劉志雙，鄭玉粉，孫紅娜，于 鋒

（中國(guó)藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京211198）

抗凝治療是治療血栓性疾病的基礎(chǔ)，新型口服抗凝藥（NOACs）的問世克服了傳統(tǒng)維生素K 拮抗劑在血栓性疾病治療的局限性，已顯著改變了抗凝治療現(xiàn)狀并受到廣泛關(guān)注［1-3］。目前在我國(guó)獲批上市的NOACs 包括直接凝血酶（Ⅱa 因子）抑制劑達(dá)比加群酯（其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為具有直接抗凝血活性的達(dá)比加群），以及Xa 因子抑制劑阿哌沙班、利伐沙班和依度沙班。銀杏葉提取物（GBE）作為活血化瘀類中藥，已被越來越多的基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)證明對(duì)預(yù)防和治療心腦血管疾病有益［4-5］，在國(guó)內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的預(yù)防和治療。

隨著NOACs 在臨床上的廣泛使用，伴有多種血栓性疾病的患者可能出現(xiàn)同時(shí)服用GBE 和NOACs 的情況，然而臨床上對(duì)于聯(lián)合使用GBE 是否影響NOACs的抗凝活性提出疑問。目前國(guó)內(nèi)外還尚未有關(guān)于GBE 和NOACs 間相互作用的研究報(bào)道。故本研究利用大鼠血漿體外研究GBE 聯(lián)合4種NOACs（達(dá)比加群、阿哌沙班、利伐沙班和依度沙班）的抗凝效果，通過測(cè)定凝血時(shí)間（TT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、部分活化凝血酶時(shí)間（APTT）和凝血因子Xa（FXa）活性評(píng)估GBE 對(duì)NOACs藥效的影響，旨在初步探索GBE對(duì)NOACs的相互作用，以期為臨床上NOACs的安全合理用藥提供參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

達(dá)比加群（粉末，純度95.4%）、阿哌沙班（粉末，純度99.9%）、依度沙班（粉末，純度99.9%）、利伐沙班（粉末，純度99.7%）和銀杏葉提取物（粉末，由銀杏葉經(jīng)乙醇回流提取、大孔樹脂乙醇水溶液梯度洗脫而得，含24%銀杏黃酮和6%銀杏內(nèi)酯）均購于上海源葉生物有限公司；凝血酶時(shí)間（TT）測(cè)定試劑盒（上海太陽生物有限公司）；凝血酶原時(shí)間測(cè)定液體試劑盒、活化部分凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑盒（泰州中勤世帝生物技術(shù)有限公司）；大鼠凝血因子Xa（FXa）活性酶聯(lián)免疫分析試劑盒（南京金霖生物有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

BS124S 型電子分析天平（上海Sartorius Intec公司）；TDZ4A-WS型低速平衡離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；LG-PABER-I 半自動(dòng)凝血因子分析儀（泰州中勤世帝生物技術(shù)有限公司）；VersaMaxTM酶標(biāo)儀、SoftMax Pro v5.4 軟件（美國(guó)Molecular Devices公司）。

1.3 動(dòng) 物

SPF 級(jí)Sprague-Dawley 大鼠，體重（250 ± 20）g，雄性，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2017-001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 大鼠血漿采集與處理

大鼠禁食8 h 后，水合氯醛（10%，0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，勁動(dòng)脈取血，血漿收集于含有109 mmol/L枸櫞酸鈉的試管中，枸櫞酸鈉和血漿以體積比1∶9的比例混合，輕輕顛倒混勻。收集的抗凝血漿以3 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，即為待測(cè)血漿。所有血漿樣品于室溫下2 h 內(nèi)進(jìn)行測(cè)試，以確保其穩(wěn)定性。

2.2 含藥血漿配制

參照相關(guān)文獻(xiàn)［6-9］，設(shè)置NOACs 在大鼠血漿中的終濃度為125、250、500 ng/mL，GBE 在大鼠血漿中的終濃度為125、250、500 μg/mL；根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置聯(lián)合GBE 時(shí)NOACs 在大鼠血漿中的終濃度為125 ng/mL。

