朱 原 李欣澤 郝 賀 張立偉 劉 洋 王風申 張永英，3*

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲056038；2.河北中貝佳美生物科技有限公司，河北石家莊050000；3.河北省禽病工程技術研究中心，河北邯鄲056038）

甜葉菊是菊科草本植物，含有多種功能性成分，包括糖苷類、黃酮類、綠原酸類等[1]。綠原酸是羥基肉桂酸家族中的酚類化合物[2-3]，是許多中藥的主要活性成分，具有抗病毒、抗氧化、調(diào)控脂肪細胞脂質(zhì)代謝、增強機體免疫、促進畜禽生長發(fā)育、提高生產(chǎn)性能、保護動物心血管系統(tǒng)等作用[4-7]。

在國家對養(yǎng)殖業(yè)提出“無抗、減抗和替抗”要求的趨勢下，開發(fā)新型“促生長、無殘留、安全”的替抗飼料添加劑具有廣闊的發(fā)展前景。綠原酸在動物體內(nèi)只有1/3 以原型的形式被吸收，大部分需要通過腸道菌群降解成咖啡酸、奎寧酸的形式吸收進入血液[8-10]，而且綠原酸作為飼料添加劑直接使用存在不溶性和適口性差等特點，制約了其在動物飼料中的廣泛應用。綠原酸通過與乳酸菌協(xié)同發(fā)酵，可使飼料中含有更多的活性乳酸菌菌體、蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物、活性小肽、抑菌物質(zhì)、各種消化酶及其代謝產(chǎn)物，降低抗營養(yǎng)因子含量，促進動物生長，維持動物健康[11]。動物體內(nèi)腸道菌群的多樣性也影響著能量代謝、免疫反應等諸多生理功能[12]。劉亮等[13]研究表明，成分復雜且含綠原酸的杜仲茶粉能夠促進乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸，而純品綠原酸則對其有抑制作用；呂武興等[14]研究發(fā)現(xiàn)，含有綠原酸的杜仲提取物能顯著提高三黃雞的平均日增重，顯著降低盲腸中大腸桿菌的數(shù)量；賴星[15]研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加綠原酸能顯著提高末重、平均日增重、平均采食量，顯著降低料肉比，促進免疫器官的發(fā)育，提高機體免疫力。Chen 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬日糧中添加綠原酸能增加盲腸中厚壁菌門和擬桿菌門細菌的相對豐度，表明綠原酸有助于調(diào)節(jié)腸道健康。以上研究表明，人們對杜仲綠原酸的抑菌和促生長作用關注較多，而在甜葉菊綠原酸發(fā)酵液的研制及其對雛雞腸道菌群的調(diào)控作用鮮有報道。

本研究以甜葉菊綠原酸為研究對象，以杜仲綠原酸為對照品，實驗室篩選出的雞源布氏乳桿菌為發(fā)酵菌種，選擇不同濃度的綠原酸和布氏乳桿菌共同培養(yǎng)，篩選最佳濃度，探討甜葉菊綠原酸發(fā)酵液對雛雞腸道菌群和臨床保護作用的影響。以期為甜葉菊綠原酸發(fā)酵液的后續(xù)開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

布氏乳桿菌（RG-6）來自河北省禽病工程技術研究中心；甜葉菊綠原酸（79%）、杜仲綠原酸（78%）由河北某公司提供；MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、BBL 培養(yǎng)基、LBS 培養(yǎng)基、碳酸鈣、丙酮（分析純）、吐溫80、冰乙酸（分析純）均購自海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

臺式高速離心機（H-1650，江東儀器裝備有限公司）；恒溫搖床（QIQIAN-2102C，上海啟前電子科技有限公司）；酶標儀（Multiskan Spectrum，賽默飛世爾科技公司）；pH計（PB-10，賽多利斯貿(mào)易有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠原酸對布氏乳桿菌體外生長的影響

1.3.1.1 標準曲線的制作

取對數(shù)生長期的布氏乳桿菌，調(diào)整菌液濃度為1×106cfu/ml，160 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、14 h測定活菌數(shù)和OD600[17]。

活菌數(shù)的測定：用pH值6.5的PBS緩沖液將布氏乳桿菌菌液倍比稀釋，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后進行平板計數(shù)。

