范三紅，郭定一，張錦華，李多，白寶清*

(1.山西大學 生命科學學院，太原 030006；2.特色植物資源研究與利用山西省重點實驗室(山西大學)，太原 030006)

藜麥，屬藜科，原產(chǎn)于南美洲，種植歷史悠久， 因為其營養(yǎng)價值豐富，深受當?shù)鼐用竦南矏郏⑾碛小凹Z食之母”的美譽[1]。 現(xiàn)今，中國成為藜麥的最大種植國之一，主要分布于山西、青海、西藏等地。黃酮類物質(zhì)目前已廣泛應用于食品和調(diào)味品等領(lǐng)域[2,3]。食品中黃酮類物質(zhì)種類豐富，含量也較高[4,5]。食品中的黃酮類化合物具有良好的抗氧化、抗炎等生理活性[6,7]，藜麥糠中黃酮含量較高，因而具有較大的研究價值[8]。

黃酮類物質(zhì)的分離純化方法有：薄層色譜法、吸附樹脂層析法等， 其中應用較為廣泛的是大孔吸附樹脂層析法[9]。大孔吸附樹脂外形呈球狀，內(nèi)部含有許多細小的孔隙，用于有機化合物的分離純化，通過吸附性和分子篩原理而達到分離純化的目的[10]。大孔樹脂內(nèi)部呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑較大，吸附效果優(yōu)良，大孔吸附樹脂吸附技術(shù)最早用于廢水處理、醫(yī)藥工業(yè)、化學工業(yè)、分析化學、臨床檢定和治療等領(lǐng)域，近年來在我國已廣泛用于中草藥有效成分的提取、分離、純化工作中[11]。

本實驗利用大孔吸附樹脂對從藜麥糠中提取的黃酮類化合物進行分離純化，用高效液相色譜對純化的藜麥糠黃酮類化合物進行分析。本實驗為藜麥糠中有效成分的分離、純化提供了實驗支撐，為藜麥糠天然黃酮類化合物的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥糠：山西省華青藜麥產(chǎn)品開發(fā)有限公司；大孔樹脂(AB-8、D101、NKA-9、HPD750、HPD950、HPD450、X-5)：北京索萊寶科技有限公司；蘆丁標準品(AR≥98%)：美國 Sigma公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JP-040ST 型超聲波清洗機 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；TG16A-WS 型高速離心機 武漢愛斯佩科學儀器有限公司；SP-2000UV 型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藜麥糠黃酮提取物的制備

精確稱取藜麥糠粉末10.0 g，于超聲溫度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、乙醇體積分數(shù)60%的條件下超聲提取20 min，重復提取濾渣，合并3次濾液。將黃酮類化合物提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得藜麥糠黃酮粗提浸膏，用無水乙醇充分浸泡6 h，真空抽濾除去糖類等極性雜質(zhì)，二次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除醇，將浸膏用蒸餾水稀釋成不同質(zhì)量濃度待測液。

1.3.2 樹脂的預處理

將7種大孔樹脂分別放置于燒杯中，用95%乙醇溶液在室溫下浸漬24 h，充分飽脹樹脂。用蒸餾水緩慢洗滌樹脂至無醇味。將樹脂濕法裝柱(Ф15 mm×400 mm)，用5% HCl和5% NaOH溶液以3 BV/h速率淋洗，用蒸餾水洗至流出液pH為7后備用。

1.3.3 大孔吸附樹脂的篩選

1.3.3.1 大孔樹脂的靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸

分別稱取經(jīng)預處理的7種大孔樹脂各5 g于具塞三角瓶中，加入50 mL 2.0 mg/mL藜麥糠黃酮類化合物提取液，于HT-100恒溫振蕩搖床(25 ℃，160 r/ min)中振蕩吸附24 h后真空抽濾，測得平衡液中黃酮質(zhì)量濃度[12]。用蒸餾水緩慢將大孔樹脂表面的樣品溶液沖去，于上述樹脂中分別加入75% C2H5OH溶液50 mL振蕩解吸24 h(25 ℃，160 r/min)，測定吸附和解吸液中黃酮類化合物的質(zhì)量濃度，并根據(jù)下式分別得出各項指標：

