一種牦牛曲拉干酪素的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)

何林楓 蔡麗莎 楊寬 曾珍 李誠(chéng)

摘要：為了研究牦牛曲拉干酪素的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)，以牦牛曲拉為原料，將胃蛋白酶、木瓜凝乳酶、酵母凝乳酶復(fù)配成復(fù)合凝乳酶，用混合凝乳酶制備牦牛曲拉干酪素，對(duì)牦牛曲拉干酪素的基本成分、氨基酸組成、蛋白質(zhì)組成、紅外光譜特性、圓二光譜特性、變性溫度等進(jìn)行分析，并模擬食品加工體系中的不同溫度、pH值，觀察其對(duì)牦牛曲拉干酪素功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，牦牛曲拉干酪素中谷氨酸含量最高，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的42%;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）測(cè)定結(jié)果表明，牦牛曲拉干酪素蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在25 000～37 000。用紅外光譜分析檢測(cè)得到-NH、C=O等特征官能團(tuán)，用圓二色光譜鑒定得出，牦牛曲拉干酪素是無(wú)規(guī)則卷曲型蛋白質(zhì)，其中α-螺旋占11.3%，β-折疊占26.8%，β-轉(zhuǎn)角占23.3%，無(wú)規(guī)則卷曲占38.6%。研究結(jié)果還表明，牦牛曲拉干酪素的熱穩(wěn)定性較高，變性溫度達(dá)到123 ℃左右。牦牛曲拉干酪素的主要功能特性如下：當(dāng)溫度接近50 ℃時(shí)，具有優(yōu)良的溶解性、乳化性、發(fā)泡穩(wěn)定性;在較高溫度（50～70 ℃）下，持油性、發(fā)泡能力明顯增強(qiáng);在pH值為3～11條件下，除等電點(diǎn)（pH值=4.6）外，有較優(yōu)良的功能特性;在中性條件下，干酪素溶液的表觀黏度最大，最小凝膠含量最低。

關(guān)鍵詞：牦牛;曲拉;干酪素;結(jié)構(gòu)性質(zhì);功能性質(zhì)

中圖分類號(hào)：TS252.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）03-0709-11

Structural and functional properties of casein made from yak Qula

HE Lin-feng，CAI Li-sha，YANG Kuan，ZENG Zhen，LI Cheng

（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Yaan 625014， China）

Abstract：To characterize the structural and functional properties of casein made from yak Qula by complex rennin containing pepsin， chymopapain and yeast rennin， the basic components， amino acid composition， protein composition， infrared spectroscopy， circular dichroism and denaturation temperature of the casein were studied. Different temperatures and pH values in food processing system were simulated to observe the effects on functional characteristics of casein made from yak Qula. The results showed that the content of glutamic acid was highest in casein， and the content ratio of essential amino acids to total amino acids was 42%. The results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） indicated that the relative molecular weight of casein protein in yak gula mainly ranged from 25 000 to 37 000. The functional groups such as carbonyl and imino groups were detected by infrared spectrum analysis. The results of circular dichroism chromatography showed that casein was a kind of random coil protein， and it was found that the α-helix accounted for 11.3%， the β-fold accounted for 26.8%， the β-corner accounted for 23.3%， and the random coil accounted for 38.6%. In addition， casein showed high thermal stability with the denaturation temperature of 123 ℃. The main functional characteristics of casein made from yak Qula are as follows： the casein has excellent solubility， emulsification and foaming stability when the system temperature is close to 50 ℃; the oil-holding and foaming capacity of casein are significantly enhanced at relatively higher temperature（50-70 ℃）; when the pH value was 3.0-11.0， except for the isoelectric point（pH=4.6）， the casein has excellent functional properties; the rheological properties are optimal under neutral condition.

