基于雙氨基粘土絮凝的嗜熱微藻采收實(shí)驗(yàn)研究

張海若， 陳鵬宇， 梁園梅， Maurycy Daroch

（北京大學(xué)深圳研究生院 環(huán)境與能源學(xué)院， 廣東 深圳 518055）

0 引言

微藻是地球上重要的初級生產(chǎn)者， 具有個體微小、種類繁多、光合效率高、生長速度快、生長周期短等優(yōu)點(diǎn)， 并能夠?qū)⒐饽芎投趸嫁D(zhuǎn)化為多種高附加值產(chǎn)品，如藻藍(lán)蛋白、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素等[1]，[2]。 微藻可以在生活及工業(yè)廢水中生長并有效去除廢水中的重金屬離子。隨著化石燃料的日益枯竭，利用微藻生產(chǎn)生物柴油是國內(nèi)外研究者普遍關(guān)注的重要技術(shù)之一[3]。

雖然微藻有十分廣闊的應(yīng)用前景， 但是，微藻的分離、 采收一直是一個基礎(chǔ)性技術(shù)難題，嚴(yán)重限制了微藻的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。 微藻細(xì)胞個體小（2～40 μm）、易破裂，且?guī)ж?fù)電的微藻細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，微藻的采收成本占整個微藻生產(chǎn)（包括采收和養(yǎng)殖）總成本的20%～30%，甚至更高。因此，尋找一種低成本、高效率的采收方法成為微藻開發(fā)應(yīng)用的關(guān)鍵。 收獲微藻的傳統(tǒng)方法包括過濾、離心、絮凝、浮選、超聲和電解法等[4]，[5]。 然而，對于大規(guī)模收獲微藻而言，這些方法都存在一定的缺點(diǎn)，如過濾法易堵塞濾膜、浮選和離心方法能耗較高、 超聲和電解法能耗高且效率低。絮凝采收微藻是通過電中和、 架橋及網(wǎng)捕作用，使分散的帶電荷藻細(xì)胞聚集， 從而實(shí)現(xiàn)固液分離，具有成本低、操作簡便的特點(diǎn)，成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)[5]。

氨基有機(jī)硅酸鹽（簡稱氨基粘土）由金屬鹽和有機(jī)三烷氧基硅烷在室溫下合成， 屬于有機(jī)-無機(jī)納米雜化材料，其作為絮凝劑逐漸引起人們的關(guān)注[6]。Lee Y C[7]將鎂氨基酸鹽（MgAC）用于收獲含油的小球藻屬，在30 min 內(nèi)，小球藻屬的收獲效率可達(dá)100%。Farooq W[8]使用單一的鎂或鐵氨基酸鹽（MgAC 或FeAC ）在短時間內(nèi)收獲了大量微藻。 Ji H M[9]將不同粒徑的[MgAC]和[CeAC]的混合物用于收獲濃度極低的藍(lán)藻， 在1 h 內(nèi)，藍(lán)藻的收獲效率為100%。然而，對于平臺期質(zhì)量濃度較高的藻種來說，并沒有相關(guān)的研究，因此，探究雙氨基酸粘土能否高效采收質(zhì)量濃度較高的藻種，并降低其工藝成本，將有利于藻種的開發(fā)與應(yīng)用。

本研究將雙氨基粘土（[MgAC]和[CeAC]的混合物）作為絮凝劑，通過觀察采收效果，進(jìn)一步研究了[MgAC]和[CeAC]的配用比例和絮凝時間對采收效果的影響， 最終確定了絮凝劑的最佳配用比例和絮凝時間， 為嗜熱微藻采收提供了理論依據(jù)和方法支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藻種和培養(yǎng)基

嗜熱藍(lán)藻PKUAC-E542 （富含藻藍(lán)蛋白）由北京大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院生物質(zhì)能源實(shí)驗(yàn)室采集、分離并保存，藻細(xì)胞大小為4～15 μm[10]。 藻種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為BG11 液體培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器設(shè)備

