黃璐瑤，杜艷瑜，陸曉丹，梁鵬,3*，陳麗嬌,3，程文健,3

1(福建農(nóng)林大學 食品科學學院，福建 福州，350002) 2(閩臺特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建 福州，350002) 3(福建省海洋生物技術重點實驗室，福建 福州，350002)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是中國重要經(jīng)濟魚類之一，主要分布于福建省沿海地區(qū)，因其味道鮮美且易于烹飪而廣受消費者們喜愛[1]。據(jù)2019年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒記載[2]，我國海水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量共計141.94萬t，其中大黃魚總產(chǎn)量為17.76萬t，位居養(yǎng)殖海水魚類產(chǎn)量第一。大黃魚魚卵是大黃魚加工過程中的主要副產(chǎn)物，有研究發(fā)現(xiàn)[3]大黃魚魚卵中富含DHA和EPA型磷脂(large yellow croaker roe phospholipids, LYCRPLs)，而DHA與EPA是人體不可缺少的重要營養(yǎng)素[4]。

已有研究表明，磷脂(phospholipids,PLs)具有良好的乳化能力，KOMAIKO等[5]發(fā)現(xiàn)，向日葵磷脂可以作為一種有效的天然乳化劑；DONSI等[6]使用大豆卵磷脂成功制備出穩(wěn)定的乳狀液。此外，MCCLEMENTS等[7]比較了不同天然乳化劑(大豆卵磷脂、乳清蛋白和阿拉伯膠)對制備玉米水包油乳液的影響。LYCRPLs富含DHA和EPA型磷脂，但目前關于LYCRPLs乳化效果的研究鮮見報道。

姜黃素是從姜黃(CurcumalongaLinn)植物的根系中提取所得[8]，其具備多種生物活性，如抗氧化[9]、抗腫瘤[10]和抗炎[11]等。因此，姜黃素在食品添加劑和醫(yī)學領域有著廣闊的應用前景。然而，姜黃素是一種疏水性物質(zhì)，低水溶性和光照不穩(wěn)定性嚴重限制了其在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的應用[12]。部分研究表明，水包油型乳液能夠有效提升姜黃素的生物利用度[13-15]。

為進一步拓展水產(chǎn)品中磷脂用途，本研究以姜黃素為乳化對象，以乳液粒徑和穩(wěn)定性為指標，考察大黃魚魚卵磷脂的乳化功能。在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化乳液制備工藝，對乳液進行初步表征后，進一步考察大黃魚魚卵磷脂-姜黃素乳液的貯藏穩(wěn)定性。研究結果有助于進一步拓展水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素(curcumin，純度≥97%)，河北天旭生物科技有限公司；新鮮大黃魚魚卵，福建宇輝食品實業(yè)有限公司；玉米油，益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司。95%乙醇、正己烷、丙酮，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LGJ-12S型真空冷凍干燥機，北京松源華興生物技術有限公司；HN-3K型手持均質(zhì)機，上海汗諾儀器有限公司；FB-110Q型超高壓均質(zhì)機，上海勵途超高壓設備有限公司；Nano-ZS90型馬爾文激光粒度儀，英國Malvern 公司；LUMiFuge-111型全自動穩(wěn)定性分析儀，德國LUM公司；HT770型透射電子顯微鏡，日本Hitachi公司；RO15型純水機，上?？道追治鰞x器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大黃魚魚卵磷脂的提取

稱取一定量的凍干大黃魚魚卵[水分含量(1.0±0.005)%]，加入體積分數(shù)為95%乙醇并在室溫下攪拌2 h后抽濾，所得濾液加入適量的正己烷并2次提取，再次重復得到濾液后進行合并濾液，將濾液旋蒸得到總脂質(zhì)溶解于冷丙酮中，放置過夜可得白色沉淀物，即為實驗用磷脂樣品，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大黃魚魚卵磷脂-姜黃素乳液的制備

在室溫條件下，將一定量的姜黃素溶解于玉米油中，磁力攪拌器攪拌2 h后使用0.45 μm的濾膜對玉米油溶液進行過濾，得到姜黃素油相；將LYCRPLs與去離子水按比例溶解(將4 g LYCRPLs溶于100 mL去離子水)，使用磁力攪拌器攪拌2 h，得到水相。將姜黃素油相與水相按不同的比例[V(油相)∶V(水相)=15∶85]混合攪拌均勻(磁力攪拌1 h)后，使用手持均質(zhì)機(20 000 r/min)均質(zhì)5 min得到姜黃素粗乳液。最后將粗乳液加入到超高壓均質(zhì)機中均質(zhì)，得到姜黃素乳液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.3 乳液粒徑測定