Key words：yak; Qula; casein; structural properties; functional properties

牦牛是在貧瘠的高原地區(qū)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇和適應(yīng)后形成的一種特殊牛種，其分泌的乳汁中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等，且含量顯著高于其他牛種，這些營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)人體的生理活動(dòng)都有非常重要的作用[1]。在牦牛乳中，酪蛋白含量高達(dá)34.28～45.79 g/L，約為普通牛乳的1.5倍，因而牦牛乳可作為優(yōu)良的乳源應(yīng)用到乳品加工中[2]。中國(guó)的牦牛主要生長(zhǎng)在西藏、青海、新疆、四川、甘肅和云南6個(gè)?。▍^(qū)），數(shù)量達(dá)到了世界總數(shù)的94%。中國(guó)西部人民（本研究中主要指藏族）僅提煉牦牛乳的脂肪部分進(jìn)行食用，而將脫脂牦牛乳在自然條件下經(jīng)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸后凝固、結(jié)塊、風(fēng)干得到的產(chǎn)品曲拉并未被充分利用[3-4]，造成大量?jī)?yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。干酪素又名酪蛋白，是一種性能獨(dú)特的天然蛋白質(zhì)基礎(chǔ)原料，在國(guó)外主要以鮮乳為原料生產(chǎn)得到[5]，而國(guó)內(nèi)由于乳資源匱乏、成本高昂且在運(yùn)輸過(guò)程中容易造成鮮乳腐敗變質(zhì)，因此目前干酪素產(chǎn)業(yè)發(fā)展較慢，基本沒(méi)有形成市場(chǎng)化[6]。以牦牛曲拉為原料，經(jīng)堿溶脫脂、凝乳沉淀、干燥粉碎等工序，即可得到牦牛曲拉干酪素[7]。干酪素可以作為食品添加劑或品質(zhì)改良劑廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工等領(lǐng)域。國(guó)外相關(guān)報(bào)道顯示，干酪素的功能特性可以通過(guò)物理、化學(xué)手段得到提升[8]，從而為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型功能性干酪素提供了思路。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于牦牛的研究主要集中在牦牛群落、牦牛奶中細(xì)菌多樣性方面，其副產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道[9]。

本研究以牦牛曲拉干酪素為研究對(duì)象，對(duì)干酪素進(jìn)行產(chǎn)品品質(zhì)分析，包括基本成分測(cè)定、氨基酸組成測(cè)定、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分析、紅外光譜分析、圓二色光譜（Circular dichroism， CD）分析、熱力學(xué)性質(zhì)分析等，并模擬食品加工中的不同酸堿度、加熱溫度等條件，探索其對(duì)牦牛曲拉干酪素功能性質(zhì)的影響，以期為用復(fù)合酶制備的牦牛曲拉干酪素在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定參考，從而擴(kuò)大曲拉干酪素的應(yīng)用范圍，增加牦牛產(chǎn)業(yè)的附加值。

1材料與方法

1.1材料與試劑

曲拉，購(gòu)自四川甘孜藏族自治州瀘定縣;小牛皺胃酶（酶活性≥20 000 U/g），購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich科技公司;胃蛋白酶（酶活性≥800 000 U/g），購(gòu)自上海瑞永生物科技有限公司;木瓜凝乳酶（酶活性≥20 000 U/g），購(gòu)自廣西龐博生物工程有限公司;酵母凝乳酶（酶活性≥60 000 U/g），購(gòu)自DSM有限公司。

SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白marker，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;NaOH、HCl、KBr、石油醚、乙醚，購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司;濃鹽酸為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;玉米油、大豆油，購(gòu)自中糧國(guó)際（北京）有限公司四川分公司;試驗(yàn)用水為超純水，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備

KDN-1全自動(dòng)凱氏定氮儀，購(gòu)自上海儀田精密儀器有限公司;Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、Bio-Rad Powerpac Basic電泳儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;S433D全自動(dòng)氨基酸分析儀，購(gòu)自德國(guó)Sykam公司;NicoletIS10傅里葉變換紅外光譜儀，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;Chirascan-plus圓二色光譜儀，購(gòu)自英國(guó)應(yīng)用光物理公司;Q200MDSC差示掃描量熱儀、DHR-1旋轉(zhuǎn)流變儀，購(gòu)自美國(guó)TA儀器[沃特世科技（上海）有限公司];RCD-1A高速均質(zhì)乳化機(jī)，購(gòu)自常州越新儀器制造有限公司;MICROMAX高速離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;V-1200可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1牦牛曲拉干酪素的制備工藝流程：原料粉碎→堿液溶解→過(guò)濾→離心分離→巴氏殺菌→冷卻→凝乳→洗滌→烘干→成品。

牦牛曲拉經(jīng)42 ℃鼓風(fēng)干燥后粉碎過(guò)篩，按照1∶11（g∶ml）的料液比加入蒸餾水后，緩緩滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的氫氧化鈉溶液，于65 ℃水浴鍋中攪拌溶解30 min，溶解后用100目濾布過(guò)濾除雜，于4 000 r/min離心20 min，倒出上清液，先用鹽酸調(diào)節(jié)上清液的pH值至6.3，再添加1%復(fù)合酶（酶胃蛋白酶、木瓜凝乳酶、酵母凝乳酶的質(zhì)量比為0.60∶0.18∶0.22），在復(fù)合酶添加量為1%、溫度為45 ℃、凝乳時(shí)間為30 min、CaCl2添加量為1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的條件下凝乳，將所得凝乳水洗、脫水、造粒、干燥后備用[10]。