OD600的測定：取無菌1.5 ml 離心管，加入菌液，8 000 r/min離心5 min，去掉上層培養(yǎng)基，pH值6.5 PBS緩沖液洗滌菌體2 次，1 ml PBS 緩沖液重懸，酶標儀測定OD600。以OD600值為橫坐標，以活菌數(shù)對數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.1.2 綠原酸發(fā)酵液生長曲線的測定

將1 ml 布氏乳桿菌菌液接種至50 ml MRS 肉湯，搖床培養(yǎng)8 h 至對數(shù)生長期，調(diào)整菌液濃度為1×106cfu/ml，按表1分別加入不同濃度的綠原酸，并設置布氏乳桿菌菌液和丙酮溶劑2個對照組。160 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、14 h 測定各組相應的OD600。將各時間節(jié)點測的OD600值代入標準曲線的線性方程，得到相應的活菌數(shù)，以時間為橫坐標，以活菌數(shù)對數(shù)值為縱坐標，繪制生長曲線。使用pH 計測定菌液在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14 h的pH 值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，pH 值為縱坐標，繪制菌液的pH-t曲線。

1.3.2 綠原酸發(fā)酵液對雛雞的保護作用

1.3.2.1 大腸桿菌感染劑量確定

參照郭海濤[18]進行大腸桿菌感染的方法，將1 日齡海蘭灰雛雞60 只隨機分為4 組，適應性飼養(yǎng)6 d，7 日齡時，用O78致病性大腸桿菌皮下注射感染。分組及感染情況見表2。感染后，記錄48 h 內(nèi)死亡率，剖檢死亡雛雞，觀察病理變化。

1.3.2.2 臨床保護試驗

將240 只7 日齡海蘭灰雛雞隨機分為8 組，每組3 個重復，每個重復10 只雞。大腸桿菌感染劑量為半數(shù)致死量，感染方式同1.3.2.1 節(jié)，感染2 h 后，開始灌服相應制劑，試驗期3 d，具體分組見表3。試驗結束后，統(tǒng)計雛雞死亡率。收集血清，采用牛津杯法測定含藥血清對大腸桿菌的抑菌效果。無菌取盲腸內(nèi)容物，利用平板計數(shù)法，檢測雛雞盲腸腸道菌群，培養(yǎng)條件見表4。

表1 布氏乳桿菌體外培養(yǎng)試驗分組

表2 大腸桿菌感染劑量

表3 臨床保護試驗分組

表4 盲腸細菌培養(yǎng)條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 初步統(tǒng)計整理，采用SPSS20.0 軟件進行單因素方差分析，均值比較采用Duncan's 法，測定結果以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 綠原酸對布氏乳桿菌體外生長的影響

2.1.1 標準曲線的繪制（見圖1）

由圖1 可知，活菌數(shù)對數(shù)值與吸光度呈線性關系，線性方程為:y=5.524 0x+7.693 4，R2=0.996 7，可信度較高。

2.1.2 不同濃度綠原酸對布氏乳桿菌生長的影響（見圖2）

由圖2a 可知，2.0 mg/ml 杜仲綠原酸使布氏乳桿菌生長曲線達到對數(shù)生長期最高活菌數(shù)的時間為12 h；1.0、0.5 mg/ml 杜仲綠原酸使布氏乳桿菌生長曲線達到對數(shù)生長期最高活菌數(shù)的時間為10 h，且活菌數(shù)均高于2.0 mg/ml 杜仲綠原酸組。2.0、1.0、0.5 mg/ml 杜仲綠原酸使布氏乳桿菌生長曲線達到平臺期的活菌數(shù)均高于布氏乳桿菌菌液組。表明這3 個濃度的杜仲綠原酸均能促進布氏乳桿菌的增殖。

由圖2b 可知，1.0、0.5 mg/ml 甜葉菊綠原酸使布氏乳桿菌生長曲線達到對數(shù)生長期最高活菌數(shù)的時間為12 h。4.0 mg/ml 甜葉菊綠原酸中活菌數(shù)明顯低于其他各組，說明4.0 mg/ml 甜葉菊綠原酸對布氏乳桿菌的生長有明顯抑制作用。1.0、0.5 mg/ml 甜葉菊綠原酸使布氏乳桿菌生長曲線達到平臺期的活菌數(shù)均高于布氏乳桿菌菌液組，表明這2個濃度的甜葉菊綠原酸皆能在體外促進布氏乳桿菌的增殖。