將制備好的大黃魚魚卵磷脂-姜黃素乳液使用去離子水稀釋500倍后，取一定量裝入比色皿中，采用激光粒度儀進行粒徑尺寸的測定，重復3次。

1.3.4 乳液穩(wěn)定性測定

使用全自動穩(wěn)定性分析儀測定乳液的穩(wěn)定性，測定結果以澄清指數(shù)表示，澄清指數(shù)數(shù)值越接近于0則表示乳液穩(wěn)定性良好，反之則表示乳液穩(wěn)定性較差。操作溫度20 ℃，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，時間10 min。

1.3.5 單因素試驗

在室溫條件下，分別考察均質(zhì)壓力(10、25、40、60、80 MPa)、均質(zhì)時間(20、60、80、100、140 s)、LYCRPLs添加量(質(zhì)量分數(shù)為：2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%)和油相比例(5%、10%、15%、20%、25%)4個因素對姜黃素乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響。

1.3.6 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，選取均質(zhì)壓力、均質(zhì)時間、LYCRPLs添加量和油相比例4個因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計4因素5水平的響應面優(yōu)化試驗，對LYCRPLs乳化姜黃素工藝進行優(yōu)化，各因素編碼與水平如表1所示。

表1 響應面試驗設計因素編碼及水平表

1.3.7 透射電鏡觀察

使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)對最優(yōu)制備工藝條件下的LYCRPLs-姜黃素乳液粒子形態(tài)進行觀察。在進行透射電鏡觀察之前，用去離子水將乳液稀釋到一定濃度，吸取適量的乳液，滴加到覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上，等待1 min，使用濾紙吸干多余的液體。再使用10 g/L磷鎢酸鹽對銅網(wǎng)進行染色1 min，在室溫下自然干燥，最后進行透射電鏡觀察。

1.3.8 乳液貯藏穩(wěn)定性研究

根據(jù)響應面優(yōu)化試驗得出的最優(yōu)工藝條件制備LYCRPLs-姜黃素乳液，分別在5、25和55 ℃下貯藏28 d，每7 d測定乳液的粒徑并對樣品外觀進行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3次，結果取平均值。采用IBM SPSS Statistics 20軟件進行統(tǒng)計分析，Origin 2017軟件進行繪圖，Design-Expert 10.0.7軟件進行試驗設計及方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 均質(zhì)壓力對LYCRPLs-姜黃素乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響

如圖1所示，隨著均質(zhì)壓力的增大，LYCRPLs-姜黃素乳液的粒徑和澄清指數(shù)均呈現(xiàn)減小趨勢(P<0.05)。這是由于均質(zhì)壓力越大，產(chǎn)生的剪切力和作用強度越大，其均質(zhì)效果越好[16]。較低的粒徑和澄清指數(shù)值代表乳液的品質(zhì)較好，但在試驗過程中，當均質(zhì)壓力超過60 MPa時，儀器內(nèi)部溫度隨著壓力的增大而升高，對乳液的品質(zhì)造成不良影響。因此，選擇均質(zhì)壓力60 MPa進行響應面優(yōu)化試驗。

圖1 均質(zhì)壓力對LYCRPLs-姜黃素乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響

2.1.2 均質(zhì)時間對LYCRPLs-姜黃素乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響

如圖2所示，均質(zhì)時間對乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響與均質(zhì)壓力基本一致，隨著均質(zhì)時間的增加，乳液的粒徑與澄清指數(shù)值越低，顯示出良好的穩(wěn)定性。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因主要是均質(zhì)機對乳液的均質(zhì)作用能夠隨著時間的延長而更加充分，使水相與油相更好地結合，有效降低分散物尺度，提高乳液分布均勻性[17]?？紤]到隨著均質(zhì)時間的延長，均質(zhì)設備的處理溫度隨之增加，為了避免高溫對乳液品質(zhì)造成不良影響，因而選擇均質(zhì)時間為100 s進行響應面優(yōu)化試驗。

