段蘭蘭，董 菁，范香成，朱俊藝，張逸凡，韓吉春，尚 靖,3*

（1中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京211198；2中國藥科大學(xué)江蘇省中藥評價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京211198；3中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009）

心血管疾病是目前我國引起死亡的主要疾病之一。隨著生活水平和生活習(xí)慣的改變，我國的心血管疾病發(fā)病率也逐年升高，嚴(yán)重威脅著我國人民的健康。動脈粥樣硬化是心血管疾病中最為常見的類型之一，也是引發(fā)心血管疾病患者死亡的主要原因之一［1］。因此，尋找一種安全、有效、低毒的治療動脈粥樣硬化藥物十分必要。

氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）遷移和增殖、促進(jìn)泡沫細(xì)胞和血栓的形成，最后導(dǎo)致了動脈粥樣硬化的發(fā)生［2-3］。一些臨床研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化患者的斑塊多發(fā)生于血管彎曲處內(nèi)側(cè)或血管分叉處外側(cè)，這一發(fā)現(xiàn)說明血流動力學(xué)可能也參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生［4］。目前很多研究發(fā)現(xiàn)低剪切力（LSS）可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs），誘導(dǎo)ECs 產(chǎn)生大量的ROS，誘發(fā)ECs 功能紊亂，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［5-6］。

β-欖香烯是從姜科植物溫郁金中提取的抗腫瘤有效成分，具有很好的抗腫瘤作用［7-8］。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯可以減輕高脂飼料誘導(dǎo)的ApoE（-/-）小鼠動脈粥樣硬化癥狀［9-10］，但是具體的作用機(jī)制并不清楚。本研究主要通過建立LSS 誘導(dǎo)的ECs 功能紊亂和ox-LDL 誘導(dǎo)的VSMCs增殖遷移模型，研究β-欖香烯對ECs 功能紊亂和VSMCs 增殖遷移的影響，為β-欖香烯治療動脈粥樣硬化提供理論基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 試 劑

β-欖香烯［含量99%，石藥集團(tuán)遠(yuǎn)大（大連）制藥有限公司］；噻唑藍(lán)（MTT，美國Sigma 公司）；DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；Akt 抗體、p-Akt 抗體、ERK 抗體、p-ERK 抗體、β-actin 抗體、二氫乙錠、3-氨基，4-氨基甲基-2′，7′-二熒光素、二乙酸酯（美國Abcam 公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

LEGEND Micro 21R 型離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；BS210S電子天平（德國Sartorius公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；iCycler iQ5（美國Bio-Rad 公司）；核酸定量儀（美國Amerscham Biosciences 公司）；Veriti 96逆轉(zhuǎn)錄儀器（美國ABI 公司）；Tanon 5200 多倍鏡（中國山海塔農(nóng)科技公司）。

1.3 細(xì) 胞

大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞株（A7r5）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EA. hy926 即ECs）均來源于ATCC公司。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取生長狀態(tài)良好的A7r5 細(xì)胞，使用含10%胎牛血清、鏈霉素（100 μg/L）、慶大霉素（100 μg/L）的DMEM培養(yǎng)液（pH 7.5），在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

取生長狀態(tài)良好的ECs，使用含10%胎牛血清、鏈霉素（100 μg/L）、慶大霉素（100 μg/L）的RPMI 1640 培養(yǎng)液（pH 7.5），在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.2 剪切力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂

采用平行板流動腔建立ECs功能紊亂模型，造模方法與文獻(xiàn)一致［6］，大體操作如下：將ECs 爬片貼壁后置于可體外模擬LSS的平行板流動腔中，施加剪切力0.2 Pa于貼壁的細(xì)胞，作用30 min即可。

2.3 二氫乙錠法檢測ECs中ROS活性

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞的密度按照每毫升5× 105個(gè)細(xì)胞接種于含有蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)分為5 組：正常組、模型組和3 個(gè)不同濃度的β-欖香烯（0.1、1、10 mg/L）組。正常培養(yǎng)24 h 后，換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞同步化。給藥組分別用含有不同濃度的β-欖香烯（0.1、1、10 mg/L）的無血清培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24 h，其余組只用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間，去除培養(yǎng)液，用PBS 洗2 次，加入DHE 于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。用PBS洗3次，并將蓋玻片置于熒光顯微鏡下拍照。

