王 鷺，李海平，周永燦,，孫 云，曹貞潔

(1. 海南大學(xué) 南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228;2. 海南大學(xué) 海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?570228;3. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 ?？?570228)

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)，隸屬鱸形目(Perciformes)，鲹科(Carangidae)，鯧鲹屬(Trachinotus)，俗稱金鯧，是一種暖水性中上層魚類，因其較快的生長速度及較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而成為我國廣東、海南、福建等沿海地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要海水魚類之一.然而，隨著養(yǎng)殖密度的提高，病害問題已成為制約卵形鯧鲹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸[1].面對病害的肆虐，使用傳統(tǒng)抗生素依然是人們的首要選擇.但抗生素濫用所產(chǎn)生的藥物殘留、污染環(huán)境等諸多問題，已嚴(yán)重威脅人類健康[2-3].因此，迫切需要通過加強(qiáng)對養(yǎng)殖對象的免疫機(jī)制研究，通過全面系統(tǒng)地了解卵形鯧鲹免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制，探索建立卵形鯧鲹等水產(chǎn)動物疾病安全高效的免疫防治方法，推動其養(yǎng)殖的可持續(xù)健康發(fā)展.

腫瘤壞死因子配體(Tumor necrosis factor ligand superfamily , TNFSF)是能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死、遷移、分化的一類細(xì)胞因子[4-9]，主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，此外，B淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等也可分泌產(chǎn)生[10-13].研究表明在人類中已鑒定出19種腫瘤壞死因子配體成員[14]，而在魚類中有超過14種被確認(rèn)[15].TNFSF6是其重要的一員，它屬于Ⅱ型跨膜蛋白，由跨膜區(qū)、胞外區(qū)和胞漿區(qū)組成.研究表明，TNFSF6能夠通過與其受體相結(jié)合而誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，對腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用[16-17]，并且對于維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[18]，它除了參與細(xì)胞凋亡之外，還參與機(jī)體的非特異性免疫[19-20].目前，TNFSF6已相繼在羅非魚(Oreochromisniloticu)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大頭鱈(Gadusmacrocephalus)等魚體中被克隆鑒定[21-23]，但在卵形鯧鲹中尚未見報(bào)道.本研究以卵形鯧鲹為對象，對TNFSF6基因進(jìn)行了克隆，并進(jìn)行原核重組誘導(dǎo)表達(dá)而獲得重組蛋白rTroTNFSF6.此外，本研究通過免疫小鼠制備了卵形鯧鲹TNFSF6多克隆抗體，這為深入研究TNFSF6的生物學(xué)功能及卵形鯧鲹的免疫調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物平均體重為(20 ± 0.8)g的健康卵形鯧鲹購自海南澄邁養(yǎng)殖廠，實(shí)驗(yàn)開始前，暫養(yǎng)在養(yǎng)殖室水溫為26 ℃的充氣流動海水中一周；SPF級小鼠購自海南省藥物研究所，實(shí)驗(yàn)開始前，暫養(yǎng)于25 ℃恒溫飼養(yǎng)房中.

1.1.2 質(zhì)粒和菌株pET-32a載體由中國科學(xué)院海洋研究所惠贈；DH5α、EscherichiacoliBL21購自北京全式金生物公司.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器TransTaq-T DNA酶、pEASY-T1 Simple克隆載體購自北京全式金生物公司；DNTP、限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、EcoR V、蛋白Marker 26610購自美國Thermo公司；核酸Marker DL 2000、T4 DNA連接酶、CIAP去磷酸化酶購自北京Takara公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；氨芐青霉素、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶公司；羊抗鼠IgG(HRP標(biāo)記)購自美國ABclonal公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)卵形鯧鲹轉(zhuǎn)錄組測序獲得的TNFSF6基因序列，使用SMART在線網(wǎng)頁進(jìn)行信號肽的預(yù)測，然后設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物TroTNFSF6-F/R，并在引物5′端插入酶切位點(diǎn)SmaⅠ(CCCGGG)，引物由華大生物公司進(jìn)行合成(TroTNFSF6-F: 5′-CCCGGGGCCACCATGATCAACACTTACCAGACC-3′; TroTNFSF6-R: 5′-CCCGGGCAGTTTGTACATCCCAAAGG-3′).