圖2 均質(zhì)時間對LYCRPLs-姜黃素乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響

2.1.3 LYCRPLs添加量對姜黃素乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，在LYCRPLs添加量為2.0%～4.0%，乳液的粒徑隨LYCRPLs添加量的增加而減小，當LYCRPLs添加量為4.0%時達到最低，而后顯著增加(P<0.05)。導致這一現(xiàn)象的原因可能是在一定范圍內(nèi)，乳化劑的添加量越多形成的膠束濃度越大，膠束中單體濃度降低，因此粒徑減小。而過量添加乳化劑會使乳液中生成的粒子數(shù)過多，乳膠粒單位面積覆蓋乳化劑不足而導致凝聚現(xiàn)象，從而導致粒徑增大[18]。然而，乳液的澄清指數(shù)值隨著LYCRPLs添加量的增加而逐漸減小，LYCRPLs添加量超過4.0%時，澄清指數(shù)無顯著性變化(P<0.05)。這是因為乳化劑的加入降低了水-油界面的界面張力，賦予乳液良好的穩(wěn)定性[19]。綜合考慮LYCRPLs添加量對乳液粒徑與穩(wěn)定性的影響，選擇LYCRPLs添加量為4.0%。

圖3 LYCRPLs添加量對姜黃素乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響

2.1.4 油相比例對大黃魚魚卵磷脂-姜黃素乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響

如圖4所示，隨著油相比例的逐漸增加，乳液粒徑呈先減小后增大的趨勢，而澄清指數(shù)值則不斷減小，這是因為油濃度的增加降低了乳液的表面張力，增強了乳液的穩(wěn)定性。乳化劑在乳液生產(chǎn)過程中，覆蓋在油滴表面以形成均勻、穩(wěn)定的粒子，油相濃度的升高導致所需的乳化劑濃度增加，因此當油相比例不斷增加，固定的乳化劑濃度不足以覆蓋油滴表面，最后導致乳液粒徑的增大[20]。因此，選擇油相比例為15%最佳。

圖4 油相比例對姜黃素乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 Box-Behnken 中心組合試驗方案

在單因素試驗的基礎上，選取均質(zhì)壓力(A)、均質(zhì)時間(B)、LYCRPLs添加量(C)和油相比例(D)4個因素為自變量，以LYCRPLs-姜黃素乳液的粒徑(Y1)為響應值，設計4因素5水平的響應面優(yōu)化試驗。試驗設計方案與結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計與結果

2.2.2 響應面模型方程及方差分析

根據(jù)表2所得的試驗數(shù)據(jù)，采用Design-Expert 10.0.7軟件計算二次多項式方程的系數(shù)，并預測出大黃魚魚卵磷脂-姜黃素乳液的粒徑。二次回歸方程如下：Y1=+0.25-0.015A-0.013B-0.004C+0.007D+0.005AB-0.004AC+0.010AD+0.006BC-0.010BD-0.005CD+0.006A2+0.006B2+0.005C2+0.007D2。方程中各因素的系數(shù)絕對值表示影響程度。此外，對回歸方程模型進行方差分析，結果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析

由表3的方差分析結果可知，二次多項式模型與實驗數(shù)據(jù)的擬合度良好，模型極顯著(P<0.001)，模型的回歸系數(shù)與校正系數(shù)分別為0.977 6和0.956 7，且失擬項不顯著(P>0.05)，說明該試驗模型在統(tǒng)計學上是準確可行的，通過響應面試驗設計得到的二次多項模型可以描述所研究的自變量對響應變量的影響，可用于解釋95.67%情況下關鍵因素對乳液粒徑的影響，能夠有效優(yōu)化LYCRPLs-姜黃素乳液的制備工藝。此外，各因素及其交互作用對乳液粒徑的影響顯著性各不相同。其中，一次項A、B、D，交互項AD、BC、BD和二次項A2、B2、C2、D2對乳液粒徑的影響極顯著(P<0.001)；一次項C，交互項AB、AC和CD對乳液粒徑的影響高度顯著(P<0.01)。通過比較各因素的F值可知影響程度依次為：均質(zhì)壓力>均質(zhì)時間>油相比例>LYCRPLs添加量。