2.4 3-氨基，4-氨基甲基-2′，7′-二熒光素，二乙酸酯法檢測ECs中NO活性

具體細(xì)胞給藥操作步驟同“2.3”項(xiàng)，用PBS 洗過后加入DAF-FM DA 于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。用PBS 洗3 次，并將蓋玻片置于熒光顯微鏡下拍照。

2.5 Western blot 法檢測檢測ECs 中Akt 和ERK的蛋白磷酸化水平

具體細(xì)胞給藥操作步驟同“2.3”項(xiàng)，PBS 洗過后加入蛋白裂解液50 μL 置于冰上靜置20 min 后用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管內(nèi)，于離心機(jī)內(nèi)4 ℃，1 350 r/min，離心5 min后收集上清液即為蛋白懸浮液。通過在10%聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE 分離ECs 的裂解物，并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，然后與一抗（Akt 抗體、p-Akt 抗體、ERK 抗體、p-ERK 抗體、β-actin 抗體）（所有抗體以1∶1 000 稀釋度使用）在4 ℃下反應(yīng)18 h，然后與相應(yīng)的次級辣根過氧化物酶結(jié)合抗體反應(yīng)（所有抗體以1∶1 000稀釋）在室溫下放置2 h。利用ECL檢測系統(tǒng)對蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化檢測。用Tanon 5200 多倍鏡進(jìn)行光密度分析掃描信號。本文報(bào)道的Western blot檢測結(jié)果代表了重復(fù)3次的結(jié)果。

2.6 MTT 法檢測不同濃度ox-LDL 對A7r5 細(xì)胞活力的影響

選取處于對數(shù)生長期的A7r5 細(xì)胞，用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，按照每毫升2×104～4×104個(gè)細(xì)胞的密度制成細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞接種于96 孔板中（每孔180 μL），置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 次，換上含有不同濃度的ox-LDL（0，20，40，60，80，100，200 mg/L），置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄培養(yǎng)基，加入DMSO 200 μL，搖床振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測定波長570 nm 處吸收度，計(jì)算細(xì)胞活力，以選出ox-LDL的適合濃度。

2.7 MTT 法檢測β-欖香烯對A7r5 細(xì)胞增殖的影響

按“2.6”項(xiàng)方法篩選出適合濃度的ox-LDL（80 mg/L）建造A7r5 細(xì)胞增殖遷移模型。將實(shí)驗(yàn)分為5 組：正常組、模型組和3 個(gè)不同濃度的β-欖香烯（0.1、1、10 mg/L）組。通過MTT法檢測β-欖香烯對A7r5細(xì)胞增殖的影響，操作步驟與“2.6”項(xiàng)方法一致。

2.8 細(xì)胞劃痕法檢測A7r5細(xì)胞遷移

選取處于對數(shù)生長期的A7r5細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，將實(shí)驗(yàn)分為5 組：正常組、模型組和3 個(gè)不同濃度的β-欖香烯（0.1、1、10 mg/L）組。當(dāng)細(xì)胞的生長覆蓋面積約90%時(shí)，在培養(yǎng)皿底部做一直線標(biāo)記，用無菌槍頭沿著標(biāo)記作劃痕，PBS 漂洗后加入含有1%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（含有對應(yīng)組別的藥物）繼續(xù)培養(yǎng)，并分別在0和24 h進(jìn)行拍照，并用Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行分析，以劃痕閉合比率來評估細(xì)胞遷移程度。

1589 年的佛羅倫薩 《幕間劇》（Intermezzi）?也是《圖像學(xué)》較為重要的借鑒資源。研究中發(fā)現(xiàn)，里帕正是據(jù)此對各類文學(xué)體裁的擬人形象進(jìn)行構(gòu)思設(shè)計(jì)，如1593年初版中的“Poema Eroico”（史 詩）、“Poema Pastorale”（田 園 詩）、“Poema Satirico”（諷喻詩）?等擬人形象，當(dāng)時(shí)遺漏了同類的“Poema lirico”（抒情詩），學(xué)者曼多夫斯基認(rèn)為是里帕重讀此書時(shí)發(fā)現(xiàn)自己忘記翻頁而錯(cuò)過了這個(gè)擬人形象，1603年版中便又添上。