1.3.2牦牛曲拉干酪素基本成分的測(cè)定水分含量的測(cè)定參照GB5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》;脂肪含量的測(cè)定參照GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的測(cè)定》;蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。

1.3.3牦牛曲拉干酪素中氨基酸組成的測(cè)定牦牛曲拉干酪素中氨基酸組成的測(cè)定參照GB5009.124-2016《食品中氨基酸的測(cè)定》，采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定;色氨酸含量的測(cè)定參照GB/T 15400-2018《飼料中色氨酸的測(cè)定》，采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析SDS-PAGE分析參考管方方等[11-12]的報(bào)道，并稍作改動(dòng)。電泳樣品的制備過(guò)程：稱取0.2 g牦牛曲拉干酪素粉末于具塞三角瓶中，加入20 ml濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液，水浴煮沸溶解，然后用0.1 mol/L樣品緩沖液定容到100 ml。將制備好的樣品和上樣緩沖液混合，按照樣品、緩沖液體積比為1∶1的比例配制成1 ml溶液后搖勻，用沸水浴加熱5 min制得電泳樣，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS-PAGE分析所用12%分離膠和4%濃縮膠的配制方法參照試劑盒說(shuō)明書。電泳條件：5 μl Marker上樣量，10 μl樣品上樣量，保持150 V恒壓至蛋白質(zhì)染液進(jìn)入分離膠，保持120 V恒壓至蛋白質(zhì)染液停在分離膠底部，關(guān)閉電源。電泳結(jié)束后，依次對(duì)電泳膠片進(jìn)行固定、染色、脫色，然后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行拍照分析。

1.3.5傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析將2.0 mg牦牛曲拉干酪素粉末與預(yù)先干燥的0.2 g溴化鉀混合研磨后壓片，用NicoletIS10型傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定紅外光譜，掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。

1.3.6圓二色光譜分析參考孔繁華等[13]的方法，用Chirascan-plus型圓二色光譜儀測(cè)定光譜，配制濃度為0.5 mg/ml的樣品溶液，記錄的光譜數(shù)據(jù)是3次樣品掃描光譜數(shù)據(jù)各自減去緩沖光譜數(shù)據(jù)的平均值。測(cè)定參數(shù)如下：掃描波長(zhǎng)為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min，比色皿光徑為1 mm，數(shù)據(jù)間隔為1.0 nm，帶寬為2.0 nm，掃描次數(shù)為3次。

1.3.7差示掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC）分析參考Wee等[14]的方法，對(duì)牦牛曲拉干酪素進(jìn)行熱變性分析。取10.0 mg樣品于坩堝中密封，以空坩堝作為空白對(duì)照，置于Q200MDSC型差示掃描量熱儀中，在溫度為20～190 ℃、氮?dú)饬魉贋?0 ml/min的條件下記錄其熱力學(xué)曲線。

1.3.8牦牛曲拉干酪素的功能性質(zhì)分析參考胡濤等[15]的方法，將牦牛曲拉干酪素配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml的溶液，在室溫下低速攪拌3 h。分別移取100 ml 1.0 mg/ml牦牛曲拉干酪素溶液，在2 min內(nèi)用濃度為1.0 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至3～11，分別置于不同溫度（40～80 ℃）的水浴中加熱30 min，得到用不同條件處理的待測(cè)溶液。

1.3.8.1溶解性的測(cè)定參考Du等[16]的方法，將待測(cè)溶液分別離心（20 min、3 500 r/min），并在280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量，按照式（1）計(jì)算其溶解度：

溶解度=上清液中蛋白質(zhì)含量總蛋白質(zhì)含量×100%（1）

1.3.8.2乳化性的測(cè)定（1）乳化活力指數(shù)（Emulsifying activity index， EAI）及乳化穩(wěn)定性（Emulsion stability， ES）的測(cè)定。參照J(rèn)iang等[17]的方法，分別取6 ml待測(cè)溶液加入離心管中，再加入2 ml玉米油，用高速均質(zhì)機(jī)于20 000 r/min分散1 min，獲得乳濁液，取50 μl乳濁液，加入5 ml質(zhì)量濃度為0.1 g/L的SDS溶液，用渦旋混合儀混合5 s后，在500 nm處測(cè)定吸光度，記為A0;將乳濁液靜置10 min后，再次測(cè)定吸光度，記為A10。EAI（m2/g）、ES（%）分別根據(jù)式（2）、式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中，C為樣品溶液的質(zhì)量濃度（g/ml），θ為乳液中油相的體積比率，本研究中取0.25，A0為乳液靜置0 s時(shí)的吸光度，A10為乳液靜置10 min時(shí)的吸光度。