Epoch 微孔板分光光度計 （BioTech 公司）、Olympus BX53 顯微鏡（OLYMPUS 公司）、高速離心機(jī) （Eppendorf 公司）、Milli-Q 去離子凈水機(jī)（Millipore 公司）、PB－10 標(biāo)準(zhǔn)型pH 計（Sartorius公司）、BSA124S-CM 分析電子天平 （Sartorius 公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、BX-2F 恒溫磁力攪拌器（常州普天儀器制造有限公司）、PS-80AL 超聲清洗儀（深圳市超藝達(dá)科技有限公司）等。

1.1.3 主要試劑

3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，分析純）、氯化鎂六水合物（MgCl2·6H2O，分析純）、氯化鈰七水合物（CeCl3·7H2O，分析純）、氯化鐵六水合物（FeCl3·6H2O，分析純）、乙醇（C2H5OH，分析純）、蒸餾去離子水（Millipore）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

圖1 為室外光生物反應(yīng)器。

圖1 室外光生物反應(yīng)器Fig.1 Outdoor photobioreactor

將2 L 藻種于發(fā)酵罐（直徑為12 cm，高度為50 cm）中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)過程中通入空氣并持續(xù)攪拌，使用自然光源，培養(yǎng)溫度為45 ℃。待嗜熱藍(lán)藻生長至指數(shù)生長中期進(jìn)行擴(kuò)培，將藻種接種至容積為50 L 的光生物反應(yīng)器（直徑為25 cm，高度為100 cm）中曝氣培養(yǎng)，通入氣體為空氣，反應(yīng)器置于室外。 培養(yǎng)過程中仍采用自然光源， 每日中午12：00 測量記錄其吸光度（OD），并記錄每日溫度及輻射量。 培養(yǎng)8 d，繪制生長曲線并收集藻液用于微藻絮凝實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 微藻質(zhì)量濃度和細(xì)胞密度與吸光度的關(guān)系測定

取適量藻液， 用干重法建立嗜熱藍(lán)藻的質(zhì)量濃度和吸光度的對應(yīng)關(guān)系，結(jié)果如圖2 所示。從圖2 可以看出， 嗜熱藍(lán)藻的質(zhì)量濃度與吸光度有較高的擬合關(guān)系， 在一定濃度范圍內(nèi)可用吸光度（OD685nm）代替微藻的質(zhì)量濃度[11]。 從圖2 還可以看出，嗜熱藍(lán)藻的細(xì)胞密度（細(xì)胞數(shù)目）也與吸光度具有較好的擬合關(guān)系。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線Fig.2 Standard concentration curve

1.2.3 雙氨基粘土絮凝劑的制備

分別稱取8.4 g MgCl2-6H2O 和CeCl3-7H2O溶解在200 mL 乙醇溶液中，磁力攪拌10 min 后，滴加約13 mL 的APTES，使APTES 中Si 與Mg/Ce的比例達(dá)到1∶1.34，然后磁力攪拌溶液12 h，得到白色漿狀的MgAC 和黃色漿狀的CeAC； 將兩種漿料以3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心15 min， 再用100 mL 乙醇溶液洗滌兩次， 在設(shè)定溫度為60 ℃的烘箱中干燥24 h；干燥后，可獲得礫石狀的MgAC 和CeAC；將MgAC 和CeAC 研磨成粉末，分別稱取1 g MgAC 和CeAC 粉末于100 mL 錐形瓶中，加入100 mL 去離子水， 再通過超聲浴處理10 min，得到分散均勻的濃度為10 mg/mL 的MgAC 和CeAC 懸浮液。

將MgAC 和CeAC 懸浮液在超聲浴中以不同比例 （1∶0，1∶1，1∶2，1∶5，1∶8，0∶1，2∶1，5∶1 和8∶1）混合至均勻， 得到9 種不同混合比例的雙氨基粘土絮凝劑（[ACs]混合物）。

1.2.4 絮凝試驗(yàn)

