解法由于有殘留，安全性存在問題，自由基法、酶解法和超聲波法可應(yīng)用于海洋藥物的研發(fā)。目前，巖藻聚糖硫酸酯是海洋多糖藥物研究中的熱點(diǎn)之一。

本研究采用自由基降解法聯(lián)合超聲波降解法對巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)行降解，通過正交試驗(yàn)得出最優(yōu)降解條件，并用電泳法對降解后多糖的分子量分布進(jìn)行比較分析，以期為低分子量巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)研究和產(chǎn)品開發(fā)提供試驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶，購于北海南珠市場;巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司生產(chǎn);乙醇、稀鹽酸、濃硫酸、苯酚、明膠硫酸鋇、過氧化氫、醋酸銅等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器設(shè)備有FW-100萬能粉碎機(jī)、DHG-9037A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、AR224CN電子分析天平、UV-1800紫外分光光度計(jì)、Nicolet-Nexus 470紅外分光光度計(jì)、Tanon EPS300電泳儀、ZL10-250C超聲儀。

1.3 方法

1.3.1 巖藻聚糖硫酸酯的提取 采用水提醇沉的方法進(jìn)行巖藻聚糖硫酸酯的提取，主要步驟：將海帶清洗、烘干、粉碎后過篩，制成粉末;采用水提醇沉法（80 ℃熱水提取，上清液用30%、60%、85%乙醇醇沉）用透析袋透析除去金屬離子和鹽;旋蒸濃縮后烘干，得到海帶粗多糖GF0。

1.3.2 廣西海域海帶巖藻聚糖硫酸酯基本成分測定 （1）水分含量采用GB 5009.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中的直接干燥法進(jìn)行測定。（2）蛋白質(zhì)含量測定采用 GB 5009.5—2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法。（3）脂肪含量測定采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》中的索氏提取法。（4）總糖含量測定采用苯酚硫酸法[21]，主要步驟：稱取適量巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，配成 1 mg/mL 的溶液，分別加水稀釋制成0.12～0.20 mg/mL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別吸取一定量于試管中，加入等量6%苯酚溶液，搖勻后迅速加入5倍體積的濃硫酸，漩渦振蕩混勻，室溫放置0.5 h后于490 nm波長處測定其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;將海帶粗多糖樣品配成0.1%溶液，按上述步驟測定。（5）巖藻糖含量的測定采用Gibbons比色法[22]，具體方法：取巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，用蒸餾水定容至1.0 mL;冰水浴下加入4.5 mL 87%的濃硫酸，混勻;1 min后，沸水浴加熱10 min，迅速冷卻至室溫，加入0.1 mL 3%的半胱氨酸鹽酸鹽，混勻，靜置90 min后，在400 nm和430 nm處分別測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;配制0.1%的海帶粗多糖溶液，取0.2 mL，測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巖藻糖含量。（6）硫酸根含量的測定采用明膠比濁法[23]，具體方法：分別取標(biāo)準(zhǔn)硫酸鉀溶液（0.35 mg/mL）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，定容至3.0 mL，加0.2 mol/L稀鹽酸3.8 mL，明膠硫酸鋇 1 mL，混勻后靜置30 min，在500 nm處測量吸光度。取海帶粗多糖樣品0.025 g，加0.2 mol/L稀鹽酸 8 mL，密封水浴加熱4 h后，冷卻至室溫，定容至 25 mL，配制成0.1%的樣品，取1 mL測定吸光度。

1.3.3 基本結(jié)構(gòu)測定 采用紅外光譜法[24]測定海帶粗多糖基本結(jié)構(gòu)，用溴化鉀研磨壓片后，在 4 000～4 00 cm-1波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.3.4 自由基降解 采用自由基降解法[25]進(jìn)行降解：取1 mL 20 mg/mL海帶粗多糖，加入 0.026 7 mol/L 醋酸銅，保持pH值在7.5左右，60 ℃ 恒溫加熱條件下加 20 μL/h 的15% H2O2反應(yīng)6 h。10 000 r/min離心30 min，除去大部分Cu2+，將pH值調(diào)至中性。