1.2.2 卵形鯧鲹TNFSF6基因的獲得與序列分析以卵形鯧鲹cDNA第一鏈為模板進(jìn)行TroTNFSF6基因的擴(kuò)增，其中退火溫度為56 ℃.將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并與pEASY-T1 Simple連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并置于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔日挑取單菌落進(jìn)行檢測并將陽性單菌落送華大生物公司測序.

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建將測序正確的菌株與含有pET-32a載體的菌株培養(yǎng)至生長對數(shù)期，提取其質(zhì)粒并分別進(jìn)行酶切，其中含有目的基因的質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶為SmaⅠ，酶切溫度30 ℃，pET-32a酶切使用EcoR Ⅴ(GATATC)，酶切溫度為37 ℃，并使用CIAP酶對pET-32a進(jìn)行去磷酸化.隨后使用T4連接酶將兩者酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化至DH5α，挑取陽性單菌落送至華大生物公司測序，并提取測序正確菌株的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于BL21中，置于-80 ℃保存.

1.2.4 原核重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將帶有重組質(zhì)粒的菌株接種于5 mL 含有1‰ Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，向菌液中分別加入不同濃度的IPTG，置于不同溫度中誘導(dǎo)不同時(shí)間，其中陰性對照為不加入IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的菌液.誘導(dǎo)完成后，離心2 mL菌液以獲得菌體沉淀，加入80 μL pH為8.0的Buffer B緩沖液(100 mmol/L NaH2PO4, 100 mmol/L Tris, 8 mol/L Urea)并重懸，室溫震蕩裂解2 h，隨后12 000 × g離心20 min，取40 μL上清用于SDS-PAGE膠檢測有無誘導(dǎo)表達(dá).確定最佳誘導(dǎo)條件后并按此條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成后離心50 mL菌液以獲得菌體沉淀，加入5 mL pH為8.0的40 mmol/L咪唑緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4, 2 mol/L NaCl, 40 mmol/L Imidazole, 7 mmol/Lβ-Me, 0.1% Tween-20)并重懸，置于-80 ℃預(yù)冷的酒精中速凍10 min，隨后取出置于4 ℃融化并超聲破碎至菌液透明.將超聲完成的菌液離心并分別處理上清與沉淀，SDS-PAGE檢測樣品中蛋白表達(dá)情況.使用Ni-NTA柱對重組蛋白進(jìn)行純化，并將純化蛋白透析至PBS中，最后進(jìn)行蛋白濃度測定.

1.2.5 多克隆抗體的制備將1 mL純化的蛋白(200 μg/mL)與1 mL弗氏完全佐劑混合并震蕩至乳化，然后多點(diǎn)皮下注射至小鼠體內(nèi)，兩周后使用1 mL蛋白與1 mL弗氏不完全佐劑乳化混合液注射小鼠進(jìn)行二次免疫，二次免疫一周后再次使用1 mL蛋白與1 mL弗氏不完全佐劑乳化混合液注射小鼠進(jìn)行三次免疫.三次免疫一周后對小鼠進(jìn)行眼球取血，而后獲得其血清并置于-80 ℃保存，其中陰性對照為采用相同方式向小鼠體內(nèi)注射無菌PBS所獲血清.

1.2.6 多克隆抗體效價(jià)檢測采用間接 ELISA 法來檢測制備的多克隆抗體血清的效價(jià).首先將純化后的重組蛋白rTroTNFSF6作為抗原包被至96孔板中，4 ℃孵育過夜后用PBST洗滌并甩干，隨后向每孔中加入封閉液PBST-BSA，37 ℃孵育2～3 h，完成后向每孔加入PBST進(jìn)行洗滌，對制備的多克隆抗體血清分別進(jìn)行1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000稀釋，并與蛋白進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，37 ℃孵育3 h，加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體稀釋液作為二抗進(jìn)行ELISA反應(yīng)，最后加入可溶性單組分TMB底物溶液避光10 min進(jìn)行顏色反應(yīng)，直至溶液出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)加入 50 μL 的 2 mol / L H2SO4終止液， 以終止顏色反應(yīng)，最后測定各孔在450 nm處的吸光值.

2 結(jié) 果

2.1 卵形鯧鲹TNFSF6基因的獲得以卵形鯧鲹cDNA為模板，TroTNFSF6-F/R為引物對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的條帶大小與預(yù)期的687 bp一致(圖1)，測序結(jié)果在NCBI比對分析表明該序列為TNFSF6.TroTNFSF6共編碼228個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白分子量約為25.5 kDa，理論等電點(diǎn)為8.9，SMART軟件預(yù)測該蛋白不含信號肽.