配制NOACs 和GBE 的DMSO 儲(chǔ)備液，再用生理鹽水配制成12.5、25、50 μg/mL 的NOACs 生理鹽水溶液和12.5、25、50 mg/mL的GBE生理鹽水溶液。將NOACs 或GBE 生理鹽水溶液和大鼠血漿按體積比1∶99混合制備為所需濃度的含藥血漿樣品，用于NOACs 或GBE 對(duì)大鼠血漿凝血指標(biāo)影響的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，空白對(duì)照組使用生理鹽水與大鼠血漿按體積比1∶99混合制備的血漿樣品。將NOACs 生理鹽水溶液、GBE 生理鹽水溶液和大鼠血漿按體積比1∶1∶98混合制備為所需濃度的含藥血漿樣品，用于NOACs 聯(lián)合GBE 對(duì)大鼠血漿凝血指標(biāo)影響的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置NOAC對(duì)照組和空白對(duì)照組，NOAC 對(duì)照組使用NOACs 生理鹽水溶液、生理鹽水和大鼠血漿按體積比1∶1∶98 混合制備的含藥血漿樣品，空白對(duì)照組使用生理鹽水與大鼠血漿按體積比1∶49 混合制備的血漿樣品。控制DMSO 在含藥或空白生理鹽水溶液中的體積分?jǐn)?shù)小于0.1%，所有血漿樣品現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3 凝血指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 TT、PT和APTT測(cè)定 使用TT、PT和APTT檢測(cè)試劑盒于半自動(dòng)凝血因子分析儀進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置儀器參數(shù)，測(cè)試杯的每個(gè)通道中加入攪拌珠，并將待測(cè)含藥血漿（TT：100 μL，PT：50 μL，APTT：50 μL 和APTT 試劑50 μL）加入測(cè)試杯，放置37 ℃預(yù)溫區(qū)預(yù)溫3 min 后，將測(cè)試杯轉(zhuǎn)入測(cè)試區(qū)，加入檢測(cè)試劑（TT：TT 溶液100 μL，PT：PT 溶液100 μL，APTT：CaCl2溶液50 μL）的同時(shí)啟動(dòng)開始鍵，測(cè)定各凝血指標(biāo)并記錄結(jié)果。

2.3.2 FXa 活性測(cè)定 使用大鼠凝血因子Xa 活性酶聯(lián)免疫分析試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為2、4、8、16、32 U/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，酶標(biāo)包被板設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔和待測(cè)樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)孔準(zhǔn)確加入標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，空白孔加入樣品稀釋液40 μL 和生理鹽水10 μL，待測(cè)樣品孔加入樣品稀釋液40 μL 和含藥血漿樣品10 μL，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜封板后置于37 ℃溫育30 min 后，揭掉封板膜，棄去所有液體，每孔加滿洗滌液重復(fù)洗滌5次，甩干液體后，除空白孔外其他孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，封板溫育30 min 后洗滌5 次，加顯色劑A 和B 各50 μL，輕輕振蕩混勻后于37 ℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 μL 終止反應(yīng)，在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸收度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中FXa的活性。

2.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)6 次，所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以的形式表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié) 果

3.1 NOACs對(duì)各凝血指標(biāo)的影響

如表1所示，在0～500 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，TT、PT 和APTT 隨NOACs 濃度增大而延長(zhǎng)，除利伐沙班的TT 外，其余均具有較好的線性相關(guān)性（r2=0.78～0.98）。TT 對(duì)于達(dá)比加群異常敏感，相比于空白對(duì)照組，125 ng/mL 達(dá)比加群已顯著延長(zhǎng)TT約7 倍（P＜0.01）。TT 和APTT 的延長(zhǎng)隨著達(dá)比加群濃度增大趨于平緩。TT 對(duì)利伐沙班、阿哌沙班的靈敏度較低。達(dá)比加群在0～500 ng/mL 范圍內(nèi)延長(zhǎng)PT 具有較好的線性相關(guān)性（r2=0.979 7）。PT 對(duì)阿哌沙班的靈敏度較低。依度沙班在0～500 ng/mL范圍內(nèi)延長(zhǎng)APTT 具有較好的線性相關(guān)性（r2=0.982 2）。FXa 活性隨Xa 因子抑制劑（指阿哌沙班、利伐沙班和依度沙班，下同）濃度增大而降低，在0～250 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈較好的線性相關(guān)性（r2=0.85～0.94），利伐沙班和依度沙班在高于250 ng/mL 時(shí)抑制作用趨于平緩。根據(jù)上述結(jié)果，選擇NOACs 質(zhì)量濃度為125 ng/mL 進(jìn)行后續(xù)聯(lián)合GBE的實(shí)驗(yàn)。

3.2 GBE對(duì)各凝血指標(biāo)的影響

如表2 所示，GBE 在0～500 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍 內(nèi) 不 影 響 大 鼠 血 漿 的TT、PT 和APTT（P＞0.05），但隨GBE 濃度增大而顯著增強(qiáng)FXa 活性，具有較好的線性相關(guān)性（r2=0.840 4）。