1.3.5 電泳法分析多糖的分子量分布 采用丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）法測定海帶多糖的分子量分布。利用一定濃度的硼酸、Tris和乙二胺四乙酸（EDTA）配制外室緩沖液，甘氨酸、Tris配制內(nèi)室緩沖液。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和蔗糖用外室緩沖液配成15%分離膠和5%濃縮膠，脫氣備用。電泳分析時(shí)電壓為200 V，時(shí)間為30 min左右。用阿利新藍(lán)染色30 min左右后，用乙酸脫色。根據(jù)硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品電泳距離計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 超聲法復(fù)合自由基降解法 取1 mL用“1.3.4”節(jié)中的方法降解過的多糖，分別以超聲功率、溫度、時(shí)間、pH值進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）。DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線法[26]：以還原糖釋放量為降解指標(biāo)，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，在520 nm的吸收光譜下測定吸光值。計(jì)算公式：還原糖釋放量=降解后還原糖濃度-降解前還原糖濃度。將1 mg/mL海帶粗多糖在不同的超聲功率、時(shí)間、溫度、pH值下進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分測定結(jié)果

測得巖藻糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.000 7x+0.000 3，r2=0.993 3;硫酸根含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.776x+0.007，r2=0.999 2。經(jīng)過計(jì)算，粗多糖的提取率為1.44%，巖藻糖占總糖含量的30.09%，硫酸根含量為38.21%（表2），說明廣西海域海帶巖藻聚糖硫酸酯硫酸根含量較高，具有很高的藥用價(jià)值。

廣西海域海帶多糖與其他海域多糖結(jié)構(gòu)相似。由圖1可知，在3 000～2 800 cm-1處出現(xiàn)不同程度的振動(dòng)吸收，2 936 cm-1處為C—H伸縮振動(dòng)峰，是巖藻糖的甲基吸收峰，較弱;1 632 cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是N—H變角振動(dòng)峰，1 417 cm-1處是C—O的伸縮振動(dòng)峰，為吸收峰，說明有糖醛酸;1 259 cm-1 處是SO官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰，是強(qiáng)吸收峰;C—O—S伸縮振動(dòng)峰與多糖鏈上硫酸根的位置有關(guān)，是連接在巖藻糖C4位上的直立鍵硫酸根，818 cm-1左右出現(xiàn)的吸收峰表示該多糖的硫酸根連接在該糖的C2或C3上，屬于α-D-半乳吡喃糖。

2.2 分子量計(jì)算

根據(jù)圖2中硫酸軟骨素分子量標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算分子量與移動(dòng)距離之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=-0.000 9x+4.445 5，r2=0.997 9。通過計(jì)算，分子量為2～8 ku的硫酸軟骨素，分子量與電泳距離呈線性關(guān)系。已知硫酸軟骨素的分子量為14 ku，以標(biāo)準(zhǔn)品為對照，可估算得到，降解前硫酸多糖分子量為20～100 ku，降解后硫酸多糖的分子量小于20 ku（圖3）。說明自由基氧化降解得到低分子量巖藻聚糖硫酸酯，產(chǎn)物主要是寡糖和分子量低于8 ku的低分子量組分，得到的是分子量分布比較廣的雜多糖。

2.3 降解工藝優(yōu)化結(jié)果

通過正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）可知，影響降解的主次因素為超聲功率>時(shí)間>溫 度> pH值?？梢钥闯?，最佳配比為A2B3C3D2。當(dāng)超聲功率為 400 W，溫度為60 ℃，時(shí)間為60 min，pH值為8.0時(shí)降解速率最佳。

3 討論與結(jié)論

海帶巖藻聚糖硫酸酯的分子量大且分布范圍較廣，糖組成復(fù)雜。大分子量的多糖在服用過程中會(huì)出現(xiàn)出血等副作用，因此，分析海帶巖藻聚糖硫酸酯分子量大小對其功能型產(chǎn)品的開發(fā)及海帶高值化利用具有重要意義。本試驗(yàn)對廣西海域海帶的基本成分進(jìn)行確定，并用自由基降解法結(jié)合電泳法分析巖藻聚糖硫酸酯的分子量分布。結(jié)果表明，廣西海域海帶巖藻聚糖硫酸酯硫酸根含量較高。由于在一定范圍內(nèi)硫酸多糖的分子量與電泳距離呈線性關(guān)系， 采用離子交換PAGE凝膠電泳法分析分子量分布，利用0.026 7 mol/L醋酸銅，60 ℃恒溫加熱條件下，加20 μL/h的15% H2O2反應(yīng)6 h后，采用聯(lián)合超聲法降解自由基，聯(lián)合超聲功率為 400 W，溫度為60 ℃，時(shí)間為60 min，pH值為8.0時(shí)降解速率最佳。說明該方法簡單、經(jīng)濟(jì)，能直觀準(zhǔn)確地反映多糖分子量的分布狀況。自由基降解法聯(lián)合超聲降解法具有操作簡單、降解速率快、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，得到的低分子量巖藻聚糖硫酸酯是分子量分布比較廣的雜多糖。

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