（2）乳化能力（Emulsion capacity， EC）的測(cè)定。參考Mir等[18]的方法測(cè)定牦牛曲拉干酪素的乳化能力。分別取20 ml待測(cè)溶液加入容量為250 ml的不同燒杯中，再分別加入20 ml玉米油，用高速均質(zhì)機(jī)分散2 min后，將分散液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，于4 000 r/min離心10 min，立刻測(cè)量油層體積V0 （ml）。EC的計(jì)算公式如下：

1.3.8.3發(fā)泡性能的測(cè)定參考Lonchamp等[19]的方法并稍作修改，對(duì)牦牛曲拉干酪素樣品的發(fā)泡性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。分別取20 ml待測(cè)溶液置于250 ml燒杯中，選用刀片式攪拌機(jī)，于20 000 r/min攪拌1 min，立即讀出泡沫體積V1（ml），靜置30 min后再次測(cè)量泡沫體積V2（ml），其發(fā)泡性（Foaming capability， FC）及發(fā)泡穩(wěn)定性（Foaming stability， FS）分別按照式（5）、式（6）計(jì)算：

式中，V1為0 min時(shí)泡沫總體積，V2為30 min時(shí)泡沫總體積。

1.3.8.4持油性的測(cè)定參考Vioque等[20]的方法，稱取質(zhì)量為m0（0.5 g左右）的牦牛曲拉干酪素于離心管內(nèi)，記錄離心管和樣品的質(zhì)量為m1，接著加入少量大豆油，在渦旋混合儀上混合1 min后，再加入少許大豆油進(jìn)行混合。分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，冷卻后于4 000 r/min離心20 min，棄去上層油，稱取離心管和樣品質(zhì)量，記為m2。若沒(méi)有出現(xiàn)油狀物，則繼續(xù)加油攪拌離心，直至出現(xiàn)少量大豆油為止。持油性按照式（7）計(jì)算：

持油性=m2-m1m0×100%（7）

1.3.8.5流變特性的測(cè)定（1）黏度的測(cè)定。將待測(cè)溶液分別置于燒杯中，在室溫下用DHR-1型旋轉(zhuǎn)流變儀進(jìn)行牦牛曲拉干酪素溶液黏度的測(cè)定，采用“peak hold”模式，剪切速率為300 s -1，數(shù)據(jù)采集時(shí)間為120 s，錐板直徑為40 mm，記錄牦牛曲拉干酪素溶液在剪切速率為300 s-1時(shí)的表觀黏度曲線。

（2）最小凝膠含量的測(cè)定。參照Mundi等[21]的方法并略作修改，測(cè)定牦牛曲拉干酪素的最小凝膠含量。稱取不同質(zhì)量的牦牛曲拉干酪素并分別溶于100 ml磷酸緩沖液中，配制成不同含量（10%～25%）的溶液，并用1.0 mol/L HCl或1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。取5 ml溶液，在100 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h后用流動(dòng)水使之冷卻，并儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中過(guò)夜，使凝膠成形。牦牛曲拉干酪素的最小凝膠含量可以定義為把樣品旋轉(zhuǎn)后所形成的凝膠沒(méi)有滑落或掉落時(shí)的最小樣品含量。

1.3.9數(shù)據(jù)分析所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的結(jié)果，用Origin 9.1軟件進(jìn)行作圖分析。

2結(jié)果與分析

2.1牦牛曲拉干酪素的基本成分

由表1可知，本試驗(yàn)制備的牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品基本成分（脂肪、水分、蛋白質(zhì)、酪蛋白）含量符合GB31638-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白》的要求，表明該牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品的質(zhì)量較好，具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

2.2牦牛曲拉干酪素的氨基酸組成

蛋白質(zhì)的基本組成是氨基酸，因而蛋白質(zhì)的品質(zhì)在很大程度上取決于氨基酸的組成[22]。由表2可知，牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品中的總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83.44%，其中谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)16.09%，總氨基酸中必需氨基酸占42.00%，可見(jiàn)氨基酸組成合理，必需氨基酸含量豐富。由于牦牛曲拉干酪素有較平衡的氨基酸組成，因此可以作為蛋白質(zhì)類營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用在食品工業(yè)中。