吸附量Q(mg/g)=(C0-C1)×V1/W。

(1)

吸附率A(%)=(C0-C1)/C0×100。

(2)

解吸量(mg/g)=C2×V2/W。

(3)

解吸率D(%)=(V2×C2)/(W×Q)×100。

(4)

回收率(%)=洗脫液中的黃酮含量/上柱黃酮量×100。

(5)

式中：C0為樣液黃酮濃度(mg/mL)；C1為吸附后濾液黃酮濃度(mg/mL)；C2為解吸液黃酮濃度(mg/mL)；V1為吸附液體積(mL)；V2為解吸液體積(mL)；W為干樹脂量(g)。

1.3.3.2 大孔樹脂的靜態(tài)吸附解吸動力學[13]

按照1.3.3.1所描述的方法，于HT-100恒溫振蕩搖床(25 ℃，160 r/ min)中振蕩，每間隔1 h吸取平衡液并測定其質(zhì)量濃度，共測定8次，模擬得出樹脂的靜態(tài)吸附與解吸附動力學曲線。

1.3.4 大孔樹脂純化條件優(yōu)化[14]

1.3.4.1 樣液濃度對大孔樹脂吸附效果的影響

配制0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mg/mL的藜麥糠黃酮類化合物粗提液，將5.0 g優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱。分別取各濃度藜麥糠黃酮粗提液的30 mL調(diào)節(jié)樣液pH為6.0，振蕩吸附(25 ℃，160 r/min，24 h)，柱上洗脫(2 BV，乙醇溶液75%)，并測定洗脫液的黃酮質(zhì)量濃度，計算回收率。

1.3.4.2 上樣量對大孔樹脂吸附效果的影響

稱取5.0 g優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱。取2.0 mg/mL pH為6.0的藜麥糠黃酮溶液進行上樣，上樣流速為3 mL/min，上樣量分別為10，12，16，20，25，27，30，35，40，45 mL，振蕩吸附后(25 ℃，160 r/min，24 h)，水洗，再用2 BV 75%乙醇溶液解吸附，測定各組洗脫液中黃酮含量，計算得出回收率。

1.3.4.3 乙醇濃度對大孔樹脂吸附效果的影響

稱取5.0 g優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱。固定樣液pH為6.0，藜麥糠黃酮溶液為2.0 mg/mL，上樣量為30 mL，樣品吸附完畢后進行水洗，分別用2 BV濃度為35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液解吸。測定各組解吸液中黃酮含量，計算得出回收率。

1.3.4.4 樣液pH對大孔樹脂吸附效果的影響

稱取5.0 g優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱。取2.0 mg/mL上樣量為30 mL的藜麥糠黃酮溶液進行上樣，上樣前用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將樣液pH值分別調(diào)節(jié)為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，11.0，振蕩吸附后(25 ℃，160 r/min，24 h)，水洗，再用2 BV 75%乙醇溶液解吸附，得不同 pH值解吸液中黃酮的質(zhì)量濃度，測定各組洗脫液中黃酮含量，計算得出回收率。

1.3.4.5 解吸液體積對大孔樹脂吸附效果的影響

對優(yōu)選的大孔樹脂濕法裝柱，裝柱量為5.0 g。固定樣液pH為6.0，藜麥糠黃酮溶液為2.0 mg/mL，再用75%的乙醇溶液以2 BV/h進行解吸附，然后用自動部分收集器分部收集解吸液，測得各收集管目標溶液的質(zhì)量濃度，繪制出洗脫曲線。

1.3.5 藜麥糠黃酮分離純化前后純度的測定[15]

按照所得最優(yōu)純化條件對藜麥糠黃酮粗提物進行吸附、解吸，測定經(jīng)純化后的黃酮濃度，解吸液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成膏狀，真空干燥到恒重，準確稱量其質(zhì)量。通過下式得出藜麥糠黃酮的純度：

Y=V×C×100/M。

(6)

式中：Y為純化后黃酮的純度(%)；V為解吸液體積(mL)；C為解吸液中黃酮濃度(mg/mL)；M為干燥后黃酮的總質(zhì)量(mg)。

1.3.6 高效液相色譜分析藜麥糠黃酮樣品

準確稱取經(jīng)純化、真空干燥的藜麥糠黃酮類化合物0.04 g，用色譜甲醇定容至50 mL容量瓶中備用[16]。采用安捷倫1260型高效液相色譜儀對制備的樣品進行定性分析。

1.3.6.1 色譜條件

高效液相色譜法的工作條件：色譜柱Innoval C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A ：100%甲醇，流動相B：1%乙酸；流速0.6 mL/min；檢測波長360 nm，進樣量10 μL；柱溫40 ℃，梯度洗脫條件見表1。

表1 HPLC流動相梯度洗脫時間表Table 1 HPLC mobile phase gradient elution schedule

1.3.6.2 混合標準樣品的制備

以甲醇溶解標準樣品得蘆丁0.040 mg/mL、槲皮素0.024 mg/mL、槲皮苷0.0200 mg/mL、異槲皮苷0.016 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

2.1.1 大孔樹脂的靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸

由表2可知，所選7種大孔樹脂對藜麥糠黃酮類化合物的吸附、解吸效果各不相同，由于7種樹脂的表面結(jié)構(gòu)、孔徑大小、鍵合情況各異而導致其對藜麥糠黃酮化合物的吸附和解吸效果均有差異。其中，中極性HPD750吸附量高達2.032 mg/g，吸附率最高，達到79.20%，但其解吸率最低，只有31.49%，其解吸量為0.640 mg/g。而中極性HPD950吸附量達1.536 mg/g，吸附率達59.90%，HPD950的解吸效果明顯強于其余樹脂，其解吸率達86.41%，解吸量為1.327 mg/g，其余樹脂的吸附和解吸效果均較差。綜合樹脂的吸附和解吸能力可得：HPD950樹脂與藜麥糠黃酮極性最為相似，最適宜分離純化藜麥糠黃酮。

表2 大孔樹脂的吸附和解吸性能Table 2 Absorption and desorption properties of macroporous resins

2.1.2 吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸動力學曲線

在前3 h內(nèi)各樹脂吸附效果較為明顯，且HPD750有較好的吸附效果，見圖1。

圖1 不同類型樹脂對藜麥糠黃酮靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.1 Dynamic curves of static adsorption of flavonoids from quinoa chaff by different types of resins

由圖1可知，HPD750樹脂吸附速率快，吸附量高達1.833 mg/g，吸附率達到76.30%，明顯高于其他型樹脂。而中極性HPD950吸附率僅次于HPD750，達到吸附飽和點時，吸附量為1.336 mg/g，吸附率為57.1%。除HPD750和HPD950外，其他樹脂對藜麥糠黃酮化合物的吸附效果較差，達到吸附飽和點時的吸附率均低于50%。這可能是由于藜麥糠黃酮含有的羰基、縮醛式衍生物與中極性樹脂分子間作用力較強或產(chǎn)生氫鍵，所以中極性的樹脂對其吸附效果較好。

由圖2可知，HPD950大孔樹脂的解吸效果明顯優(yōu)于其他型大孔樹脂；在0～2 h，HPD950解吸率斜率最大，在此段時間內(nèi)，吸附在HPD950大孔樹脂上的黃酮化合物能被洗脫液高效溶出；在2～3 h時，HPD950大孔樹脂的解吸率雖有所上升，但其斜率明顯低于前2 h。在洗脫時間達到4 h后，HPD950大孔樹脂基本達到解吸平衡點，其解吸率達到最高。在對藜麥糠進行靜態(tài)吸附動力學考察時，有較高吸附率的HPD750大孔樹脂的解吸率卻很低。在達到解吸平衡時，其解吸率低于50%，遠低于HPD950型大孔樹脂，解吸附效果較差。除HPD950和HPD750大孔樹脂以外，各大孔樹脂在2 h內(nèi)快速解吸；在達到解吸平衡點后，各樹脂的最高解吸率均小于50%，解吸效果較差。故由各樹脂的吸附解吸動力學曲線以及各項吸附解吸指標，可確定HPD950型為最適合純化藜麥糠黃酮類化合物的大孔樹脂。