2.9 Transwell法檢測A7r5細(xì)胞遷移

選取處于對數(shù)生長期的A7r5 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前換用無血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24 h。用胰酶消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用無血清的DMEM 重懸。取細(xì)胞懸液200 μL分別加入5個(gè)Transwell小室中，分別標(biāo)記：正常組、模型組和3個(gè)不同質(zhì)量濃度的β-欖香烯（0.1、1、10 mg/L）組，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔3×104個(gè)細(xì)胞，下室中β-欖香烯組分別加入含藥物血清培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度為0.1、1、10 mg/L），其余組別只加入血清培養(yǎng)基。正常培養(yǎng)24 h，將小室取出，棄去小室中的培養(yǎng)液，用PBS 洗1～2 遍后倒扣風(fēng)干。將風(fēng)干的小室放入已加入4%多聚甲醛600 μL的孔板中，對小室底部背面穿過的細(xì)胞進(jìn)行固定30 min。取出固定好的小室，風(fēng)干后放入結(jié)晶紫染液中染色20 min。將染完色的小室用PBS 洗3遍，然后用棉簽擦盡小室內(nèi)部未遷移的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，拍照計(jì)數(shù)。

2.10 RT-qPCR 法 檢 測A7r5 細(xì) 胞 中MMP-2 和MMP-9的基因表達(dá)

引物設(shè)計(jì)與合成：MMP-2 引物（上游5′-GCT TCC AGG GCA CCT CTT ACA-3′；下 游5′-ACC TTC TGA ATT TCC ACC CAC AG-3′）、MMP-9 引物（上游5′-CCA TGT CAC TTT CCC TTC ACC TT-3′；下游5′-GCC ATG CTC CGT GTA GAG ATT C-3′），引物由Primer3 software設(shè)計(jì)與合成。

細(xì)胞總RNA 的提?。喝∨囵B(yǎng)24 h后的正常組、模型組和3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的β-欖香烯（0.1、1、10 mg/L）組的A7r5 細(xì)胞，分別制成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清液后按照RNA 提取說明書的方法采用Trizol溶液提取細(xì)胞總RNA。

RNA 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照說明書配制RT 反應(yīng)液（5×反轉(zhuǎn)錄試劑2 μL，總RNA，用無核酸酶水補(bǔ)足至10 μL），置于逆轉(zhuǎn)錄儀中反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

熒光定量PCR 檢測：以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，應(yīng)用熒光定量PCR檢測細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 的基因表達(dá)。25 μL 反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，退火60 ℃30 s，以上兩步擴(kuò)增循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線。

2.11 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，Origin 8.0 處理圖片，數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)，則表示具有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 β-欖香烯改善LSS誘導(dǎo)的ECs功能紊亂

通過檢測ECs 中ROS 和NO 的活性來評估β-欖香烯對LSS 誘導(dǎo)的ECs 功能紊亂的改善作用。結(jié)果如圖1 所示，ECs 經(jīng)過30 min 的LSS 處理后，ROS 的活性顯著升高，而NO 的活性卻顯著性降低。β-欖香烯治療可以顯著降低LSS 誘導(dǎo)的ROS升高，升高LSS 誘導(dǎo)的NO 降低，并具有一定的劑量依賴性。這些結(jié)果均表明，β-欖香烯可以改善LSS誘導(dǎo)的ECs功能紊亂。

3.2 β-欖香烯對ECs中Akt和ERK的蛋白磷酸化水平的影響

通過Western blot 法檢測檢測ECs 中Akt 和ERK的蛋白磷酸化水平的變化。結(jié)果如圖2所示，在ECs 中，β-欖香烯可以顯著降低LSS 所誘導(dǎo)的ERK的磷酸化升高，并可以顯著升高LSS所誘導(dǎo)的Akt的磷酸化降低。

3.3 β-欖香烯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞增殖

為了確定適合濃度的ox-LDL 建造VSMCs 增殖遷移模型，本研究使用MTT 法檢測了不同濃度的ox-LDL 對A7r5 細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果如圖3-A 所示，80 mg/L ox-LDL 可以顯著增加A7r5細(xì)胞發(fā)生增殖。因此，本研究選擇了80 mg/L 的ox-LDL 建造VSMCs 增殖遷移模型。使用MTT 法檢測β-欖香烯對ox-LDL 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯可以顯著降低ox-LDL誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞增殖，并具有一定的劑量依賴性（圖3-B）。

3.4 β-欖香烯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞遷移

通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell法檢測A7r5細(xì)胞遷移。結(jié)果如圖4 所示，ox-LDL 可以誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞發(fā)生明顯的遷移現(xiàn)象，β-欖香烯治療可以顯著抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞遷移，并具有一定的劑量依賴性。