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定目的片段與pET-32a載體進(jìn)行連接后，使用通用引物T7/T7t對連接產(chǎn)物進(jìn)行單菌落檢測，其凝膠電泳結(jié)果見圖2，目的片段插入原核表達(dá)載體的位點(diǎn)為EcoR Ⅴ，該位點(diǎn)到載體上游引物T7之間約600 bp，到載體下游引物T7 t之間約100 bp，均與擴(kuò)增結(jié)果相一致，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功.

2.3 原核重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化經(jīng)DNASTAR軟件預(yù)測得知，原核重組蛋白rTroTNFSF6大小約為46.5 kDa，對重組蛋白進(jìn)行小量誘導(dǎo)摸索其最佳誘導(dǎo)條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG濃度為0.6 mmol/L，于20 ℃誘導(dǎo)8 h時(shí)蛋白表達(dá)量最高，SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖3所示.

將原核重組蛋白按照最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)并進(jìn)行蛋白可溶性鑒定.結(jié)果顯示，目的蛋白大多位于沉淀中，為變性蛋白(圖4A).進(jìn)一步對變性蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果顯示純化得到的蛋白大小約46.5 kDa，與預(yù)測的原核重組蛋白大小一致，表明成功獲得純化的蛋白(圖4B).

2.4 多克隆抗體效價(jià)檢測采用間接ELISA檢測多克隆抗體的效價(jià)，結(jié)果顯示本研究所制備的TroTNFSF6多克隆抗體的效價(jià)較高，達(dá)到1∶32 000(表1).

表1 ELISA檢測多克隆抗體效價(jià)

3 討 論

腫瘤壞死因子配體TNFSF6是一類Ⅱ型跨膜蛋白，具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，能夠參與細(xì)胞炎癥、細(xì)胞凋亡、淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和組織發(fā)育等細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑[24-26].本研究中成功克隆了卵形鯧鲹TNFSF6基因，SMART在線網(wǎng)頁分析顯示TroTNFSF6結(jié)構(gòu)中無信號肽，其中包含一個(gè)跨膜區(qū)，與關(guān)于羅非魚和牙鲆TNFSF6的研究結(jié)果一致[21-22].TroTNFSF6共編碼228個(gè)氨基酸，預(yù)測其蛋白質(zhì)理論分子量為25.5 kDa.據(jù)報(bào)道，羅非魚TNFSF6的蛋白大小為26.3 kDa[21]，牙鲆的TNFSF6蛋白分子量為25.9 kDa[22]，大頭鱈的蛋白分子量為21.7 kDa等[23]，這些均與本研究獲得的卵形鯧鲹TNFSF6蛋白大小不一致，推測可能與魚的種類及TNFSF6的低保守度有關(guān).pET-32a是一種良好的原核表達(dá)載體，本研究中我們將TroTNFSF6序列與pET-32a連接獲得重組質(zhì)粒，并在BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其最適誘導(dǎo)溫度為20 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，IPTG的最佳濃度為0.6 mmol/L.重組蛋白rTroTNFSF6的結(jié)果表明，其大小與預(yù)測的46.5 kDa一致，此外對該蛋白進(jìn)行可溶性分析顯示rTroTNFSF6多以包涵體的形式存在.形成包涵體的原因可能有：(1)與其氨基酸序列有關(guān)，疏水性較高的蛋白質(zhì)更能夠形成包涵體[27]；(2)與蛋白誘導(dǎo)量有關(guān)，表達(dá)量越高越容易形成包涵體[28]；(3)與培養(yǎng)條件有關(guān)，當(dāng)誘導(dǎo)條件不佳時(shí)，容易形成包涵體[29].同時(shí)也有研究表明，包涵體中的大部分蛋白質(zhì)同樣擁有部分功能，可以不用重新折疊[30].利用Ni-NTA層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化，將純化后的蛋白與弗氏佐劑相混合，三次免疫小鼠后獲得多克隆抗體，經(jīng)過ELISA檢測表明制備的rTroTNFSF6抗體效價(jià)高達(dá)1∶32 000，可用于后續(xù)對TroTNFSF6的功能研究.綜上，本研究成功獲得了TroTNFSF6多克隆抗體，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能以及卵形鯧鲹的免疫調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ).