薛巧如 袁進燁 丁劉洋 鄭偉軍 鄧鋒

中圖分類號 R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）09-1108-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.16

摘 要 目的：建立超高效液相色譜法（UPLC）法測定注射用特利加壓素中有關物質的含量。方法：采用UPLC法測定5批注射用特利加壓素制劑中有關物質的含量。色譜柱為Xtimate UPLC C18，流動相A為硫酸銨緩沖液（pH 2.3）-甲醇（90 ∶ 10，V/V），流動相B為硫酸銨緩沖液（pH 2.3）-甲醇（60 ∶ 40，V/V），梯度洗脫，流速為0.2 mL/min，檢測波長為210 nm，進樣量為5 μL。結果：注射用特利加壓素中雜質A、B、C、D、F、H、I、K、L、N的檢測質量濃度線性范圍為0.43～3.86、0.44～3.95、0.44～3.97、0.45～4.08、0.45～4.05、0.50～4.50、0.47～4.26、0.47～4.23、0.46～4.13、0.44～3.96 μg/mL（r≥0.999 7）;檢測限分別為0.04、0.04、0.05、0.04、0.05、0.05、0.05、0.05、0.04 μg/mL，定量限分別為0.13、0.13、0.14、0.13、0.15、0.14、0.14、0.14、0.13 μg/mL;精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗的RSD均小于8%;平均加樣回收率分別為94.95%、97.81%、101.88%、95.26%、93.40%、102.48%、104.26%、102.31%、96.42%、90.42%，RSD%分別為 1.89%、 1.86%、0.68%、1.30%、1.98%、3.36%、1.26%、1.30%、1.19%、1.40%（n=9）。5批注射用特利加壓素制劑中雜質總含量均小于4%。結論：建立的方法快速、簡便、準確、專屬性強，可用于注射用特利加壓素中有關物質的定量分析。

關鍵詞 超高效液相色譜法;注射用特利加壓素;有關物質;含量測定

Content Determination of Related Substances in Terlipressin for Injection by UPLC

XUE Qiaoru，YUAN Jinye，DING Liuyang，ZHENG Weijun，DENG Feng（Guangdong Institute for Drug Control/NMPA Key Laboratory of Quality Control of Blood Products/Key Laboratory of Quality Control and Research of Blood Products， Guangzhou， 510663， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish UPLC method for the content determination of related substances in Terlipressin for injection. METHODS： UPLC method was used to determine the contents of related substances in 5 batches of Terlipressin for injection. The separation was performed on Xtimate UPLC C18 column with mobile phase A consisted of ammonium sulfate buffer （pH 2.3） -methanol （90 ∶ 10， V/V） and mobile phase B consisted of ammonium sulfate buffer （pH 2.3） -methanol （60 ∶ 40， V/V） （gradient elution） at the flow rate of 0.2 mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm， and sample size was 5 μL. RESULTS： The linear range of impurity A， B， C， D， F， H， I， K， L and N were 0.43-3.86， 0.44-3.95，0.44-3.97，0.45-4.08，0.45-4.05，0.50-4.50，0.47-4.26， 0.47-4.23，0.46-4.13，0.44-3.96 μg/mL （r≥0.999 7）， respectively. The detection limits were 0.04， 0.04， 0.05， 0.04， 0.05， 0.05， 0.05， 0.05， 0.04 μg/mL. The quantitation limits were 0.13， 0.13， 0.14， 0.13， 0.15， 0.14， 0.14， 0.14， 0.13 μg/mL， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability tests were all lower than 8%. The average recoveries were 94.95%， 97.81%， 101.88%， 95.26%， 93.40%， 102.48%， 104.26%， 102.31%， 96.42%， 90.42%， with RSDs of 1.89%， 1.86%， 0.68%， 1.30%， 1.98%， 3.36%， 1.26%， 1.30%， 1.19%， 1.40% （n=9）， respectively. Total contents of impurities in 5 batches of Terlipressin for injection were all lower than 4%. CONCLUSIONS： Established method is rapid， simple， accurate and specific， which can be used for the quantitative analysis for related substances in Terlipressin for injection.

KEYWORDS? ?UPLC; Terlipressin for injection; Related substance; Content determination

注射用特利加壓素的主成分為醋酸特利加壓素（Terlipressin），其化學名為L-甘氨酰-L-甘氨酰-L-甘氨酰-L-半胱氨酰-L-酪氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰氨酰-L-天冬酰氨酰-L-半胱氨酰-L-脯氨酰-L-賴氨酰-L-甘氨酰胺醋酸鹽（4→9-二硫環(huán)）[1]。醋酸特利加壓素是人工合成的一種新型長效血管加壓素，本身無活性，在體內氨基肽酶的作用下切除三甘氨?；?，從而緩慢釋放活性代謝產物賴氨酸加壓素，發(fā)揮療效[2-3]。臨床主要用于肝硬化靜脈曲張出血的止血[4-5]，在治療難治性休克、肝硬化腹水也有較好的臨床應用前景[6-7]。

醋酸特利加壓素于20世紀80年代由德國輝凌公司研發(fā)并生產上市，目前，國內僅有1家企業(yè)研發(fā)生產。2017年版《歐洲藥典》[8]新收載的醋酸特利加壓素藥品標準中采用高效液相色譜法分析特利加壓素的9種降解雜質及3種工藝雜質（雜質A～L），但經本課題組前期驗證后發(fā)現(xiàn)，雜質I和F不能有效分開，且無法檢出雜質N。國家藥典委員會于2015年3月發(fā)布的“關于注射用特利加壓素國家標準的公示”[8]中該制劑的有關物質的檢查項也采用高效液相色譜法，但并未規(guī)定對各雜質峰進行定性分析;后續(xù)本課題組采用此標準方法對各雜質進行定性分析后發(fā)現(xiàn)，醋酸特利加壓素峰和雜質A、C峰的分離度小于1.5，雜質H、I、F不能有效分離，且無法檢出雜質N?；诖?，筆者擬建立超高效液相色譜（UPLC）法對注射用特利加壓素中的10種雜質（雜質A、B、C、D、F、K、L、I、H、N）進行考察，以期控制該制劑的雜質，也為該制劑中有關物質的檢測提供新的方法。注射用特利加壓素中10種雜質的信息見表1。

1 材料

1.1 儀器

Vanquish 系列UPLC儀、全自動進樣器、紫外檢測器（美國Thermo Fisher Scientific 公司）; e2695 型高效液相色譜儀、全自動進樣器、2489紫外檢測器（美國Waters公司）;十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