3.3 GBE對(duì)NOACs各凝血指標(biāo)的影響

如表3 所示，單獨(dú)NOACs 存在時(shí)，相比于空白對(duì)照組，TT 顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）。達(dá)比加群聯(lián)合GBE 時(shí)，TT 隨GBE 濃度增大而呈線性延長(zhǎng)（r2=0.936 1），相比于達(dá)比加群對(duì)照組具有顯著性差異。臨床上TT延長(zhǎng)超過3 s顯示異常，達(dá)比加群聯(lián)合125 μg/mL GBE 時(shí)，比達(dá)比加群對(duì)照組的TT 已延長(zhǎng)約10 s，提示GBE 有抗凝的臨床意義。利伐沙班聯(lián)合GBE 時(shí)，TT 隨GBE 濃度增大而縮短，但相比于利伐沙班對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。阿哌沙班聯(lián)合GBE 時(shí)，TT 隨GBE 濃度增大而呈線性縮短（r2=0.799 7），相比于阿哌沙班對(duì)照組，聯(lián)合500 μg/mL GBE 下的TT 具有顯著性差異（P＜0.05）。依度沙班聯(lián)合GBE 時(shí)，TT 隨GBE 濃度增大而呈線性縮短（r2=0.810 9），相比于依度沙班對(duì)照組，聯(lián)合250 μg/mL（P＜0.05）和500 μg/mL（P＜0.01）GBE下的TT具有顯著性差異。

Table 1 Effects of new oral anticoagulants(NOACs)on coagulation indicators of rat plasma(±s,n=6)

Table 1 Effects of new oral anticoagulants(NOACs)on coagulation indicators of rat plasma(±s,n=6)

*P＜0.05, **P ＜0.01 vs 0 μg/mL group.TT:thrombin time;PT:prothrombin time;APTT:activated partial thrombin time;FXa:activated factor X

?

Table 2 Effects of Ginkgo biloba extract(GBE)on coagulation indicators of rat plasma(±s,n=6)

Table 2 Effects of Ginkgo biloba extract(GBE)on coagulation indicators of rat plasma(±s,n=6)

*P＜0.05, **P ＜0.01 vs control group

?

單獨(dú)NOACs 存在時(shí)，相比于空白對(duì)照組，PT和APTT 延長(zhǎng)，具有顯著性差異。但NOACs 聯(lián)合GBE 后的PT 和APTT 相比于NOAC 對(duì)照組沒有顯著變化（P＞0.05）。

單獨(dú)Xa 因子抑制劑存在時(shí)，相比于空白對(duì)照組，F(xiàn)Xa 活性顯著降低（P＜0.05）。Xa 因子抑制劑聯(lián)合GBE時(shí)，F(xiàn)Xa活性相比于NOAC 對(duì)照組顯著性增強(qiáng)，且隨GBE 濃度增大而增強(qiáng)，具有較好的線性相關(guān)性（r2=0.88～0.92），變化趨勢(shì)和單用GBE時(shí)相似，再次說明GBE具有顯著增強(qiáng)FXa活性的作用。

4 討 論

銀杏葉在國(guó)內(nèi)外地區(qū)分布廣泛，是廣泛使用的中藥材，在國(guó)外也是非常受歡迎的膳食補(bǔ)充劑，具有抗血栓、抗氧化、擴(kuò)張血管等作用［5］。目前在國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于銀杏葉的研究，其生物活性成分的藥理作用及抗血栓機(jī)制已有相關(guān)闡明［10-13］。

本研究通過TT、PT、APTT 和FXa 活性初步判斷GBE 對(duì)凝血系統(tǒng)的影響，結(jié)果顯示GBE 在0～500 μg/mL 范圍內(nèi)對(duì)TT 無顯著性改變，表明GBE對(duì)凝血酶及纖維蛋白原無顯著性影響。本研究結(jié)果顯示GBE 對(duì)PT 和APTT 無顯著性改變，GBE 聯(lián)合NOACs 后的PT 和APTT 相比于NOAC 對(duì)照組也無顯著變化，而FXa 活性隨GBE 濃度增大而增強(qiáng)，根據(jù)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)可知，F(xiàn)Xa活性的增強(qiáng)會(huì)加速凝血酶的生成，這原本應(yīng)該造成PT 和APTT 的縮短，可能GBE 增強(qiáng)的FXa 活性不足以造成PT 和APTT的顯著縮短，又或者GBE 具有其他抗凝活性，如對(duì)蛋白C、蛋白S 或抗凝血酶有促進(jìn)作用，從而抵消了其增強(qiáng)FXa活性的作用。

Table 3 Effects of NOACs combined with GBE on coagulation indicators of rat plasma (±s,n=6)

Table 3 Effects of NOACs combined with GBE on coagulation indicators of rat plasma (±s,n=6)