Figure 2 Effects ofβ-elemene on protein phosphorylation levels of Akt and ERK(±s,n=3)A:Effect ofβ-elemene on the protein phosphorylation level of Akt and ERK in ECs induced by LSS;B:Gray-scale scanning of the protein phosphorylation level of Akt and ERK in ECs. ##P ＜0.01 vs 0 min LSS+0 mg/Lβ-ele; **P ＜0.01 vs 30 min LSS+0 mg/Lβ-ele

Figure 3β-elemene inhibits the proliferation of A7r5 cells induced by ox-LDL(±s,n=3)A:Vability of A7r5 cells upon exposure to different concentrations of ox-LDL for 24 h;B:β-elemene inhibits the proliferation of A7r5 cells induced by ox-LDL at 80 mg/L. #P＜0.05, ##P ＜0.01 vs treatment with 0 mg/L ox-LDL; *P＜0.05, **P ＜0.01 vs treatment with 80 mg/L ox-LDL

Figure 4β-elemene inhibits A7r5 cell migration induced by ox-LDL(±s,n=3)A:A7r5 cell migration was assessed by wound healing assay;B:Quantitative data as the percentage of A7r5 cell migrating into the wound with respect to the cell-free area at the time 0 h;C:Transwell assay was performed to determine the migration of A7r5 cell;D:Quantitative data of A7r5 cell migration. ##P ＜0.01 vs treatment with 0 mg/L ox-LDL; *P＜0.05, **P ＜0.01 vs treatment with 80 mg/L ox-LDL

3.5 β-欖香烯對MMP-2 和MMP-9 基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究β-欖香烯對ox-LDL 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞遷移影響，本研究使用RT-qPCR 法檢測了β-欖香烯對遷移相關(guān)的基因（主要是MMP-2 和MMP-9）表達(dá)影響。結(jié)果如圖5 所示，ox-LDL 顯著升高A7r5 細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9 的基因表達(dá)。β-欖香烯治療可以顯著降低MMP-2和MMP-9的基因表達(dá)，并具有一定的劑量依賴性。

Figure 5 Effects ofβ-elemene on the mRNA levels of MMP-2 and MMP-9(±s,n=3)A:β-elemene significantly reduced MMP-2 gene expression in A7r5 cells induced by ox-LDL;B:β-elemene significantly reduced MMP-9 gene expression in A7r5 cells induced by ox-LDL. ##P ＜0.01 vs treatment with 0 mg/L ox-LDL; *P＜0.05, **P ＜0.01 vs treatment with 80 mg/L ox-LDL

4 討 論

剪切力是指血液流動時(shí)與血管壁內(nèi)膜面的摩擦力，目前研究已經(jīng)證實(shí)了剪切力參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生［11］。病理研究證實(shí)，動脈粥樣硬化病變發(fā)生的部位為低剪切力處［12］。大量的體內(nèi)體外的實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，低剪切力會誘導(dǎo)ERK 磷酸化和Akt去磷酸化，使血管內(nèi)皮細(xì)胞的ROS活性升高和NO 活性降低，從而造成內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，最終促進(jìn)了動脈粥樣硬化的發(fā)生［13］。本研究采用平行板流動腔在體外模擬低剪切力誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低剪切力確實(shí)可以誘導(dǎo)ECs 的ROS 活性升高和NO 活性降低，以及誘導(dǎo)ERK 磷酸化的升高，Akt 的磷酸化的降低。β-欖香烯治療可以顯著降低ROS 活性，并升高NO 活性；降低ERK 的磷酸化，并升高Akt 的磷酸化。這一結(jié)果說明，β-欖香烯可以改善低剪切力誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。

血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移也在動脈粥樣硬化發(fā)病中起著重要的作用［14-15］。Ox-LDL 過量時(shí)，它攜帶的膽固醇堆積在動脈壁上形成了斑塊，引起動脈粥樣硬化的發(fā)生［16-17］。本研究使用ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞［18］增殖和遷移模型，并檢測β-欖香烯對血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ox-LDL 可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生顯著的遷移和增殖現(xiàn)象，通過β-欖香烯治療可以顯著抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。本研究也對與血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的基因（MMP-2 和MMP-9）進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以顯著升高血管平滑肌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 的基因表達(dá)，而β-欖香烯可以顯著抑制MMP-2 和MMP-9 的基因表達(dá)。這一結(jié)果說明，β-欖香烯可以抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。

總之，β-欖香烯可以改善LSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和ox-LDL 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移。這些結(jié)果表明，β-欖香烯的抗動脈粥樣硬化作用可能與其在內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞上的作用相關(guān)。