張譯之，段鐘平，張曉慧，陳 煜

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 疑難肝病及人工肝中心，肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室，北京 100069

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種無過量飲酒史、以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征、與胰島素抵抗(IR)密切相關(guān)的臨床病理綜合征[1]。目前 NAFLD 已經(jīng)成為全球最主要的慢性肝病，2016年全球平均患病率為24%，其中亞洲患病率為27%[2-3]。NAFLD過去被認(rèn)為主要發(fā)生在西方發(fā)達(dá)國家，然而，近20年來隨著亞洲地區(qū)人民生活水平的提高，NAFLD在亞洲地區(qū)的患病率逐年升高[4]。因此，探索NAFLD發(fā)病的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的干預(yù)靶點是亟待解決的問題。目前尚無針對NAFLD的特異性藥物，傳統(tǒng)的他汀類、雙胍類及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等僅作為NAFLD降脂、改善胰島素抵抗及合并高血壓時的治療；法尼醇受體激動劑具有潛在的調(diào)節(jié)脂代謝的作用，但由于副作用明顯，尚不推薦用于NAFLD的治療，因此，中藥在改善NAFLD的作用方面受到越來越多的關(guān)注[5-6]。

肝爽顆粒(Ganshuang granule, GSG)是中藥復(fù)方制劑，主要成分有丹參、柴胡(醋制)、白芍、當(dāng)歸、茯苓等13味中藥,具有疏肝健脾、保肝護(hù)肝等功效，臨床主要用于治療急慢性肝炎、肝硬化[7]。并且對慢性病毒性肝炎、CCl4引起的肝損傷等有一定治療作用[8-9]。GSG中的柚皮苷還有抗纖維化的作用[10]。前期研究[7,11]表明，GSG能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂質(zhì)代謝紊亂及肝脂肪變性，減輕氧化應(yīng)激水平，但該研究未涉及具體機(jī)制。本研究通過體外建立新型3D組織工程(tissue engineering, TE)肝臟NAFLD模型，探索GSG對NAFLD的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自上海Hyclone公司; 胎牛血清、胰酶、青鏈霉素購自美國Gibco公司; PCR提取試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)。GSG浸膏由保定步長天浩制藥有限公司提供。蠕動泵購自MasterFlex、0.22 μm濾器(millex-GV)、SDC購自VETEC、一次性靜脈留置針(泰爾茂Hybria ⅡB型三通)、油酸、棕櫚酸購自Sigma公司、CCK8試劑盒購自DOJINDO公司、油紅O染色試劑盒購自Solarbio公司、TG試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠12只(體質(zhì)量180～220 g)來自維通利華實驗動物中心，實驗前動物正常飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 TE肝臟纖維支架的制備 大鼠用10%水合氯醛麻醉，75%酒精消毒腹部，打開腹腔，暴露肝臟及門靜脈。用一次性靜脈留置針插入門靜脈，作為肝血管系統(tǒng)的灌注入口。用1%脫氧膽酸鈉(1%SDC)緩沖液(內(nèi)含20 UL/L磷脂酶A2)通過導(dǎo)管灌流肝臟，將肝臟脫細(xì)胞，隨后用生理鹽水沖洗灌流直到組織變透明。此時得到了脫細(xì)胞并保留有全部細(xì)胞外基質(zhì)成分的肝臟支架模型。隨后將大鼠透明的肝臟支架模型分離下來，結(jié)扎、修剪并保留部分肝葉，懸掛于事先裝好DMEM的無菌異形瓶內(nèi)，連接蠕動泵裝置，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中循環(huán)灌流過夜。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及模型再細(xì)胞化 將HepG2 細(xì)胞(購自ATCC)在DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)中正常培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。再細(xì)胞化前將HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分3次注入循環(huán)灌流裝置，每次細(xì)胞數(shù)量為1×107，并以8 ml/min的速度循環(huán)灌流。在此期間，HepG2細(xì)胞重新進(jìn)入肝臟支架并進(jìn)行增殖。24 h后，分別灌注正常的完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)和高脂培養(yǎng)基(含1 mmol/L FFA的完全培養(yǎng)基)建立TE肝(正常對照組，n=4)和TE脂肪肝(TE fatty，TEF)模型(FFA組，n=4)。5 d后GSG浸膏(濃度10 μg/ml)干預(yù)TEF(FFA+GSG組，n=4)，第8天收集標(biāo)本(圖1)。

1.2.3 高脂培養(yǎng)基配制 將1 mol/L油酸和棕櫚酸按2∶1比例混合，加入10 μl NaOH和800 μl DMEM混合并置于60 ℃的超聲水浴中震蕩30 min。加入3.1 ml 2%牛血清白蛋白，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4。將制備好的FFA加入到100 ml完全培養(yǎng)基中，制成高脂培養(yǎng)基。