*P＜0.05,**P ＜0.01 vs control group; #P＜0.05,##P ＜0.01 vs NOAC single drug group(125 ng/mL)

Indicator Dabigatran Rivaroxaban Apixaban Edoxaban Group Control Single Combined with GBE Control Single Combined with GBE Control Single Combined with GBE Control Single Combined with GBE c/(μg/mL)125 250 500 125 250 500 125 250 500 125 250 500 TT/s 35.37±0.24 286.52±3.44**296.33±4.53#308.22±1.92##315.55±1.12##26.27±0.61 26.97±0.27*27.02±0.54 26.80±0.34 26.62±0.40 26.43±0.72 27.32±0.50*27.20±0.40 26.83±0.32 26.75±0.23#26.43±0.72 27.33±0.39*27.00±0.15 26.87±0.31#25.82±0.28##PT/s 13.87±0.16 18.30±0.77**18.00±0.41 17.92±0.43 17.82±0.26 15.03±0.28 15.57±0.19*15.62±0.31 15.43±0.26 15.48±0.19 15.95±0.24 16.42±0.26*16.18±0.34 16.63±0.46 16.43±0.23 15.95±0.24 17.95±0.26**18.07±0.37 17.93±0.26 18.03±0.24 APTT/s 26.97±0.22 57.35±0.72**56.90±0.52 57.62±0.93 57.93±0.72 47.40±0.67 51.48±0.58**51.17±0.70 50.02±0.51 51.25±0.97 34.17±0.28 39.18±0.38**38.82±0.23 38.88±0.29 39.03±0.22 34.17±0.28 37.87±0.45**37.52±0.53 37.78±0.40 37.95±0.37 FXa activity/(U/L)15.80±0.36 15.22±0.21*16.66±0.71#20.63±0.66##22.59±1.12##15.80±0.36 15.27±0.37*16.66±0.77#18.68±0.24#20.22±0.66##15.80±0.36 15.00±0.53*18.29±0.58##18.97±0.55##22.29±0.35##

本研究表明FXa活性隨Xa因子抑制劑濃度增大而降低，在低濃度范圍內(nèi)（0～250 ng/mL）具有較好的線性相關(guān)性，這和相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)論是一致的［14-17］，本研究發(fā)現(xiàn)GBE 具有增強(qiáng)FXa 活性的作用，這在中外文獻(xiàn)中還未有相關(guān)的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示Xa 因子抑制劑聯(lián)合GBE 后隨GBE 濃度增大而縮短TT，但只在高濃度（500 μg/mL）GBE 下縮短的TT 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與高濃度GBE顯著增強(qiáng)FXa 活性有關(guān)。而達(dá)比加群聯(lián)合GBE 后隨GBE 濃度增大而顯著延長(zhǎng)TT，這可能與達(dá)比加群是凝血酶的直接、強(qiáng)效的抑制劑有關(guān)，雖然GBE能增強(qiáng)FXa 活性，加速凝血酶的生成，但生成的凝血酶被達(dá)比加群所抑制，使GBE 增強(qiáng)FXa 活性的作用失效，而GBE 可能的抗凝活性發(fā)揮作用，協(xié)同達(dá)比加群使TT延長(zhǎng)。

本研究與臨床研究存在一定差異，首先本研究使用的是大鼠血漿，而凝血系統(tǒng)中的許多關(guān)鍵蛋白如活化凝血酶C 和蛋白S 的抗凝血活性具有物種特異性［18-19］，所以使用大鼠血漿和人體血漿在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上可能存在差異；再者臨床療程一般為一個(gè)月，藥物在體內(nèi)經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的吸收代謝過程，對(duì)機(jī)體造成了一定的影響，而本研究只是在血漿中加入一定量的藥物，這和復(fù)雜的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程有較大的差異；最后，服藥者的個(gè)體差異和健康狀況或許也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)重要因素。因此GBE 及其聯(lián)合NOACs 后對(duì)凝血系統(tǒng)的影響需在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

本研究使用凝血指標(biāo)TT、PT、APTT 和FXa 活性初步評(píng)估GBE 對(duì)NOACs 藥效學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GBE 可能協(xié)同達(dá)比加群的抗凝作用；而GBE可能拮抗Xa因子抑制劑（阿哌沙班、利伐沙班和依度沙班）的抗凝作用，原因可能是GBE 具有增強(qiáng)FXa 活性的作用。后續(xù)將在大鼠體內(nèi)及人體血漿中進(jìn)一步驗(yàn)證，并進(jìn)行GBE 對(duì)NOACs 藥代動(dòng)力學(xué)研究，以明確GBE 對(duì)NOACs 藥物相互作用，以期為臨床聯(lián)合使用GBE 和NOACs 的安全性和有效性提供理論參考。