醋酸特利加壓素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150701-201501，純度：85.4%）;雜質A（批號：RSCY-15401001，純度：88.0%）、雜質B（批號：RSCY- 15402001，純度：87.2%）、雜質C（批號：RSCY-15403001，純度：85.0%）、雜質D（批號：RSCY-15404001，純度：91.6%）、雜質F（批號：RSCY-15405001，純度：95.3%）、雜質K（批號：RSCY-15408001，純度：95.3%）、雜質L（批號：RSCY-15409001，純度：94.7%）、雜質I（批號：RSCY- 15407001，純度：90.7%）、雜質H（批號：RSCY-15406001，純度：92.3%）、雜質N（批號：RSCY-15411001，純度：89.4%）均為甲企業(yè)自制;注射用特利加壓素制劑1（甲企業(yè)，批號：P10371C）、制劑2（甲企業(yè)，批號：M1503C）、制劑3（甲企業(yè)，批號：P13208C）、制劑4（乙企業(yè)，批號：1227181104）、制劑5（乙企業(yè)，批號：1127190301）的規(guī)格均為1 mg/支（相當于特利加壓素0.86 mg）;甲醇為色譜純，硫酸銨為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Xtimate UPLC C18（100 mm×2.1 mm，1.8? ?μm）;硫酸銨緩沖液（取硫酸銨6.6 g，加1 000 mL水溶解，用硫酸調節(jié)pH至2.3，下同）-甲醇（90：10，V/V）為流動相A，硫酸銨緩沖液-甲醇（60 ∶ 40，V/V）為流動相B，梯度洗脫 50 min;流速為0.2 mL/min;進樣量為5 μL;檢測波長為210 nm;柱溫為40 ℃。梯度洗脫條件見表2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性溶液的制備 精密稱取雜質A、B、C、D、F、H、I、K、L、N對照品各適量，用0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL中約含0.1 mg各雜質的溶液，作為混合雜質對照品母液;精密稱取醋酸特利加壓素對照品25 mg，加入上述對照品母液1 mL，用0.9%氯化鈉溶液定容至50 mL，即得系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取醋酸特利加壓素對照品12 mg，用0.9%氯化鈉溶液定容至100 mL，搖勻，制成每1 mL約含0.1 mg特利加壓素的溶液，作為特利加壓素對照品溶液;精密量取上述溶液1.0 mL，加入“2.2.1”項下混合雜質對照品母液1.0 mL，用0.9%氯化鈉溶液定容至50 mL，即得混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取注射用特利加壓素制劑1支，精密加入0.9%氯化鈉溶液2 mL溶解，制成每1 mL中的含有特利加壓素0.43 mg的供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2.1”項下系統(tǒng)適用性溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，各物質相鄰峰間的分離度較好，理論板數(shù)均大于3 000。系統(tǒng)適用性試驗色譜圖見圖1，特利加壓素及各雜質的保留時間、分離度和理論板數(shù)見表3。

2.4 專屬性試驗

2.4.1 輔料干擾試驗 取甘露醇5.08 g，加水400 mL溶解，加稀鹽酸調節(jié)pH至3.51，然后加水稀釋至500 mL，搖勻，即得空白輔料溶液;精密量取5 μL空白輔料溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，詳見圖2。結果，注射用特利加壓素的輔料及溶劑對特利加壓素的測定無干擾。

2.4.2 破壞性試驗 取1支注射液用特利加壓素制劑3，加入2 mL 0.9%氯化鈉溶液溶解，作為未破壞樣品溶液。另取6份制劑3，按以下條件進行破壞——（1）酸破壞：取1支注射液用特利加壓素制劑3，加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL溶解，于室溫放置1 h后，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL中和，即得酸破壞溶液。（2）堿破壞：取1支注射液用特利加壓素制劑3，加 1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL溶解，于室溫放置20 min后，加1 mol/L鹽酸溶液1 mL中和，即得堿破壞溶液。（3）高溫破壞：取1支注射液用特利加壓素制劑3，置于80 ℃恒溫箱中放置1 d后，加入0.9%氯化鈉溶液2 mL溶解，即得高溫破壞溶液。（4）高濕破壞：取1支注射液用特利加壓素制劑3，敞口置于高濕（恒溫干燥器，下部放置硫酸銨飽和溶液）室溫環(huán)境中24 h后，加0.9%氯化鈉溶液2 mL溶解，即得高濕破壞溶液。（5）光照破壞：取1支注射液用特利加壓素制劑3，于室溫條件下光照[光照強度為（4 500±500） lx]48 h后，加0.9%氯化鈉溶液2 mL溶解，即得光破壞溶液。（6）氧化破壞：取1支注射液用特利加壓素制劑3，加入3%過氧化氫溶液2 mL溶解，于室溫放置5 h后，即得氧化破壞溶液。將上述未破壞樣品溶液與6種破壞試驗樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。結果顯示，在不同破壞條件下，特利加壓素峰與降解產物峰均能有效分離，其中酸破壞、堿破壞、氧化破壞試驗樣品中雜質明顯增多，但光照破壞、高溫破壞、高濕破壞試驗樣品中各雜質較少，表明特利加壓素在酸性、堿性和氧化條件不穩(wěn)定，易降解。破壞性試驗圖譜見圖2。

