沈驊睿 敖亮 王立勝 汪國(guó)友 郝琦 李婷

中圖分類(lèi)號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）09-1097-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.14

摘 要 目的：研究沙苑子多糖促進(jìn)兔半月板纖維軟骨細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“軟骨細(xì)胞”）增殖的作用機(jī)制。方法：分離1月齡新西蘭大白兔軟骨細(xì)胞。將軟骨細(xì)胞分為正常對(duì)照組（PBS）、陽(yáng)性對(duì)照組（硫酸氨基葡萄糖，10 mg/mL）和沙苑子多糖高、中、低（40、20、10 mg/mL）劑量組，分組給藥干預(yù)。采用光學(xué)顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征;采用MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖抑制率，并用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白（Col Ⅱ）、堿性磷酸酶蛋白（ALP）的表達(dá)水平;采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Western blotting法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞融合成單層，多數(shù)呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)梭型外觀。與正常對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組軟骨細(xì)胞的增殖抑制率、G1/G0期細(xì)胞百分比均顯著降低（P<0.05），S期細(xì)胞百分比和Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平及TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，沙苑子多糖高劑量組軟骨細(xì)胞的增殖抑制率、G1/G0期細(xì)胞百分比均顯著降低（P<0.05），S期細(xì)胞百分比和Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平及TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;沙苑子多糖低劑量組軟骨細(xì)胞的增殖抑制率、G1/G0期細(xì)胞百分比均顯著升高（P<0.05），S期細(xì)胞百分比和Col Ⅱ、ALP蛋白及TGF-β1、BMP-2 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）;沙苑子多糖中劑量組上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：沙苑子多糖可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，降低G1/G0期細(xì)胞百分比，促進(jìn)細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化;其作用機(jī)制可能與上調(diào)TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平升高有關(guān)。

關(guān)鍵詞 沙苑子多糖;半月板;纖維軟骨細(xì)胞;增殖;Ⅱ型膠原蛋白;堿性磷酸酶蛋白;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;骨形態(tài)發(fā)生蛋白2;機(jī)制

Study on the Mechanism of Enhancement Effects of Astragalus complanatus Polysaccharides on the Proliferation of Meniscal Fibrochondrocyte Cells in Rabbits

SHEN Huarui1，AO Liang1，WANG Lisheng1，WANG Guoyou1，HAO Qi1，LI Ting2（1.Dept. of Joint Surgery， the Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine of Southwest Medical University， Sichuan Luzhou 646000， China;2.School of Pharmacy， Southwest Medical University， Sichuan Luzhou 646000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the mechanism of enhancement effects of Astragalus complanatus polysaccharides （ACP） on the proliferation of meniscal fibrochondrocytes cells in rabbits. METHODS： The meniscal fibrochondrocytes cells were isolated from 1-month-old New Zealand white rabbits. The meniscal fibrochondrocytes cells were divided into normal control group （PBS）， positive control group （glucosamine sulfate， 10 mg/mL） and ACP high-dose， medium-dose and low-dose groups （40， 20， 10? ? ?mg/mL）. The morphology of meniscal fibrochondrocytes cells were observed under microscope. Cell proliferation rate was detected by MTT assay. Cell cycle was observed with flow cytometry. ELISA assay was used to detect relative expression of medium collagen type Ⅱ （Col Ⅱ） and alkaline phosphatase protein （ALP） in meniscal fibrochondrocytes cells. RT-qPCR and Western blotting assay were adopted to detect mRNA and protein expression of transforming growth factor β1 （TGF-β1） and bone morphogenetic protein 2 （BMP-2）. RESULTS： After cultured for 72 h， meniscal fibrochondrocytes cells were fused into a single layer， and most of them were slender type in appearance. Compared with normal control group， the proliferation rate of meniscal fibrochondrocytes cells and the percentage of cells at G1/G0 phase were decreased significantly in positive control group and ACP high-dose， medium-dose and low-dose groups （P<0.05）; the percentage of cells at S phase， protein expression of Col Ⅱ and ALP， mRNA and protein expression of TGF-β1 and BMP-2 were increased significantly （P<0.05）. Compared with positive control group， inhibitory rate of meniscal fibrochondrocytes cells proliferation and the percentage of cells at G1/G0 phase were decreased significantly in ACP high-dose group （P<0.05）， while the percentage of cells at S phase， protein expression of Col Ⅱ and ALP， mRNA and protein expression of TGF-β1 and BMP-2 were increased significantly （P<0.05）. The inhibitory proliferation rate of meniscal fibrochondrocytes cells and the percentage of cells at G1/G0 phase were increased significantly in ACP low-dose group （P<0.05）， while the percentage of cells at S phase， protein expression of Col Ⅱ and ALP， mRNA and protein expression of TGF-β1 and BMP-2 were decreased significantly （P<0.05）. There was no statistical significance in above indexes of ACP medium-dose group. CONCLUSIONS： ACP can promote the proliferation of meniscal fibrochondrocytes cells， reduce the percentage of cells at G1/G0 phase， promote cell transformation to S phase; the mechanism of which may be related to up-regulating TGF-β1， BMP-2 mRNA and protein expression， promoting Col Ⅱ and ALP protein expression enhancement.

KEYWORDS? ?Astragalus complanatus polysaccharides; Meniscal fibrochondrocytes cells; Proliferation; Col Ⅱ; ALP; TGF-β1; BMP-2; Mechanism

半月板是膝關(guān)節(jié)的重要組成部分，具有載荷、吸收震蕩、潤(rùn)滑、增加關(guān)節(jié)接觸面、營(yíng)養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨等功能，而半月板損傷會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、甚至出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每10萬(wàn)人中發(fā)生半月板損傷的患者約為60～70人[2]。半月板損傷患者多接受保留半月板或半月板重建和移植的治療辦法，但其療效仍存在較大的提升空間[3-4]。因此，研究半月板損傷治療的新途徑符合臨床需求。纖維軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成了半月板外部結(jié)構(gòu)，纖維軟骨細(xì)胞可從半月板中直接取出并進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代，是研究半月板損傷修復(fù)的重要細(xì)胞來(lái)源[5]。

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪（Astragalus complanatus R.Br.）的干燥成熟種子，歸肝腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、養(yǎng)肝明目等功效[6]。沙苑子多糖為沙苑子的主要有效成分，相關(guān)研究表明，沙苑子多糖具有體外促成骨細(xì)胞增殖的作用[7]。但是，沙苑子多糖對(duì)半月板纖維軟骨細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“軟骨細(xì)胞”）的增殖是否有促進(jìn)作用，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

關(guān)節(jié)軟骨的主要成分是膠原蛋白，其中Ⅱ型膠原蛋白（Col Ⅱ）是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，具有抵抗外界壓力、維持軟骨結(jié)構(gòu)的作用，其表達(dá)水平升高是軟骨細(xì)胞增殖的特征性指標(biāo)[8]。堿性磷酸酶（ALP）是軟骨發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵酶蛋白，其水平升高與軟骨細(xì)胞的分化與成熟密切相關(guān)[9]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族對(duì)骨形成、纖維化、傷口愈合具有調(diào)節(jié)作用[10]，其中TGF-β1是骨重建的關(guān)鍵因子，參與軟骨細(xì)胞的增殖、分化、死亡等過(guò)程[11]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）也是TGF-β超家族成員之一，是關(guān)節(jié)修復(fù)過(guò)程中必不可少的蛋白[12]。基于此，本文研究沙苑子多糖對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，并檢測(cè)細(xì)胞中Col Ⅱ、ALP蛋白和TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平變化，以期深入了解沙苑子多糖的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Gallios型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）;Multiskan fc型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;BPN-50CHUV型二氧化碳培養(yǎng)箱（青島名博環(huán)?？萍加邢薰荆? ECO 48型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（英國(guó)PCRmax公司）;MP4型垂直電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;XSP-12CAC型光學(xué)顯微鏡（上海締倫光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

沙苑子多糖（陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：171211C，純度：≥96%）;四唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)試劑盒（北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：YS171211A）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：180223CC）;RT-PCR試劑盒（南京威特森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：180115001）;細(xì)胞裂解液（南京碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：180221A）;胰蛋白酶（批號(hào)：20150623）、Ⅱ型膠原酶（批號(hào)：1225C071）均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;Col Ⅱ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（批號(hào)：1803110001）、ALP ELISA試劑盒（批號(hào)：1802150002）均購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司;流式細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Biovision公司，批號(hào)：YLN180111002）;Col Ⅱ兔單克隆抗體（批號(hào)：1801002）、ALP兔單克隆抗體（批號(hào)：1802005）、TGF-β1兔單克隆抗體（批號(hào)：1804001）、BMP-2兔單克隆抗體（批號(hào)：1804009）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，批號(hào)：2015052250）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)：1711160）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;PCR引物合成由南京科佰生物科技有限公司完成。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)新西蘭大白兔1只，雄性，1月齡，體質(zhì)量0.75 kg，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（甘） 2018-0001。