人體必需氨基酸用*標(biāo)注，其中組氨酸（His）為嬰兒必需氨基酸。

2.3牦牛曲拉干酪素的蛋白質(zhì)組分

用SDS-PAGE分離出的譜帶均為蛋白質(zhì)的亞基譜帶，如圖1中的泳道2所示，在25 000～37 000相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)，電泳條帶較深，說(shuō)明檢測(cè)產(chǎn)品的主成分為25 000～37 000大小的蛋白質(zhì)，分別是α-酪蛋白、β-酪蛋白;在15 000～20 000相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)出現(xiàn)了顏色較淺的條帶，分別是為κ-酪蛋白、γ-酪蛋白。α-酪蛋白、β-酪蛋白這個(gè)2個(gè)組分沒(méi)有完全被分開(kāi)的原因可能是由于該牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品是經(jīng)凝乳酶凝乳形成的，酪蛋白組分之間通過(guò)疏水鍵形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并通過(guò)凝乳過(guò)程中加入的Ca2+的架橋作用形成凝乳，蛋白質(zhì)組分之間存在交聯(lián)作用，所以不能完全被分離[23]。李曉暉[24]研究酪蛋白分子的主要亞基組成發(fā)現(xiàn)，其主要成分為α-酪蛋白（含量約為75%）、β-酪蛋白（含量約為22%），其中α-酪蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為27 000，β-酪蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為24 000;其次為κ-酪蛋白、γ-酪蛋白（二者總含量約為3%）。此外，在該產(chǎn)品中未檢測(cè)到明顯的低相對(duì)分子質(zhì)量（<14 000）蛋白質(zhì)條帶，說(shuō)明該產(chǎn)品在制備過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生明顯的水解作用，蛋白質(zhì)沒(méi)有被破壞，得到的產(chǎn)品純度較高。

2.4牦牛曲拉干酪素的紅外光譜分析

用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)牦牛曲拉干酪素進(jìn)行官能團(tuán)檢測(cè)分析。由圖2可知，牦牛曲拉干酪素在3 649 cm-1附近有N-H的伸縮振動(dòng)吸收峰;在2 963 cm-1附近有C-H的飽和振動(dòng)吸收峰;在1 500～1 700 cm-1處為酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的吸收譜區(qū);在1 654 cm-1處的吸收峰是蛋白質(zhì)R-CO-NH2中C=O的伸縮振動(dòng)引起的典型吸收峰，其吸收峰強(qiáng)，表明此區(qū)域是酪蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的敏感區(qū)域;在1 536 cm-1附近有C-H彎曲振動(dòng)吸收峰、C-N伸縮振動(dòng)吸收峰，主要是由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲效應(yīng)相互疊加而出現(xiàn)的;在1 200～1 400 cm-1附近有酪蛋白分子酰胺Ⅲ帶的特征吸收譜區(qū)，其吸收峰位于1 232 cm-1位置，符合酪蛋白的特征吸收規(guī)律。

2.5牦牛曲拉干酪素的圓二色光譜分析

遠(yuǎn)紫外（190～250 nm）CD常用來(lái)反映肽鍵的圓二色性，不同蛋白質(zhì)所具有的二級(jí)結(jié)構(gòu)或多肽所產(chǎn)生譜帶的信息、吸收強(qiáng)弱均不同，由此可以反映蛋白質(zhì)或多肽鏈的結(jié)構(gòu)信息。由圖3可知，牦牛曲拉干酪素的圓二色光譜曲線在195 nm附近形成1個(gè)負(fù)峰，在222 nm附近有1個(gè)不明顯的肩峰，說(shuō)明本酪蛋白膠束中的α-螺旋含量很低，屬于無(wú)規(guī)則卷曲型蛋白質(zhì)。許銘珠[25]在研究酪蛋白時(shí)也提出，酪蛋白是一種典型的無(wú)規(guī)則卷曲型蛋白質(zhì)，與本研究結(jié)果一致。由CD-Pro軟件計(jì)算結(jié)果可知，牦牛曲拉干酪素中的α-螺旋占11.3%，β-折疊占26.8%，β-轉(zhuǎn)角占23.3%，無(wú)規(guī)則卷曲占38.6%，其中無(wú)規(guī)則卷曲比例最高，α-螺旋比例最低。

2.6牦牛曲拉干酪素的熱變性

由于加熱能夠使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而導(dǎo)致其功能受到影響，因此研究食品中蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性對(duì)于蛋白質(zhì)的合理利用具有重要意義。蛋白質(zhì)在加熱過(guò)程中由于吸收了熱量，分子會(huì)由有序狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)序狀態(tài)，多肽鏈因此展開(kāi)，當(dāng)達(dá)到蛋白質(zhì)變性溫度時(shí)，在熱分析圖譜上就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)吸熱峰，該峰值對(duì)應(yīng)的溫度即為該蛋白質(zhì)的熱變性溫度，由峰面積便可以確定該蛋白質(zhì)的變性熱焓[26]。采用差示掃描量熱儀對(duì)本研究中制備的牦牛曲拉干酪素進(jìn)行熱力學(xué)分析。從圖4可以看出，牦牛曲拉干酪素?zé)岱治銮€在123 ℃附近出現(xiàn)1個(gè)主要的吸熱峰，該溫度可能是酪蛋白的變性溫度，變性熱焓值較大，為165.1 J/g，表明被測(cè)樣品中未變性蛋白質(zhì)的含量較高。由于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)變性溫度的高低密切相關(guān)，變性溫度越高，表明蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越好。因此可見(jiàn)，該干酪素具有較好的熱穩(wěn)定性，可以應(yīng)用到食品加工業(yè)中。