取不同混合比例的[ACs]混合物各1 mL，分別加入裝有9 mL 嗜熱藍(lán)藻藻液的離心管中，將藻液與[ACs]混合物混合至均勻，每種比例設(shè)置3 組平行樣品，空白對照組中加入1 mL 去離子水。 采用分光光度計法， 在不同的時間間隔（0，20，40，60，90，120 min） 距離樣品溶液頂部的5 cm 處取樣，測量其在685 nm 處的OD，并根據(jù)式（1）計算絮凝效率。

式中：R 為絮凝效率，%；ODO為初始藻液的吸光度；ODf為絮凝后上清液的吸光度。

1.2.5 細(xì)胞密度對絮凝效率的影響

已知本研究中的嗜熱藍(lán)藻的細(xì)胞密度與OD之間具有線性關(guān)系， 設(shè)置5 組不同的OD685nm（2.5，2，1.5，1，0.5），每組設(shè)3 個平行樣品，選擇絮凝效果最佳的一種[ACs]混合物配比，將該配比的[ACs]混合物分別加入樣品藻液中，測量0，20，40，60，90，120 min 內(nèi)各樣品的OD685nm， 并計算絮凝效率， 從而探究嗜熱藍(lán)藻的細(xì)胞密度對絮凝效果的影響。

1.2.6 藻液pH 值對絮凝體系的影響

有研究表明，在微藻培養(yǎng)過程中，由于微藻自身合成的糖苷或多糖等絮凝活性物質(zhì)分泌到細(xì)胞表面， 與周圍的藻細(xì)胞相互作用會引發(fā)細(xì)胞自絮凝現(xiàn)象[12]。 在微藻培養(yǎng)過程中，藻液pH值等因素的變化會對藻細(xì)胞的自絮凝現(xiàn)象產(chǎn)生影響， 即一些藻種在藻液pH 值較高的條件下會發(fā)生自絮凝現(xiàn)象，為排除[ACs]混合物自身pH值對實(shí)驗(yàn)的影響，測量不同混合比例的[ACs]混合物及藻液的初始pH，并在加入[ACs]混合物沉降20 min 后測量此時藻液的pH 值， 分析藻液pH 值的變化是否會對藻細(xì)胞的絮凝效果產(chǎn)生影響。

1.2.7 顯微鏡觀察

分別取各實(shí)驗(yàn)組藻液絮凝2 h 后的底部絮凝層，制作臨時標(biāo)本，利用顯微鏡觀察絮凝后藻細(xì)胞的絮凝狀態(tài)及生理活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙氨基粘土體系的絮凝效率

加入[ACs]混合物20 min 時，各實(shí)驗(yàn)組的絮凝效果如圖3 所示。 從圖3 可以看出：各實(shí)驗(yàn)組的絮凝效果差別較大，當(dāng)[MgAC]和[CeAC]的配用比例分別為1∶1，1∶2，2∶1，5∶1 和8∶1 時，大部分微藻已經(jīng)沉淀在離心管底部， 上清液顏色較為透明，絮凝效果均較好；當(dāng)[MgAC]和[CeAC]的配用比例為1∶0 和1∶5 時， 部分微藻沉淀在離心管底部，上清液較為渾濁，即仍有大量微藻懸浮于培養(yǎng)液中，絮凝效果一般；當(dāng)[MgAC]和[CeAC]的配用比例為0∶1 和1∶8 時，絮凝效果較差，離心管底部未見明顯的微藻沉降， 與空白對照組相比，并無太大差異。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組的絮凝效果Fig.3 Flocculation effect of each experimental group

將2 h 內(nèi)微藻動力學(xué)收獲結(jié)果繪制成圖4。從圖4 可以看出，在20 min 內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組的絮凝效率均逐漸增大，最大可達(dá)75%，最小僅為5%，當(dāng)絮凝時間超過20 min 后，各實(shí)驗(yàn)組的絮凝效率基本保持不變。