圖2 不同類型樹脂對藜麥糠黃酮靜態(tài)解吸動力學曲線Fig.2 Dynamic curves of static desorption of flavonoids from quinoa chaff by different types of resins

2.2 HPD950型樹脂對藜麥糠黃酮的條件優(yōu)化

2.2.1 樣液濃度的影響

由圖3可知，在藜麥糠黃酮化合物濃度低于2.5 mg/mL時，回收率隨樣液濃度的增加呈上升趨勢，在藜麥糠黃酮濃度達2.5 mg/mL時達到最高回收率59.80%，濃度大于2.5 mg/mL時其回收率略微減小，基本不受質(zhì)量濃度改變的影響。可知在濃度為2.5 mg/mL時達到樹脂的飽和吸附點，濃度過高不利于吸附且浪費樣品，故HPD950樹脂純化黃酮類化合物最佳的上樣濃度為2.5 mg/mL。

圖3 不同質(zhì)量濃度藜麥糠黃酮對HPD950大孔樹脂分離純化藜麥糠黃酮的影響Fig.3 Effects of different concentration of quinoa chaff flavonoids on the separation and purification of quinoa chaff flavonoids by HPD950 macroporous resin

2.2.2 上樣量的影響

由圖4可知，當上樣體積過小時，柱內(nèi)大孔樹脂的最大吸附量大于樣液中黃酮類化合物的量，造成吸附劑浪費，純化效率低。當上樣體積小于35 mL時，黃酮回收率隨著上樣體積的增加逐漸增大，當上樣體積為35 mL時達最高回收率67.3%，此時大孔樹脂對黃酮的吸附基本接近平衡。而當上樣體積繼續(xù)增加時，黃酮回收率略微下降，因為樣品溶液中過量的黃酮類化合物在吸附柱上沒有被樹脂充分吸附，使樣液流失，回收率降低。上樣體積與吸附劑比例過低或過高均會使回收率降低。因此，選擇35 mL為最佳上樣體積。

圖4 樣液量對HPD950大孔樹脂分離純化藜麥糠黃酮的影響Fig.4 Effects of sample solution volume on quinoa chaff flavonoids separated and purified by HPD950 macroporous resin

2.2.3 樣液pH的影響

由圖5可知，隨著pH值的增大，黃酮回收率呈先增大后減小的趨勢。上樣液pH值對黃酮回收率的影響較為明顯。當上樣液pH值為6.0時，藜麥糠黃酮的回收率最大，達到53.15%。pH≤4和pH≥7時，黃酮回收率均低于50%。這是由于過酸或過堿條件下處理樣品，不僅會破壞藜麥糠黃酮化合物的化學性質(zhì)，而且會影響大孔樹脂的結(jié)構(gòu)，使大孔樹脂對藜麥糠黃酮化合物的分離純化效果變差。與堿性環(huán)境相比，弱酸環(huán)境下更有助于HPD950型大孔樹脂對藜麥糠黃酮的分離純化[17]。因此，上樣液的最佳pH值為6.0。

圖5 上樣液pH對HPD950大孔樹脂分離純化藜麥糠黃酮的影響Fig.5 Effects of sample solution pH on quinoa chaff flavonoids separated and purified by HPD950 macroporous resin

2.2.4 乙醇濃度的影響

由圖6可知，乙醇濃度小于75%時，黃酮回收率隨著乙醇濃度的上升而升高，乙醇濃度大于75%時，黃酮回收率逐漸降低。因為在低濃度的乙醇解吸液中，藜麥糠黃酮化合物的溶解性較差，解吸效果也差。當解吸液濃度為75%時，回收率達到最高值69.87%，當解吸液濃度在75%以上時，黃酮的溶解性變小[18]，回收率變低，洗脫效果變差。最終確定最佳乙醇濃度為75%。

圖6 乙醇濃度對大孔樹脂解吸效果的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on desorption effect of macroporous resin