2.7牦牛曲拉干酪素的功能性質(zhì)

2.7.1溶解性蛋白質(zhì)的溶解度是重要的理化特性，常與其他功能特性如發(fā)泡能力和乳化特性相關(guān)[27]。由圖5可以看出，在恒定的pH值條件下，當(dāng)溫度從40 ℃上升到60 ℃時(shí)，牦牛曲拉干酪素的溶解度整體上逐漸提高;當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，牦牛曲拉干酪素的溶解度下降。隨著溫度的上升，會(huì)使蛋白質(zhì)分子在水溶液中的構(gòu)象展開(kāi)，當(dāng)分子內(nèi)部親水基團(tuán)逐漸暴露時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度就會(huì)提高。但是溫度過(guò)高時(shí)，基團(tuán)暴露得過(guò)多，基團(tuán)間的相互作用會(huì)破壞肽鍵結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)會(huì)因此發(fā)生聚集和沉淀，從而使溶解度下降。Chen等[28]通過(guò)研究溫度對(duì)脫脂乳粉蛋白質(zhì)溶解度的影響也得出了類似的結(jié)論。此外，由圖5還可以看出，牦牛曲拉干酪素的溶解度與pH值之間呈現(xiàn)“V”形關(guān)系：當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)（pH值=4.6）時(shí)，牦牛曲拉干酪素有最低的溶解度，可能由于此時(shí)正負(fù)電荷的平衡降低了蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，從而使得牦牛曲拉酪蛋白開(kāi)始沉淀;當(dāng)pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)（pH值<4或>7）時(shí)，由于蛋白質(zhì)所帶的電荷增多，分子之間的靜電斥力增大，從而使得牦牛曲拉干酪素的溶解度增加。Chee等[29]和Maria等[30]分別以大豆蛋白質(zhì)和脫脂腰果殼中分離的蛋白質(zhì)為原料，研究蛋白質(zhì)溶解度與pH值之間的關(guān)系，其研究結(jié)果與本試驗(yàn)得出的結(jié)果類似。本研究所得牦牛曲拉干酪素的溶解特性與多種蛋白質(zhì)類似。

2.7.2乳化性本研究測(cè)定了牦牛曲拉干酪素的乳化活力指數(shù)、乳化穩(wěn)定性和乳化能力等乳化性指標(biāo)。

由圖6可知，在低溫（40 ℃、50 ℃）下，隨著溫度升高，牦牛曲拉干酪素的EAI值基本不變;當(dāng)溫度在50 ℃以上且遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，牦牛曲拉干酪素的EAI值變化較大，表現(xiàn)出隨著溫度的上升而急劇降低的趨勢(shì)。可能是由于溫度升高時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，從而導(dǎo)致乳化活性下降。由圖7可知，隨著溫度的升高，牦牛曲拉干酪素的ES值整體上逐漸降低，但是降低幅度比EAI值低。Britten等[31]通過(guò)研究熱處理對(duì)熱變性乳清蛋白和天然乳清蛋白混合物EAI、ES值的影響，也得出了同樣的結(jié)論。由圖8可知，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，EC值極低，與較高溫度對(duì)牦牛曲拉干酪素溶解性的影響類似，可能由于低溫處理會(huì)提高蛋白質(zhì)分子的柔性和親水性，從而使得此時(shí)的乳化性較好。然而當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生聚沉，能夠參與到乳化作用中的有效分子減少，形成的蛋白質(zhì)乳狀液易黏結(jié)而分層。

此外，蛋白質(zhì)的乳化性、乳化穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)親水、親油基團(tuán)的表面分布及分子柔性有關(guān)，不同的pH值會(huì)影響蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)、親水基團(tuán)和表面電荷的分布和變化。由圖7、圖8可知，牦牛曲拉干酪素的乳化穩(wěn)定性和乳化能力在等電點(diǎn)附近（pH值=4.6）最低，可能由于此時(shí)的溶解度最小，能夠參與乳化的可溶性蛋白質(zhì)較少;而在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)（pH值<4或pH值>7）條件下，牦牛曲拉干酪素的乳化能力明顯提高，在偏酸性（pH值=3）條件下，牦牛曲拉干酪素整體上具有最強(qiáng)的乳化穩(wěn)定性。Zhao等[32]、Malomo等[33]分別通過(guò)研究pH值對(duì)花生蛋白質(zhì)制品、大麻籽蛋白質(zhì)粉乳化特性的影響也得出了類似結(jié)論。可見(jiàn)，根據(jù)不同需要適當(dāng)調(diào)節(jié)酸堿度可提高牦牛曲拉干酪素的乳化能力和乳化穩(wěn)定性。