2 方法

2.1 細(xì)胞分離

參考文獻(xiàn)方法[13-14]分離軟骨細(xì)胞。將新西蘭大白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，剖取四肢膝關(guān)節(jié)半月板并剪碎成顆粒，加入0.25%的胰蛋白酶后置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化30 min;以1 500 r/min離心15 min，棄上清，向沉淀中加入0.3%Ⅱ型膠原酶后置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化4 h;取上層懸液，以1 500 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀中加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，再以5×104個(gè)/mL接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，備用。

2.2 沙苑子多糖對(duì)軟骨細(xì)胞形態(tài)的影響觀察

將軟骨細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，分為正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（硫酸氨基葡萄糖，10 mg/mL，劑量根據(jù)臨床用藥劑量及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定）和沙苑子多糖高、中、低劑量組（40、20、10 mg/mL，劑量根據(jù)文獻(xiàn)[15]及預(yù)試驗(yàn)確定），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)藥物（用磷酸鹽緩沖液配制），正常對(duì)照組加入等體積PBS。各組細(xì)胞于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)0、48、72 h后，用光學(xué)顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

2.3 沙苑子多糖對(duì)軟骨細(xì)胞增殖抑制率的影響考察

采用MTT法檢測(cè)。將軟骨細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并于藥物干預(yù)24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置于搖床避光孵育10 min后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光度值，然后計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[15]：細(xì)胞增殖抑制率=（正常對(duì)照組吸光度值-試驗(yàn)組吸光度值）/正常對(duì)照組吸光度值×100%。

2.4 沙苑子多糖對(duì)軟骨細(xì)胞周期的影響考察

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將軟骨細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，加入70%無(wú)水乙醇固定1 h后，按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)操作，然后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

2.5 沙苑子多糖對(duì)軟骨細(xì)胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平的影響考察

采用ELISA法檢測(cè)。將軟骨細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)72 h后，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)操作，檢測(cè)Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平。

2.6 沙苑子多糖對(duì)軟骨細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達(dá)水平的影響考察

采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法檢測(cè)。將軟骨細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol試劑，靜置30 min，加入1/5體積氯仿，渦旋振蕩15 s后，以12 000 r/min離心15 min。取上層清液，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻后冰浴10 min，以12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀中加入1 mL 70%無(wú)水乙醇，以12 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，風(fēng)干沉淀，加入無(wú)RNA酶水溶解沉淀。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為? cDNA，再按PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增。TGF-β1上游引物為5′-TACCACTACGGATCGTTAGA-3′，下游引物為5′-GACTGAACTAGCTAGCAATCGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為131 bp;BMP-2上游引物為5′-TAAGCTGACATGGTACCAGAT-3′，下游引物為5′-TAACGTATGACCATAGGAAT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為112 bp;β-actin上游引物為5′-ACAGTAATGCCGTAACGTTC-3′，下游引物為5′-GATGCAATGGCTCAGATAGCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為109 bp。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。然后采用熒光分析軟件對(duì)各孔ct值進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算TGF-β1、BMP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2.7 沙苑子多糖對(duì)軟骨細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2 蛋白表達(dá)水平的影響考察

采用Western blotting檢測(cè)。將軟骨細(xì)胞以1×106? ? 個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中，加入1 mL細(xì)胞裂解液，于4 ℃搖床上裂解4 h，再于4 ℃條件下以12 000? ? ?r/min離心10 min，取上清進(jìn)行BCA蛋白定量。取蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h后，加入TGF-β1、BMP-2一抗（1 ∶ 1 000），孵育過(guò)夜;以TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min;再加入相應(yīng)二抗（1 ∶ 10 000），室溫孵育2 h;以TBST緩沖液洗膜2次，每次5 min;然后加入化學(xué)發(fā)光液，以β-actin為內(nèi)參，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的相對(duì)灰度值來(lái)表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