2.5 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合雜質對照品母液和“2.2.2”項下特利加壓素對照品溶液適量混合，分別用0.9%氯化鈉溶液稀釋制成每1 mL中含特利加壓素和雜質A、B、C、D、F、K、L、I、H、N均約為0.4、1.2、2.0、3.0、4.0 μg的系列溶液。吸取上述系列溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。分別以特利加壓素和各雜質的質量濃度為橫坐標（x）、相應峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，結果詳見表4。

2.6 檢測限與定量限考察

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，加入0.9%氯化鈉溶液逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以信噪比為3 ∶ 1、10 ∶ 1分別計算檢測限和定量限。結果，特利加壓素和雜質A、B、C、D、F、K、L、I、H、N的檢測限及定量限見表2。

2.7 精密度試驗

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果，特利加壓素和雜質A、B、C、D、F、H、I、L、K、N峰面積的RSD均小于1%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.8 重復性試驗

取注射液用特利加壓素制劑1，平行6份操作，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，并以外標法計算各雜質的含量。結果，雜質A、B、C、D、F、H、I、L、K、N的含量分別為0.3%、0.2%、0.04%、0.02%、0.7%、0.3%、1.7%、0.2%、0.1%、0.1%，RSD分別為3.1%、3.9%、7.1%、5.2%、6.6%、7.3%、7.7%、6.2%、7.7%、2.1%（n=6）。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取注射液用特利加壓素制劑1，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、2、8、16、24、48 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果，雜質A、B、C、D、F、H、I、L、K、N峰面積的RSD均小于1%（n=6）。這表明供試品溶液在室溫下放置48 h的穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密量取“2.2.1”項下混合雜質對照品母液1 mL，分別用0.9%氯化鈉稀釋至200、100 mL，搖勻，分別作為50%回收測定用加標溶液1和100%回收測定用加標溶液2;另精密量取“2.2.1”項下混合雜質對照品母液1.2 mL，用0.9%氯化鈉稀釋至100 mL，搖勻，作為120%回收測定用加標溶液3。取9支已知雜質含量的注射液用特利加壓素制劑1，每3支分別加入4 mL上述回收測定用加標溶液1、2、3，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。結果，雜質A、B、C、D、F、H、I、K、L、N的平均加樣回收率為94.95%、97.81%、101.88%、95.26%、93.40%、102.48%、104.26%、102.31%、96.42%、90.42%，RSD%分別為 1.89%、 1.86%、0.68%、1.30%、1.98%、3.36%、1.26%、1.30%、1.19%、1.40%（n=9）。

2.11 樣品中有關物質的含量測定

取注射用特利加壓素制劑1～5，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，量取供試品溶液和“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。雜質A、B、C、D、F、H、I、K、N含量按外標法計算，未知雜質含量按主成分自身對照品法計算，結果見表5。

3 討論

3.1 雜質來源分析

醋酸特利加壓素屬于有活性的多肽類藥物，是心血管疾病與泌尿系統(tǒng)疾病的治療藥物[9]。多肽類藥物具有活性強、不穩(wěn)定、易降解的特點，質量控制的項目應重點關注有關物質檢查項。多肽藥物的有關物質主要分為4類：工藝雜質如斷裂肽、缺失肽和錯結肽等產物;降解雜質如多肽脫酰胺、氧化、還原、二硫鍵錯配等的產物;聚合物如二聚體及多聚體;光學雜質如消旋體、非對映異構體[10]。其有關物質與其組成氨基酸的結構和特性有關，如組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、苯丙氨酸（Phe）等易消旋，天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）等易水解，蛋氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、色氨酸（Trp）等易氧化等[11-12]?；诖耍P者再結合各雜質結構特點推測醋酸特利加壓素的雜質A、B、C為降解雜質，雜質D、F、H為氧化雜質，雜質I、K、L為水解雜質，雜質N為聚合雜質。