2.7.3發(fā)泡性蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力受到蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散速率、界面張力大小、疏水基團(tuán)的分布等因素影響，泡沫的穩(wěn)定性則主要取決于蛋白質(zhì)溶液的流變性質(zhì)。由圖9可知，牦牛曲拉干酪素溶液的發(fā)泡能力大致隨著溫度的上升而增大，原因可能是聚合的酪蛋白膠束通過(guò)降低界面張力，促進(jìn)了泡沫膜的形成，從而提升了發(fā)泡性能;當(dāng)溫度升高到70 ℃后，發(fā)泡能力的整體變化不大。由圖10可知，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，牦牛曲拉干酪素溶液所形成泡沫的穩(wěn)定性較高，可能由于此時(shí)溶液中的可溶性蛋白質(zhì)含量較其他溫度下有所增加，而可溶性蛋白質(zhì)在混合體系中的乳化能力明顯優(yōu)于不溶性蛋白質(zhì);隨著溫度增加至50 ℃以上，泡沫穩(wěn)定性下降的原因是熱處理使其黏度增加，蛋白質(zhì)分子間發(fā)生相互作用，從而導(dǎo)致泡沫不穩(wěn)定。

由圖9還可以看出，牦牛曲拉干酪素的發(fā)泡能力在等電點(diǎn)附近（pH值為4.6）最低，可能由于在等電點(diǎn)處酪蛋白發(fā)生沉淀，在聚合狀態(tài)下擴(kuò)散較慢，從而使得發(fā)泡性降低;當(dāng)pH值為6時(shí)，發(fā)泡能力有下降的趨勢(shì)，可能由于在此pH值條件下，牦牛曲拉干酪素的膠凝作用較明顯，從而使得發(fā)泡性較低;當(dāng)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)（pH值<3或pH值>7）時(shí)，牦牛曲拉干酪素的發(fā)泡能力較好。Snchez等[34]研究蛋白質(zhì)和納米顆粒得到的結(jié)果也表明，由于pH值增加，界面壓力、界面膨脹特性提高，蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力會(huì)提高。此外，在等電點(diǎn)附近（pH值為4.6）時(shí)，泡沫的穩(wěn)定性較高（圖10），可能由于此時(shí)界面上存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，會(huì)使體系表面形成黏稠的膜;而遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，泡沫的穩(wěn)定性會(huì)降低。結(jié)合牦牛曲拉干酪素的乳化特性可知，在高pH值和高乳化穩(wěn)定性下的牦牛曲拉干酪素有較高的發(fā)泡能力，Delgado等[35]在研究pH值對(duì)棉籽粕蛋白質(zhì)功能特性的影響時(shí)也得到了同樣的結(jié)論。

2.7.4持油性蛋白質(zhì)的持油性是指蛋白質(zhì)與游離油脂相結(jié)合的能力，在食品加工過(guò)程中能將油脂等風(fēng)味物質(zhì)截留在食物中[33]。由圖11可知，在30～70 ℃，隨著溫度升高，牦牛曲拉干酪素的持油性在逐漸上升，可能由于蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)適當(dāng)加熱后，分子會(huì)逐漸發(fā)生解離，使得肽鏈伸展，此時(shí)蛋白質(zhì)容易與油脂小分子結(jié)合，同時(shí)此溫度下油脂的流動(dòng)性較低，容易被蛋白質(zhì)分子截留。隨著溫度上升到70 ℃，牦牛曲拉干酪素的持油性達(dá)到最大值，若繼續(xù)升溫，持油性則明顯下降。任秀艷等[36]在研究加熱對(duì)玉米胚芽粕蛋白質(zhì)持油性的影響時(shí)也得到類似結(jié)論。此外，趙小龍等[37]研究指出，溫度過(guò)高時(shí)，油脂的流動(dòng)性明顯加強(qiáng)，整個(gè)混合體系的黏度下降，會(huì)嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的持油性。酪蛋白在70 ℃左右具有良好的持油性，可以作為一種潛在的功能性原料應(yīng)用到模擬干酪和乳液型食物等高脂肪含量的產(chǎn)品中。

