金曉峰, 焦仁剛, 趙 貴*, 欒慶祥, 黃 鑫, 章厲劼,王慶紅, 孫真崢, 黃 瑾, 周光華, 雷學(xué)昌

(1.貴州省獸藥飼料監(jiān)察所,貴州貴陽 550003；2.黔西南州畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站，貴州興義 562400；3.黔南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督綜合檢測中心，貴州都勻 558013)

頭孢拉定(Cephradine)別名為先鋒霉素Ⅵ、頭孢菌素Ⅵ等，它是第一代半合成頭孢菌素，為白色或類白色結(jié)晶性粉末，分子式為C16H19N3O4S。頭孢拉定對耐藥性金葡菌及其它多種對廣譜抗生素耐藥的桿菌等有迅速而可靠的殺菌作用，它也是人用抗生素。根據(jù)我國《獸藥管理條例》第四十一條，禁止將人用藥物用于動物，但在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中為追求治療效果，違規(guī)使用頭孢拉定的情況較為普遍。因此，“人藥獸用”帶來的藥物殘留直接威脅了人們的健康[1]，也對生態(tài)環(huán)境、食品安全等帶來了一定危害[2，3]，我國已將獸用抗菌藥物列為主要監(jiān)管對象[4，5]。

目前，我國已制定的頭孢類獸藥殘留標準包括了頭孢匹林、頭孢噻呋、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟、頭孢唑啉共6種，但頭孢拉定殘留檢測還沒有標準方法。已報道的頭孢拉定檢測方法主要為酶聯(lián)免疫法[6]、液相色譜法[7，8]、熒光分光光度法[9]、微生物法[10]、光化學(xué)極譜法[11]、流動注射化學(xué)發(fā)光法[12，13]、紫外分光光度法[14，15]、液-質(zhì)聯(lián)用法[16，17]。液-質(zhì)聯(lián)用法具有高通量、高靈敏度、高準確度、實驗周期相對較短的優(yōu)點，是目前獸藥殘留檢測的主要手段。已報道液-質(zhì)聯(lián)用檢測法中，范瑩瑩建立了豬肉經(jīng)勻漿提取、正己烷液液萃取脫脂、XAD -2固相萃取柱凈化，液-質(zhì)聯(lián)用儀測定頭孢拉定殘留量的方法[16]；賈濤建立了牛奶經(jīng)渦旋提取、正己烷液液萃取脫脂、C18固相萃取柱凈化，液-質(zhì)聯(lián)用儀測定頭孢拉定殘留量的方法[17]。此兩種方法均需4步操作，且固相萃取需預(yù)洗、上樣、淋洗、洗脫步驟，操作較為繁瑣。本文建立了只需渦旋提取、固相萃取直接凈化共2步前處理的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)聯(lián)用檢測方法，經(jīng)驗證，其準確度、精密度、靈敏度均符合標準(NY/T 1896-2010)《獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》中獸藥殘留檢測方法性能要求，與傳統(tǒng)方法相比，本文方法降低了有機試劑的消耗，提高了實驗效率，為雞肉中頭孢拉定殘留量的快速測定提供新的依據(jù)，對于強化雞肉獸藥殘留監(jiān)控、推動家禽產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

Waters XEVO TQ-XS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，沃特世公司)，配電噴霧離子源，Masslynx軟件；Mettler AB104-S天平(瑞士，梅特勒公司)；IKA Minisharker渦旋振蕩器(德國，伊卡公司)；SIGMA 3K15高速冷凍離心機(德國，西格瑪公司)；Waters PRiME HLB型固相萃取柱(規(guī)格為60 mg/3mL，美國沃特世公司)。