3.2 色譜系統(tǒng)選擇

本課題組前期考察了不同色譜柱[Ultimate UHPLC Lp-C18、Ultimate UHPLC AQ-C18、Xtimate UPLC C18、Acquity UPLCTM? BEH C18]、不同柱溫（25、30、35、40 ℃）、檢測波長范圍（210～280 nm）對特利加壓素和各雜質的分離效果，結果發(fā)現(xiàn)，選擇Xtimate UPLC C18色譜柱、柱溫為40 ℃、檢測波長為210 nm時能有效分離特利加壓素和各雜質。

3.3 UPLC法測定有關物質含量的優(yōu)點

采用2017年版《歐洲藥典》中的高效液相色譜法檢測特利加壓素的有關物質時發(fā)現(xiàn)，雜質I和雜質F相對保留時間相同，無法得到有效分離，且雜質N無法檢出。本試驗建立的UPLC法可較好地解決上述問題。結果顯示，雜質I和雜質F的分離度可達到1.3;雜質N可檢出，保留時間為25 min左右。與原HPLC法[8]比較，UPLC法縮短了注射用特利加壓素中有關物質的分析時間，減少了有機試劑的使用，大大節(jié)約了成本，后續(xù)可為注射用特利加壓素有關物質的檢測提供新方法。

參考文獻

[ 1 ] 劉倩，李震，張媛，等.首批醋酸特利加壓素化學對照品的研制[J].中國藥事，2019，33（4）：402-407.

[ 2 ] 戚虎昶，凌靜，盧芳芳.特利加壓素臨床研究進展[J].解放軍藥學學報，2012，28（2）：169-172.

[ 3 ] 蔡文昌. N-α-三甘氨酰-8-賴氨酸-加壓素對殘肝再生的作用及其機制的研究[D].上海：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學，2018.

[ 4 ] 李曉路，李磊.特利加壓素在肝硬化食管胃靜脈曲張出血中的應用[J].臨床肝膽病雜志，2019，35（10）：2308-2311.

[ 5 ] 李海英，邵獻潔.醋酸奧曲肽注射液聯(lián)合特利加壓素治療肝硬化上消化道出血的療效觀察及護理[J].實用醫(yī)技雜志，2015，22（12）：1357-1359.

[ 6 ] 黎發(fā)家.肝葉切除術后預防性使用特利加壓素30例報道[J].中國衛(wèi)生產業(yè)，2013，10（5）：88.

[ 7 ] SENDAR C，SILVA RUIZ MDP，F(xiàn)ERRER RIOS MT，? et al. Noradrenaline as an alternative medical treatment to terlipressin in the management of hepatorenal syndrome type 1[J]. Gastroenterol Hepatol，2018，41（7）：440-441.

[ 8 ] 國家藥典委員會.關于注射用醋酸特利加壓素國家標準的公示[EB/OL].（2015-03-03）[2018-06-13]. http：//www. chp.org.cn/view/402887ab4d273651014d2737aaaa07eb？a=BZHXYP.

[ 9 ] European Pharmacopoeia Committee. European Pharmacopoeia[S]. 2017 version. Strasbourg：the European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care of the Council of Europe，2017：4623-4624.

[10] 王克全，徐寒梅.多肽類藥物的研究進展[J].藥學進展，2015，39（9）：642-650.

[11] 田文靜，任雪，廖海明，等.多肽類藥物質量控制研究進展[J].藥物分析雜志，2013，33（7）：1115-1120.

[12] 胡玉璽，蔣煜，韓天嬌.制備工藝和過程對合成多肽藥物有關物質的影響[J].中國新藥雜志，2017，26（18）：2143- 2148.

（收稿日期：2020-01-30 修回日期：2020-03-11）

（編輯：唐曉蓮）