2.2.3 響應面交互作用分析

4個因素(均質(zhì)壓力、均質(zhì)時間、LYCRPLs添加量和油相比例)對模型響應值的交互作用。通過這些三維響應面圖能夠直觀地判斷出各因素間的交互作用對乳液粒徑的影響程度。從圖5可知，均質(zhì)壓力、均質(zhì)時間、LYCRPLs添加量和油相比例這4個因素間的兩兩交互作用對姜黃素乳液的粒徑均有著顯著影響，其中，油相比例和均質(zhì)時間的交互作用最強(圖5-E)。隨著均質(zhì)壓力、均質(zhì)時間與LYCRPLs添加量的增加，乳液粒徑逐漸降低，這是因為均質(zhì)剪切作用力不斷增強導致的；而油相比例越高，乳液粒徑反而增大[21]。這一現(xiàn)象與先前的單因素試驗中所得的結果一致，同時也與表3中的方差分析結果吻合。

圖5 各因素對姜黃素乳液粒徑交互作用的響應面圖

2.2.4 最優(yōu)工藝的確定及驗證試驗

LYCRPLs-姜黃素乳液最優(yōu)制備工藝條件為：均質(zhì)壓力72.4105 MPa、均質(zhì)時間101 s、LYCRPLs添加量4.275%、油相比例12.89%，該條件下的姜黃素乳液粒徑為0.228 μm。由于儀器操作的可行性，修正試驗條件為：均質(zhì)壓力72.4 MPa、均質(zhì)時間101 s、LYCRPLs添加量4.275%、油相比例12.89%。在該條件下進行3次平行試驗后測得乳液粒徑為(0.216±0.005 9) μm，表明通過響應面法能夠有效優(yōu)化LYCRPLs-姜黃素乳液制備工藝。

2.3 大黃魚魚卵磷脂-姜黃素乳液表征

通過透射電鏡對最優(yōu)制備工藝條件下的LYCRPLs-姜黃素乳液顆粒形態(tài)進行表征，結果如圖6所示。在30.0 k電鏡條件下觀察到乳液顆粒近似球形且無聚結等不良現(xiàn)象(圖6-a)，進一步在60.0 k電鏡條件下觀察顆粒結構，能夠直觀且清晰地看到搭載了姜黃素的油相被水相包封(圖6-b)，這與LI等[22]的研究報道一致。本結果表明LYCRPLs可覆蓋于乳液油-水界面，使互不相溶的兩相結合，制備出具有小粒徑的水包油乳液。

a-×30 k;b-×60 k

2.4 乳液貯藏穩(wěn)定性研究

實驗進一步考察了LYCRPLs-大黃魚魚卵磷脂-姜黃素乳液的貯藏穩(wěn)定性，圖7呈現(xiàn)了LYCRPLs-大黃魚魚卵磷脂-姜黃素乳液的粒徑變化和外觀變化。

圖7 LYCRPLs-姜黃素乳液在貯藏過程中的外觀(a)和粒徑(b)變化

由圖7-a可知，第0天時的乳液分布均勻，但從第14天開始，55 ℃下的乳液開始褪色，可能是由于高溫引起的姜黃素氧化反應[23]，且55 ℃下的乳液從第21天開始出現(xiàn)油水分離現(xiàn)象，而5和25 ℃下貯藏的乳液仍保持穩(wěn)定狀態(tài)。此外，圖7-b中顯示了在3種不同溫度貯藏過程中，乳液的粒徑均呈增大趨勢，認為該現(xiàn)象與奧斯特瓦爾德熟化作用有關，隨著貯藏時間的延長，乳液品質(zhì)發(fā)生變化，粒徑不斷增大[24]。以上結果表明，LYCRPLs-大黃魚魚卵磷脂-姜黃素乳液能夠在5和25 ℃條件下保持較長時間的穩(wěn)定性，而在高溫條件下較不穩(wěn)定。

3 結論

本研究以姜黃素為對象，考察了大黃魚魚卵磷脂對其乳化效果，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優(yōu)化了大黃魚魚卵磷脂乳化姜黃素的工藝條件。研究結果表明，大黃魚魚卵磷脂具有較優(yōu)的乳化能力，且貯藏穩(wěn)定性良好。課題組下一步將著重開展大黃魚魚卵磷脂協(xié)同姜黃素的營養(yǎng)價值方面的研究，旨在推動大黃魚產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。