圖1 標準曲線

圖2 不同濃度綠原酸對布氏乳桿菌生長的影響

經(jīng)比較甜葉菊綠原酸和杜仲綠原酸對布氏乳桿菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)1.0、0.5 mg/ml 甜葉菊綠原酸比1.0、0.5 mg/ml 杜仲綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵的對數(shù)生長期延長了2 h，為布氏乳桿菌在平臺期的生長積聚了能量。

2.1.3 不同濃度綠原酸對布氏乳桿菌菌液pH值的影響（見圖3）

由圖3 可知，綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵，各組初始pH 值差異不明顯。同一時間段，與布氏乳桿菌菌液組和丙酮溶劑組相比，加入綠原酸的菌液pH值大部分降低。由于發(fā)酵過程中綠原酸會促進布氏乳桿菌的生長，活菌數(shù)增多，導致乳酸增多，同時綠原酸在乳酸菌的發(fā)酵過程中，會有一部分轉(zhuǎn)變成溶于水的咖啡酸和奎寧酸[19]，因此除4 mg/ml 甜葉菊綠原酸組pH 值較高，其他各組pH 值均下降較快，且大部分低于布氏乳桿菌菌液組和丙酮溶劑組。

通過評價布氏乳桿菌對數(shù)期的保持時間、平臺期布氏乳桿菌的活菌數(shù)，我們選擇終濃度為1.0、0.5 mg/ml甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同作用8 h的發(fā)酵液進行下一步臨床試驗。

2.2 甜葉菊綠原酸發(fā)酵液對雛雞的保護作用

2.2.1 大腸桿菌感染劑量確定（見表5）

根據(jù)改良寇氏法[20]：

式中：Xm——最大劑量的對數(shù)；

i——相鄰兩組對數(shù)劑量的差值；

p——各組動物死亡率（%）；

Pm——最大死亡率（%）；

Pn——最小死亡率（%）。

由表5 可知，大腸桿菌O78對雛雞的半數(shù)致死量LD50=1×108cfu/ml，即1×108cfu/ml 為最佳的感染劑量。

圖3 不同濃度綠原酸對布氏乳桿菌菌液pH值的影響

表5 大腸桿菌感染劑量確定

2.2.2 臨床保護試驗（見圖4）

圖4 臨床保護試驗雛雞死亡率對比分析

由圖4可知，Ⅰ組為對照組，雛雞死亡率最低；Ⅱ組雛雞死亡率最高，表明大腸桿菌感染成功；Ⅲ組為溶劑組，與Ⅱ組相比無顯著差異（P＞0.05）；Ⅴ組與Ⅳ組相比，雛雞死亡率較低；Ⅴ組與Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ組相比較，雛雞死亡率顯著降低（P＜0.05）。說明甜葉菊綠原酸和布氏乳桿菌協(xié)同發(fā)酵液對雛雞保護作用優(yōu)于單獨使用甜葉菊綠原酸的效果，其中Ⅴ組的保護效果最好。

2.2.3 含藥血清抑菌結果（見圖5）

由圖5可知，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的含藥血清對大腸桿菌的抑菌效果均不明顯，Ⅴ組的抑菌圈最明顯，但抑菌圈直徑很小，判定為陰性。

2.2.4 盲腸腸道菌群檢測（見表6）

由表6 可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組雛雞盲腸中乳酸菌、雙歧桿菌、乳桿菌的數(shù)量均顯著減少，大腸桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），表明大腸桿菌侵入雛雞體內(nèi)造成腸道菌群紊亂；與Ⅰ組相比，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ組雛雞盲腸中乳酸菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），Ⅴ、Ⅷ組雛雞盲腸中雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組雛雞盲腸中乳桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ組雛雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。其中Ⅴ組雛雞盲腸中乳酸菌、雙歧桿菌、乳桿菌的數(shù)量最多，大腸桿菌的數(shù)量最少。說明甜葉菊綠原酸和布氏乳桿菌協(xié)同發(fā)酵液對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于單純綠原酸的調(diào)節(jié)效果，且Ⅴ組對雛雞盲腸腸道菌群的調(diào)節(jié)效果最好。

綜上所述，濃度為1.0 mg/ml的甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同作用8 h的發(fā)酵液臨床應用效果最佳。