圖4 絮凝效率隨[ACs]配比的變化Fig.4 Variation of flocculation efficiency over [ACs] ratio

與空白對照組相比，加入[ACs]混合物的實(shí)驗(yàn)組的絮凝效率均有不同程度的增加。 這是因?yàn)榘被惩林械馁|(zhì)子化胺基團(tuán)起到帶正電荷的納米團(tuán)簇作用，可與帶有負(fù)電荷的微藻細(xì)胞進(jìn)行橋接，通過靜電作用使微藻細(xì)胞聚集沉降下來。同時，加入不同比例[ACs]混合物的實(shí)驗(yàn)組的絮凝效果有很大差別。 有研究表明，兩種不同尺寸的[ACs]在各自的水溶液中具有10～1 000 nm 的粒度分布[9]。不同的[ACs]混合比例使之形成緊密程度不同的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。從圖4 還可以看出：當(dāng)[MgAC]和[CeAC]的比例為0∶1 時， 微藻的絮凝效率僅為5%左右，與空白對照組基本一致；當(dāng)僅有[MgAC]存在時，微藻的絮凝效率提高至18%，這可能是因?yàn)閇MgAC]的二維結(jié)構(gòu)為網(wǎng)狀， 且具有較高的分層程度和較小的尺寸（直徑約為30 nm）；當(dāng)[MgAC]和[CeAC]的比例為1∶8 和1∶5 時，[CeAC] 所占比例均較大，微藻的絮凝效率仍在30%以下； 當(dāng) [MgAC]和[CeAC]的比例為1∶1 時，微藻的絮凝效率突然增至60%；當(dāng)[MgAC]和[CeAC]的比例分別為8∶1，5∶1，2∶1 和1∶2 時，微藻的絮凝效果最佳，絮凝效率可達(dá)70%以上，表明在這4 種比例下，[ACs]混合物可形成緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 通過強(qiáng)大的網(wǎng)捕作用使微藻細(xì)胞團(tuán)聚沉降。

2.2 細(xì)胞密度對絮凝效率的影響

由上文可知，當(dāng)[MgAC]與[CeAC]的配比為2∶1時，微藻的絮凝效果最佳，將該配比的[ACs]混合物加入到5 組不同細(xì)胞密度的藻液中， 各組2 h內(nèi)的絮凝效率如圖5 所示。

圖5 絮凝效率隨藻種細(xì)胞密度的變化Fig.5 Variation of flocculation efficiency over cell density

從圖5 可以看出，藻液的OD685nm越低（藻液細(xì)胞密度越低），微藻的絮凝效果就越好；隨著藻液OD685nm的逐漸增大 （藻液細(xì)胞密度的增大），微藻的絮凝效率會大大降低。文獻(xiàn)[9]的研究結(jié)果也表明，雙氨基粘土絮凝劑對濃度極低（0.05～0.2 mg/mL）的微藻具有很好的收集效果。 在本研究中， 嗜熱藍(lán)藻在平臺期的OD685nm一般為1.0～1.5，因此，本實(shí)驗(yàn)選取的藻液初始OD685nm為1.5（對應(yīng)的藻液質(zhì)量濃度約為12.31 mg/mL）。 從圖5 可以看出， 對于OD685nm為1.5 的嗜熱藍(lán)藻來說， 雙氨基粘土絮凝劑仍然具有較好的絮凝效果，且此時的藻液濃度處于該種嗜熱藍(lán)藻平臺期的濃度范圍，更符合實(shí)際生產(chǎn)。但是，當(dāng)嗜熱藍(lán)藻的濃度過高時，雙氨基粘土絮凝劑的絮凝效率會大大降低，因此，微藻采收時應(yīng)注意對藻種濃度的控制。

2.3 藻液pH 值對絮凝實(shí)驗(yàn)的影響分析

不同比例的[ACs]混合物及加入[ACs]混合物后的藻液pH 值如表1 所示。 由表1 可以看出，加入[ACs]混合物后，藻液的pH 值為9.83～9.95，而藻液的初始pH 值為9.98， 由此可見，[ACs]混合物的添加基本不會影響絮凝體系的pH 值，說明絮凝現(xiàn)象并非由體系pH 值的改變所導(dǎo)致，而是基于雙氨基粘土絮凝劑（[ACs]混合物）的絮凝作用。