1.2.4 細(xì)胞毒性檢測Cell Counting Kit 8(CCK8) 將HepG2細(xì)胞制成40～60個/μl的細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔加入100 μl的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)板加入不同濃度的GSG浸膏，作用24 h后根據(jù)試劑說明書要求，向每孔加入10 μl CCK溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵20 min，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD)，并計算細(xì)胞增殖-毒性。

1.2.5 油紅O染色 將組織的冰凍切片用60%異丙醇洗滌20～30 s，然后在改良油紅O染色液染色15 min。再用60%異丙醇及dH2O洗滌，去除非特定結(jié)合的染色。最后用蘇木精染核，并用Olympus BX51+DP72顯微鏡拍照。

1.2.6 RNA提取和RT-qPCR 用Trizol提取總RNA，稀釋后紫外分光光度計，計算RNA濃度，然后用DNase處理。使用TaKaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄后在ABI StepOnePlus機(jī)器上運行qPCR,所用引物見表1。數(shù)據(jù)收集使用ABI7500軟件，結(jié)果顯示以2ΔΔct形式體現(xiàn)，并用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 目的基因及內(nèi)參GAPDH引物

1.2.7 TG的測定 將從肝臟模型中消化下來的HepG2細(xì)胞用PBS沖洗干凈，并按照試劑盒(TG測定試劑盒，A110-1，南京建城)說明書進(jìn)行處理。然后，將2.5 μl細(xì)胞勻漿加入96孔板中，與250 μl工作溶液混合，37 ℃孵育10 min。在510 nm處測量OD值，并計算TG濃度。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由北京佑安醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批(批號：AEEI-2020-076)，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 TEF模型的建立 再細(xì)胞化后的TE肝臟在孵箱中用蠕動泵持續(xù)灌注(圖2)。正常對照組TE肝臟一直用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。8 d后，F(xiàn)FA組肝臟與正常對照相比，有眾多肉眼可見的脂肪聚積(圖3)，并且其細(xì)胞內(nèi)TG含量為正常對照組的2倍(t=4.842，P=0.004 7)，同時胰島素抵抗指標(biāo)丙酮酸脫氫酶激酶4(PDK4)mRNA水平也顯著升高(t=2.784，P=0.031 8)(圖4)，表明NAFLD模型制備成功。

2.2 GSG的細(xì)胞毒性和降脂效果檢測 用普通平面的細(xì)胞培養(yǎng)方法首先檢測了GSG浸膏的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)從0.01 ng/ml～1 mg/ml，GSG浸膏均無明顯的細(xì)胞毒性，安全性良好(圖5a)。進(jìn)一步觀察了不同濃度下GSG的降脂效果，發(fā)現(xiàn)從100 μg/ml開始其降脂能力呈劑量依賴性，100 ng/ml之后降脂效果不明顯，選取10 μg/ml作為實驗用藥物濃度(圖5b)。

2.3 GSG對脂肪肝細(xì)胞胞內(nèi)TG水平和胰島素抵抗水平的影響 油紅O染色結(jié)果顯示，F(xiàn)FA組肝細(xì)胞內(nèi)有大量的中性脂肪滴，在GSG干預(yù)后脂肪滴明顯減少(圖6a)。通過對TG的定量檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA+GSG組肝細(xì)胞內(nèi)TG水平較FFA組下降66%(t=0.055，P=0.003 7)(圖6b)。PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)FA+GSG組肝細(xì)胞胰島素抵抗指標(biāo)PDK4水平也下降了61%(t=3.761，P=0.009 4)(圖6c)。

2.4 GSG對肝臟脂質(zhì)合成途徑相關(guān)酶的影響 正常生理狀態(tài)下,肝細(xì)胞合成TG主要有2個來源[11]:攝取脂肪組織釋放至外周循環(huán)中的FFA,酯化生成TG；以葡萄糖氧化產(chǎn)物乙酰輔酶A為原料從頭合成脂肪酸,酯化生成TG(圖7)。其中前者是肝細(xì)胞TG的主要來源。本研究檢測了上述兩種來源途徑中的多種合成酶類如圖8所示，GSG干預(yù)后其肝細(xì)胞的脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(CD36)(t=6.552，P=0.007 2)和脂肪酸結(jié)合蛋白1(FABP1)mRNA水平(t=4.944，P=0.001 1)顯著降低；參與TG從頭合成的各種酶的表達(dá)也顯著下降，包括ACLY(t=2.689，P=0.027 6)、ACC(t=4.524，P=0.020 2)、FAS(t=6.040，P=0.009 1)、FADS2(t=3.758，P=0.005 6)和APGAT5(t=4.443，P=0.047 1)。ApoB mRNA水平也顯著下降(t=3.032，P=0.016 3)。