2.7.5牦牛曲拉干酪素的流變特性（1）黏性。蛋白質(zhì)流體的黏度主要由蛋白質(zhì)粒子的水合半徑（也稱為流體力學(xué)半徑）決定。經(jīng)過(guò)不同溫度和酸堿度處理后，牦牛曲拉干酪素的黏度變化如圖12所示。可以看出，牦牛曲拉干酪素溶液的表觀黏度整體上隨著溫度的上升而逐漸減小，80 ℃時(shí)的黏度最低。酪蛋白分子是一種典型的無(wú)規(guī)則卷曲型蛋白質(zhì)，它在分散溶液中是以伸展開(kāi)的無(wú)規(guī)則團(tuán)狀結(jié)構(gòu)形式存在的，它暴露出的親水基團(tuán)會(huì)與水分子形成氫鍵。隨著體系溫度的升高，氫鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子會(huì)經(jīng)歷從無(wú)規(guī)則線團(tuán)狀到無(wú)規(guī)則線團(tuán)卷曲狀的變化，此時(shí)的蛋白質(zhì)分子流體力學(xué)體積變小，黏度減小。此外，分子熱運(yùn)動(dòng)受到溫度的影響較大，高溫會(huì)減小體系的流動(dòng)阻力，體系的剪切黏度也會(huì)隨之下降。

由圖12還可以看出，當(dāng)pH值為7時(shí)，表觀黏度較大，可能是由于中性環(huán)境中的靜電斥力較弱，分子間的結(jié)合緊密，而當(dāng)溶液偏堿（pH值>7）時(shí)，蛋白質(zhì)電荷會(huì)大量暴露，部分溫度下溶液的表觀黏度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。De Almeida等[38]在研究pH值對(duì)蛋白質(zhì)流變特性的影響時(shí)也得出類似的結(jié)論?？梢?jiàn)，當(dāng)牦牛曲拉干酪素作為食品原料或食品添加劑時(shí)，可以通過(guò)控制溶液的酸堿度、溫度來(lái)控制黏度。

（2）最小凝膠含量。蛋白質(zhì)的最小凝膠含量可以用來(lái)表征蛋白質(zhì)的成膠能力。如表3所示，在酸堿度為中性條件下，牦牛曲拉干酪素的最小凝膠含量最低，為12%±0.15%，可能是由于此時(shí)的正負(fù)電荷平衡降低了蛋白質(zhì)之間的斥力，從而增強(qiáng)了蛋白質(zhì)凝膠的形成能力，該結(jié)果與Tan等[39]研究得到的大豆蛋白質(zhì)在中性條件下的最小凝膠含量（12%）接近，說(shuō)明酪蛋白與大豆蛋白質(zhì)有相似的熱穩(wěn)定性。在偏堿性（pH值>9）條件下，牦牛曲拉干酪素的最小凝膠含量較高，可能由于蛋白質(zhì)在堿性條件下溶解性較好，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)，從而減弱了蛋白質(zhì)凝膠的形成能力。

3結(jié)論

本研究用復(fù)合酶制備得到牦牛曲拉干酪素，該干酪素的蛋白質(zhì)含量為86.64%±1.09%，其中酪蛋白含量占總蛋白含量的96.72%±1.14%，蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在25 000～37 000，變性溫度達(dá)到123 ℃左右。在牦牛曲拉干酪素的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占11.3%，β-折疊占26.8%，β-轉(zhuǎn)角占23.3%，無(wú)規(guī)則卷曲占38.6%。紅外光譜分析結(jié)果顯示，牦牛曲拉干酪素具有-NH、C=O等特征官能團(tuán)，表明該干酪素產(chǎn)品的純度較高，品質(zhì)較好，熱穩(wěn)定性較高，保留了天然酪蛋白的膠束結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步將其應(yīng)用在食品加工領(lǐng)域、拓寬其應(yīng)用范圍奠定了基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)不同溫度、酸堿度條件下牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品的功能特性研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，牦牛曲拉干酪素的溶解度較高，乳化穩(wěn)定性及發(fā)泡穩(wěn)定性較好;當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，牦牛曲拉干酪素的持油性最佳，發(fā)泡能力增強(qiáng)。在等電點(diǎn)附近時(shí)，牦牛曲拉干酪素的發(fā)泡穩(wěn)定性最高;遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，牦牛曲拉干酪素的溶解度、乳化性能、發(fā)泡性能較好，特別是在中性條件下，牦牛曲拉干酪素的表觀黏度較大，最小凝膠含量最低。因此可見(jiàn)，在食品加工生產(chǎn)中，可以通過(guò)改變酸堿度、加熱溫度等條件來(lái)獲得具有良好加工性質(zhì)的牦牛曲拉干酪素，從而充分利用牦牛曲拉資源，發(fā)展牧區(qū)經(jīng)濟(jì)，增加牧民收入，最終實(shí)現(xiàn)良好的經(jīng)濟(jì)效益。

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（責(zé)任編輯：徐艷）