3 討論

3.1 甜葉菊綠原酸對布氏乳桿菌的促生長作用

圖5 含藥血清對大腸桿菌的抑菌作用

表6 雛雞盲腸菌群檢測結果（×109 cfu/g）

布氏乳桿菌具有益生作用，改善腸道菌群等多種功能[21]；綠原酸與布氏乳桿菌相互作用具有補益扶助作用[22]。因此我們推測甜葉菊綠原酸可以作為布氏乳桿菌的益生元，為了證實這一假設，通過分析生長曲線，實時監(jiān)測甜葉菊綠原酸在不同時間點對布氏乳桿菌生長的影響。結果表明，甜葉菊綠原酸可以在體外促進布氏乳酸桿菌的生長，通過分析生長曲線可以發(fā)現(xiàn)，加入甜葉菊綠原酸后，布氏乳桿菌的延滯期有所延長。細菌的延滯期是細菌剛接入到新鮮培養(yǎng)液后，生長速度接近于0 的一段時間，被認為是代謝系統(tǒng)正在適應新環(huán)境[23]。因此當在培養(yǎng)基中加入不同濃度的甜葉菊綠原酸時，造成了新的環(huán)境，需要時間適應，因而延長了各組的延滯期。其中濃度越高的甜葉菊綠原酸，對布氏乳桿菌的促進作用不如低濃度的效果好，可能是由于高濃度甜葉菊綠原酸對腸道中乳酸菌的增殖有抑制作用。適宜濃度的甜葉菊綠原酸可以促進布氏乳桿菌的增殖，延長對數(shù)生長期。此外由于綠原酸不易溶解，試驗中選擇了丙酮作為溶劑，對布氏乳桿菌的生長和動物發(fā)育暫未發(fā)現(xiàn)異常，但丙酮為有毒物質(zhì)存在危害，因此還需要進一步試驗確定適合的溶劑。

3.2 甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌的協(xié)同作用

甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵具有很多方面的互補作用，①布氏乳桿菌代謝產(chǎn)生的多種酶，可以將不能被畜禽吸收利用的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為藥理活性較高的小分子物質(zhì)，可以使甜葉菊綠原酸有效成分最大限度地釋放，這些酶類，如纖維素酶、脂肪酶等，可以使其毒副作用降低[24]。②甜葉菊綠原酸作為中藥，其中的一些成分還可以作為益生元，促進布氏乳桿菌的增殖，抑制有害菌生長，起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用?？傊鹑~菊綠原酸和布氏乳桿菌的協(xié)同使用會起增效作用，提高動物機體的免疫力。③綠原酸在動物體內(nèi)的吸收與機體腸道菌群多樣性具有依賴性[9]，二者共同發(fā)酵可以促進綠原酸在腸道內(nèi)的吸收。本研究結果表明，甜葉菊綠原酸可以促進布氏乳桿菌的生長，布氏乳桿菌可以促進甜葉菊綠原酸的吸收，二者協(xié)同發(fā)酵可以顯著增強對雛雞感染大腸桿菌的保護作用，死亡率明顯降低，但是含藥血清對大腸桿菌沒有明顯的抑菌作用，這和尹良軍等[25]的研究結果不一致，也許和采血時間、甜葉菊綠原酸的來源、提取方法以及溶劑不同有關，這需要進一步證實。但是甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵產(chǎn)物對雛雞盲腸腸道菌群具有顯著的調(diào)節(jié)作用，因此，甜葉菊綠原酸發(fā)酵液具有一定的開發(fā)和應用價值。綠原酸與其他菌種是否也具有協(xié)同作用且效果優(yōu)于布氏乳桿菌，還需我們進一步研究。

4 結論

①甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵效果優(yōu)于與杜仲綠原酸共同發(fā)酵。

②濃度為1.0 mg/ml的甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同作用8 h的發(fā)酵液臨床應用效果最佳。可延長對數(shù)生長期，增加活菌數(shù)量，促進腸道中乳酸菌、乳桿菌、雙歧桿菌生長，抑制大腸桿菌增殖，有效地對腸道菌群進行調(diào)節(jié)。

③甜葉菊綠原酸發(fā)酵液可降低雛雞大腸桿菌感染的死亡率，但含藥血清沒有明顯的抑菌效果。表明甜葉菊綠原酸發(fā)酵液可以促進雛雞腸道有益菌群的增殖，提高動物機體的免疫力。