3 討論

NAFLD是臨床常見肝臟疾病, 好發(fā)于糖尿病、肥胖患者[12]。長期高脂飲食導(dǎo)致肝臟脂肪攝入過多,肝臟脂肪超載引起代謝障礙, 未經(jīng)氧化的脂質(zhì)在肝細(xì)胞沉積、變性。此外，代謝性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡等也參與NAFLD病變[13-14]?，F(xiàn)實中難以對患者反復(fù)行肝臟活檢，因此需要能密切反映人類NAFLD的模型進(jìn)行相關(guān)研究[15]。筆者團(tuán)隊Wu[16]等前期創(chuàng)新性地構(gòu)建了3D TE脂肪肝模型，該模型被證實與NAFLD患者早期的許多臨床表現(xiàn)相似，包括高度的胰島素抵抗、TG沉積、細(xì)胞色素酶的變化、白蛋白和尿素氮合成增加。由于模型采用人的肝細(xì)胞，因此種屬差異性小，是一種良好的NAFLD細(xì)胞模型[17-18]。

脂代謝紊亂是NAFLD的主要致病機(jī)制之一：肝臟攝取及合成的脂肪酸超過其β氧化及排出能力(在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與apoB 組裝成VLDL排泌到竇周隙)，導(dǎo)致脂代謝平衡打破，輸入大于輸出，過多的TG蓄積在肝細(xì)胞，導(dǎo)致脂質(zhì)過度沉積[19]。肝細(xì)胞膜上的脂肪CD36介導(dǎo)FFA跨質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運，F(xiàn)FA一旦進(jìn)入胞質(zhì)，便與細(xì)胞內(nèi)的“擺渡車”-FABP家族緊密結(jié)合，運送到TG代謝部位[20]，被脂酰CoA合成酶激活形成?；o酶A。本研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝模型的CD36表達(dá)明顯增高，而GSG干預(yù)后其表達(dá)下調(diào)，表明GSG可通過降低FFA的攝取途徑減少TG合成。ACC催化細(xì)胞漿內(nèi)脂肪酸從頭合成時乙酰輔酶A向丙二酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，是脂質(zhì)從頭合成途徑的限速酶。研究[21]表明，特異性敲除小鼠肝細(xì)胞ACC,其胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量為野生型小鼠的30%,TG含量僅為野生型小鼠的一半,且脂肪酸β氧化不受影響,表明ACC的缺失可以下調(diào)脂肪酸從頭合成。而FAS催化丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化棕櫚酰輔酶A。有研究[22]表明，脂肪肝時FAS的mRNA、蛋白質(zhì)水平均顯著上調(diào)。筆者團(tuán)隊先前的研究[16]與上述情況相一致，NAFLD模型ACC、FAS mRNA水平較TE肝模型顯著升高。本實驗發(fā)現(xiàn)GSG處理后可明顯下調(diào)脂肪肝細(xì)胞的ACC和FAS表達(dá)，表明GSG也可以通過減少脂質(zhì)從頭合成來減少TG合成。此外，筆者發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)后ApoB mRNA水平也顯著下降，原因可能是TG的兩條來源途徑均被削弱，因此TG含量減少，相應(yīng)地內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行裝配時對ApoB的需求減少，因此表達(dá)下降。另一方面，可能與GSG減少胰島素抵抗，從而減少VLDL和乳糜微粒的裝配和分泌有關(guān)[23]。

胰島素抵抗及隨之相應(yīng)的高胰島素血癥在NAFLD時肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積中也起著重要作用[24]:一方面, 胰島素抵抗增強(qiáng)外周脂肪組織TG降解, 抑制FFA酯化, 升高FFA水平, 使肝臟攝取FFA增多; 胰島素抵抗導(dǎo)致線粒體TG轉(zhuǎn)運蛋白受損, ApoB與TG 結(jié)合能力下降[25]。另一方面, 胰島素抵抗伴隨的高胰島素血癥增加肝細(xì)胞合成脂肪酸, 并抑制其β氧化, 造成肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積；高胰島素血癥還過氧化物酶體增生物激活受體α上調(diào)相關(guān)脂肪酶的表達(dá)。在本研究中，使用GSG浸膏可使PDK4水平顯著下降，說明胰島素抵抗改善，肝臟攝取FFA減少，脂質(zhì)蓄積減少，ApoB與TG 結(jié)合能力升高。

綜上所述，本研究表明GSG有明顯的降脂作用，其機(jī)制可能為GSG通過減少FFA的攝取及脂質(zhì)的從頭合成來減少TG的合成，從而減輕肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，改善脂肪肝的脂代謝，改善胰島素抵抗，有望為臨床NAFLD的治療提供新的思路。