軟骨細(xì)胞培養(yǎng)0 h時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)球形懸浮狀態(tài);培養(yǎng)48 h時(shí)，大部分細(xì)胞已出現(xiàn)貼壁，細(xì)胞形態(tài)拉長(zhǎng)，呈多角形，偶見(jiàn)橢圓形貼壁細(xì)胞;培養(yǎng)72 h時(shí)，細(xì)胞融合成單層，多數(shù)呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)梭型外觀，少部分仍為橢圓形外觀，表明軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)成功，詳見(jiàn)圖1。

3.2 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后的細(xì)胞增殖抑制率均顯著降低（P<0.05）;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，沙苑子多糖高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后細(xì)胞增殖抑制率均顯著降低（P<0.05），沙苑子多糖低劑量組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高（P<0.05），沙苑子多糖中劑量組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后細(xì)胞增殖抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表1。

3.3 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組G1/G0期細(xì)胞百分比均顯著降低，S期細(xì)胞百分比均顯著升高（P<0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，沙苑子多糖高劑量組G1/G0期細(xì)胞百分比顯著降低，S期細(xì)胞百分比顯著升高（P<0.05）;沙苑子多糖低劑量組G1/G0期細(xì)胞百分比顯著升高，S期細(xì)胞百分比顯著降低（P<0.05）;沙苑子多糖中劑量組G1/G0期和S期細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)圖2、表2。

3.4 細(xì)胞中Col Ⅱ、ALP蛋白相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組細(xì)胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，沙苑子多糖高劑量組細(xì)胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），沙苑子多糖低劑量組細(xì)胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），沙苑子多糖中劑量組細(xì)胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表3。

3.5 細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，沙苑子多糖高劑量組細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），沙苑子多糖低劑量組細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），沙苑子多糖中劑量組細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表4。

3.6 細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，沙苑子多糖高劑量組細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），沙苑子多糖低劑量組細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），沙苑子多糖中劑量組細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)圖3、表5。

4 討論

半月板損傷常出現(xiàn)在交通傷和運(yùn)動(dòng)傷中，常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的機(jī)械性阻礙，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙[16]。該損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重骨性關(guān)節(jié)炎，甚至致殘[17]。目前，臨床常用硫酸氨基葡萄糖治療半月板損傷，其具有抗炎、改善關(guān)節(jié)功能、抑制關(guān)節(jié)軟骨損傷的作用[18]，故本研究將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

“腎主骨，生髓”是傳統(tǒng)中醫(yī)理論，沙苑子具有補(bǔ)腎助陽(yáng)的功效，常用于治療遺尿、尿頻[6]。有研究報(bào)道，沙苑子可清除骨骼肌氧化自由基，提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力[19]。此外，沙苑子和狗脊、肉蓯蓉等聯(lián)合用藥可治療大鼠骨質(zhì)疏松[20]。沙苑子多糖是沙苑子的主要成分之一，但其對(duì)軟骨細(xì)胞的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本研究使用沙苑子多糖處理兔軟骨細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙苑子多糖可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞增殖活性。另有研究表明，ALP活性增加可促進(jìn)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞分化成熟[21]。本研究使用沙苑子多糖處理兔半月板纖維軟骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中Col Ⅱ、ALP蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，表明沙苑子多糖對(duì)Col Ⅱ和ALP的表達(dá)具有促進(jìn)作用。

BMP-2可刺激蛋白多糖合成，促進(jìn)軟骨分化，促進(jìn)軟骨修復(fù)[22]。Col Ⅱ和ALP是TGF-β1/BMP-2信號(hào)通路的下游信號(hào)因子，當(dāng)TGF-β1和BMP-2聯(lián)合在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)Col Ⅱ、ALP蛋白的高表達(dá)，從而促進(jìn)骨增殖與分化[23]。本研究結(jié)果顯示，沙苑子多糖處理兔半月板纖維軟骨細(xì)胞后可顯著升高TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平，由此表明，Col Ⅱ和ALP的表達(dá)升高可能與沙苑子多糖上調(diào)TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，沙苑子多糖可促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞的增殖，降低G0/G1期細(xì)胞百分化，促進(jìn)細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化;其機(jī)制可能與上調(diào)TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)Col Ⅱ、ALP蛋白表達(dá)水平升高有關(guān)。

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（收稿日期：2020-01-12 修回日期：2020-03-11）

（編輯：唐曉蓮）