2.2.5 解吸液體積對大孔樹脂解吸效果的影響

用濃度為75%的C2H5OH溶液對HPD950樹脂解吸，并分步收集解吸液，共20管，每10 mL為一管，分別檢測各管中黃酮濃度，繪制洗脫曲線，見圖7。

圖7 HPD950大孔樹脂洗脫藜麥糠黃酮曲線Fig.7 The elution curve of quinoa chaff flavonoids by HPD950 macroporous resin

由圖7可知，管數(shù)小于7時，解吸液的黃酮濃度隨著管數(shù)的增加緩慢增加。當收集到10管時，黃酮濃度最大，為0.427 mg/mL，此后，隨著管數(shù)的增加，黃酮濃度反而降低，黃酮類化合物主要集中在7～13管。當管數(shù)為18管時，洗脫液內(nèi)已基本檢測不到黃酮類化合物，表明洗脫體積達到180 mL時吸附柱中黃酮基本解吸完畢。所以，最佳解吸液體積為180 mL。

2.3 藜麥糠黃酮分離純化前后純度的測定

藜麥糠黃酮經(jīng)HPD950樹脂充分地吸附和解吸后，測得回收率為77.4%，純度由純化前的13.0%上升到純化后的68.0%。結(jié)果表明HPD950樹脂對藜麥糠黃酮粗提液具有較好的分離純化效果。

2.4 藜麥糠黃酮化合物定性分析

由圖8中(B)可知，分離純化的藜麥糠黃酮樣品由9種成分組成，對照圖8中(A)黃酮類化合物標準樣品色譜圖，藜麥糠黃酮化合物中槲皮素、槲皮苷、蘆丁和異槲皮素4種成分得到確認。保留時間為27.908 min的色譜峰為蘆??；保留時間為29.223 min的色譜峰為異槲皮素，保留時間為34.553 min的色譜峰為槲皮苷，保留時間為41.669 min的色譜峰為槲皮素；色譜峰中蘆丁、槲皮苷和異槲皮素含量接近。樣品中其他保留時間的色譜峰還沒有確認。黃酮樣品的HPLC色譜圖中色譜峰較多，其保留時間比較接近，通過洗脫條件的優(yōu)化將其基本分開，其中有些組分沒有完全基線分離，不排除有成分包含在已知峰中的可能。其他組分推測可能是蘆丁的衍生甙類[19]，單純使用HPLC進行定性分析仍有一定的局限性，很難得知全部的黃酮化合物種類信息[20]，更精確的化合物鑒定需要借助質(zhì)譜、核磁共振等其他分析手段。

圖8 黃酮類化合物標準樣品(A)和純化的藜麥糠黃酮化合物(B)的HPLC色譜圖Fig.8 High performance liquid chromatograms of standard samples of flavonoids (A) and purified quinoa chaff flavonoids (B)

3 結(jié)論

在食品保鮮、抑菌、藥物、化妝品領(lǐng)域黃酮類化合物應用廣泛，為了更好地利用藜麥糠中的黃酮類化合物，本實驗以藜麥糠黃酮粗提物為研究對象，通過比較 D101、HPD450、HPD750、HPD950、NKA-9、X-5、AB-8 7種大孔吸附樹脂對藜麥糠黃酮的靜態(tài)吸附和解吸附實驗，篩選出最優(yōu)樹脂，結(jié)果表明，HPD950樹脂的吸附和解吸性能均較好。利用HPD950大孔樹脂對藜麥糠黃酮粗提液的分離純化最佳工藝進行優(yōu)化，以樣液濃度、上樣體積、上樣液pH、乙醇濃度、解吸液體積為參考因素，確定其最佳分離純化條件為：樣液濃度0.5 mg/mL，上樣體積35 mL，上樣液pH 6.0，乙醇濃度75%，解吸液體積180 mL。在此條件下分離純化后，藜麥糠中黃酮純度由(13.0±0.30)%上升到(68.0±0.50)%，回收率為(77.4±0.27)%。對純化后的藜麥糠黃酮類化合物進行高效液相色譜定性分析，樣品中槲皮素、槲皮苷、異槲皮素、蘆丁4種成分得到確認。本實驗為藜麥糠天然黃酮類化合物的應用奠定了理論基礎(chǔ)。