表1 絮凝劑初始pH 值及絮凝后藻液的pH 值Table 1 Initial pH value of flocculant and pH value of algae solution after flocculation

2.4 顯微鏡觀察

顯微鏡觀察到的絮凝后微藻細(xì)胞的絮凝狀態(tài)如圖6 所示。 從圖6 可以看出：加入[ACs]混合物的實(shí)驗(yàn)組的微藻細(xì)胞根據(jù)絮凝程度聚集成不同大小的團(tuán)狀，當(dāng)[MgAC]與[CeAC]的比例為1∶2，2∶1，5∶1 和8∶1 時， 微藻的絮凝效率較高， 在顯微鏡下呈現(xiàn)較好的團(tuán)聚狀態(tài)，100倍鏡頭下可以看到明顯的聚集帶；空白對照組的微藻細(xì)胞分布均勻，排列整齊，未見有明顯的藻細(xì)胞團(tuán)聚狀態(tài)。其他實(shí)驗(yàn)組有不同程度的聚集，但范圍和規(guī)模較小，藻細(xì)胞的排列較為松散。

圖6 絮凝后的藍(lán)藻在放大倍數(shù)為40，100，1 000 倍下的形態(tài)Fig.6 The flocculated cyanobacteria form at 40， 100 and 1 000 times magnification

2.5 安全及應(yīng)用性分析

關(guān)于[ACs]混合物的安全性，主要考慮是否會影響藻細(xì)胞的生理活性。Han H K[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，[MgAC]在所有測試的細(xì)胞中幾乎沒有細(xì)胞毒性，即使[MgAC]的濃度高達(dá)1 000 μg/mL，仍不會對細(xì)胞活力和細(xì)胞膜產(chǎn)生影響。 [CeAC]在低濃度下表現(xiàn)出很少的斑馬魚胚胎毒性[9]。 在顯微鏡觀察過程中， 可以看到各實(shí)驗(yàn)組的微藻細(xì)胞仍能進(jìn)行細(xì)胞分裂，并有小范圍的細(xì)胞活動，藻細(xì)胞仍具有生理活性， 可進(jìn)一步應(yīng)用于后續(xù)脂質(zhì)提取等開發(fā)利用。 Farooq W[14]在研究中將[MgAC]作為添加劑加入微藻培養(yǎng)基中， 研究結(jié)果表明，[MgAC]可以增加藻細(xì)胞的大小和脂質(zhì)含量。 Lee Y C[15]使用[MgAC]收獲含油小球藻，發(fā)現(xiàn)[MgAC]還可作為脂質(zhì)提取劑， 其陽離子氨基可提高脂質(zhì)提取和生物柴油轉(zhuǎn)化效率。 綜上可知，[ACs]基本不會對藻細(xì)胞的生理活性及后續(xù)開發(fā)利用產(chǎn)生影響， 并可作為添加劑與藻細(xì)胞共存，促進(jìn)藻細(xì)胞的生長。

3 結(jié)論

本文使用雙氨基粘土絮凝劑 （[MgAC]與[CeAC]的混合物）對嗜熱藍(lán)藻進(jìn)行絮凝，并研究雙氨基粘土的配比及絮凝時間對絮凝效果的影響，得到如下結(jié)論。

①當(dāng)[MgAC]與[CeAC]的配比分別為8 ∶1，5∶1，2∶1 和1∶2 時， 微藻的絮凝效率均可在20 min內(nèi)達(dá)到75%以上。

②綜合考慮經(jīng)濟(jì)性及絮凝效果，確定[MgAC]與[CeAC]的最優(yōu)配比為8∶1。

③微藻采收效率與藻液細(xì)胞密度有很大的關(guān)系， 過高的藻液細(xì)胞密度會使微藻收獲效率大大降低。

④使用雙氨基粘土絮凝微藻不會影響微藻培養(yǎng)液的pH 值，也無需調(diào)整培養(yǎng)液的pH 值；雙氨基粘土絮凝劑不影響微藻的生理活性及后續(xù)開發(fā)利用，是安全無害的絮凝劑。