頭孢拉定對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量88.4%，批號：130427-201708)。標準儲備溶液：精密稱定10 mg頭孢拉定對照品，置于100 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，得到含頭孢拉定100 μg/mL的標準儲備溶液，-20 ℃保存。標準中間溶液：精密移取100 μL頭孢拉定標準儲備溶液，置于100 mL容量瓶中，0.2%甲酸水溶液定容，得到含頭孢拉定100 ng/mL的標準中間溶液，4 ℃保存。標準工作溶液：為消除基質(zhì)效應(yīng)，本方法采用基質(zhì)加標制備標準曲線，分別精密移取適量的頭孢拉定標準中間溶液，加入到0.5 mL凈化后的空白試樣中，0.2%甲酸水溶液定容至1.00 mL，繪制濃度為0.5、1、5、10、20、50 ng/mL的標準工作曲線。甲酸(色譜純，德國默克公司)；乙腈(質(zhì)譜級，德國費舍爾公司)。實驗用水均為Milli-Q Direct-Q 10超純水。

1.2 樣品制備

雞肉樣品購自農(nóng)貿(mào)市場。將樣品絞碎并均質(zhì)，于-20 ℃冷凍保存，用前室溫下解凍。稱取雞肉樣品2±0.05 g，置于50 mL離心管中，準確加入80%乙腈水溶液8.00 mL，渦旋提取2 min，于5 ℃下10 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，備用。取上清液2 mL直接過PRIME HLB柱，收集濾過液，準確吸取0.50 mL濾過液，加入0.2%甲酸水溶液0.50 mL，使總體積為1.00 mL，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜后，待測。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動相為0.1%甲酸(A)和0.1%甲酸乙腈(B)，梯度洗脫程序為：5%B(0.00～0.50 min)，5%～95%B(0.50～18.00 min)，95%B(18.00～19.00 min)，95%～5%B(19.00～19.01 min)，5%B(19.01～20.00 min)；流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電離電壓：3.0 kV；源溫：150 ℃；霧化溫度：650 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：1 000 L/h；定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量如表1所示。

表1 頭孢拉定的MS/MS采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

頭孢拉定是硫氮雜環(huán)化合物，易加合1個H+，形成(M+H)+分子離子，故離子源選擇了電噴霧正離子(ESI+)模式。向超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，以10 μL/min注入100 ng/mL頭孢拉定標準溶液，調(diào)諧優(yōu)化MS/MS條件，以一級質(zhì)譜調(diào)諧優(yōu)化電離電壓、霧化溫度、霧化氣流速和錐孔電壓，確定分子離子質(zhì)荷比。再經(jīng)二級質(zhì)譜調(diào)諧，對子離子碎片進行分析，選取豐度比強度最大的2個子離子，優(yōu)化碰撞能量，確定子離子質(zhì)荷比。母離子與2個子離子共同形成2對多反應(yīng)監(jiān)測離子對作為定性離子對，并以信號響應(yīng)強者為定量離子對(表1)。

2.2 色譜條件的選擇

頭孢拉定為弱極性化合物，適合反相色譜系統(tǒng)分析。對比了ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)兩種反相色譜柱，均能獲得良好的峰形，但HSS T3柱的保留能力更強，峰形更對稱尖銳，因此選擇該色譜柱進行分析。標準溶液、空白雞肉樣品及陽性添加樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖1～3。

圖1 0.5 ng/mL頭孢拉定標準溶液多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 Multi-reaction monitoring chromatograms of 0.5 ng/mL cephradine standard solution

圖2 空白雞肉樣品多反應(yīng)檢測色譜圖Fig.2 Multi-reaction monitoring chromatograms of blank chicken sample

圖3 1.0 μg/kg添加水平雞肉樣品多反應(yīng)檢測色譜Fig.3 Multi-reaction monitoring chromatograms of 1.0 μg/kg chicken sample

2.3 稀釋倍數(shù)對基質(zhì)效應(yīng)和靈敏度的影響

樣品制備時，試驗了1倍稀釋(0.50 mL過柱濾液定容至1.00 mL)，及5倍稀釋(0.20 mL柱濾液定容至1.00 mL)兩種稀釋方式。經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀按上述儀器條件測定，以基質(zhì)標樣響應(yīng)值與溶劑標樣響應(yīng)值的百分比值衡量基質(zhì)效應(yīng)，1倍稀釋時基質(zhì)標樣350.1>176.0和350.1>158.0離子對基質(zhì)效應(yīng)分別為79.2%和87.5%，存在基質(zhì)抑制情況；5倍稀釋時，兩個離子對基質(zhì)效應(yīng)分別為97.0%和100%，沒有明顯基質(zhì)效應(yīng)。但5倍稀釋與1倍稀釋相比，靈敏度也降低了5倍。根據(jù)標準(NY/T 1896-2010)《獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》，禁用藥物檢測方法的定量限應(yīng)盡可能低，一般至少低于或者等于1 μg/kg。因此最終選擇1倍稀釋、基質(zhì)標樣外標法定量，作為測定頭孢拉定殘留量的實驗條件。

2.4 提取溶劑的選擇

頭孢拉定常用的提取溶劑有乙腈∶水(15∶2，V/V)[8]、0.5%乙酸水溶液[16]、乙腈[17]。本文考察了0.5%乙酸水溶液、80%乙腈溶液、乙腈3種溶劑的提取效果，80%乙腈溶液回收率最高，實驗中純乙腈還引起了雞肉樣品表面蛋白質(zhì)變性，影響了渦旋效果。最終選擇了80%乙腈作為提取液。

2.5 固相萃取柱的選擇

已報道的頭孢拉定固相萃取主要采用XAD -2固相萃取柱[16]和C18固相萃取柱[17]，凈化過程需經(jīng)過預(yù)洗、上樣、淋洗、洗脫共4個步驟，操作時間長，消耗有機試劑多，對實驗人員健康及環(huán)境安全有一定影響。本文采用了新型PRiME HLB固相萃取柱，只需上樣一個步驟，且不需要消耗預(yù)洗、淋洗、洗脫過程產(chǎn)生的有機溶劑，簡化了操作，提高了效率。

2.6 線性范圍

基質(zhì)匹配系列標準溶液按峰面積以外標法進行回歸計算，繪制得到的標準曲線在0.5～50.0 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性，曲線方程為：Y=3 308.8X-100.61，相關(guān)系數(shù)R2為0.9998。

2.7 靈敏度考察

向空白雞肉樣品中添加適量頭孢拉定，經(jīng)上述方法測試，觀察特征離子色譜峰信噪比(S/N)和對應(yīng)藥物的濃度，當(dāng)樣品中頭孢拉定含量為0.5 μg/kg時，液-質(zhì)譜圖峰S/N>3，即檢測限為0.5 μg/kg；當(dāng)樣品頭孢拉定含量為1 μg/kg時，液質(zhì)-譜圖峰S/N>10，即定量限為1 μg/kg。

2.8 準確度和精密度

向空白雞肉樣品中添加適量頭孢拉定，制備得到頭孢拉定含量分別為1.00、2.00、10.0 μg/kg的陽性添加樣品，3個濃度添加水平均進行6次平行實驗，考察方法的準確度；同時計算相對標準偏差(RSD)，以批內(nèi)和批間實驗結(jié)果的RSD考察方法的精密度。實驗結(jié)果如表3所示。

表3 準確度及精密度實驗結(jié)果(n=6)

各組實驗中，頭孢拉定回收率最低為77.3%(2.00 μg/kg添加水平)，最高為106.8%(1.00 μg/kg添加水平)，因此回收率范圍在77.3%～106.8%之間，符合標準(NY/T 1896-2010)《獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》中獸藥殘留檢測方法準確度的要求。

從雞肉樣品中各濃度頭孢拉定含量測定結(jié)果的相對標準偏差分析實驗精密度，批內(nèi)RSD為3.2%～10.5%，3 d重復(fù)實驗批間RSD為1.3%～5.7%，符合(NY/T 1896-2010)《獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》中獸藥殘留檢測方法精密度的要求。

2.9 樣品檢測

取市售13批雞肉，按上述方法制備樣品，上機測定，均未檢出頭孢拉定。

3 討論

本文研究了雞肉中頭孢拉定藥物殘留的提取方法和凈化方法，以及色譜、質(zhì)譜條件對實驗結(jié)果的影響，建立了采用80%乙腈溶液提取雞蛋樣品中的頭孢拉定，PRiME HLB固相萃取凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定頭孢拉定殘留量的方法。經(jīng)實驗，確定了方法的線性范圍、靈敏度，同時驗證了準確度、精密度，符合標準(NY/T 1896-2010)《獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》中獸藥殘留檢測方法性能標準要求。