馬艷莉，梁靜靜，李大偉，丁玉峰，李素萍，席曉麗，王頡，郭書賢

(1.南陽理工學院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；2.河北農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，河北 保定 071000)

腐乳，類似于西方奶酪，是豆腐經(jīng)霉菌或細菌固態(tài)發(fā)酵成毛坯，然后將毛坯用鹽腌制，最后將鹽坯在加有香辛料、酒類等混合輔料中成熟3個月左右[1,2]。腐乳是在開放式環(huán)境下制作而成，生產(chǎn)過程中所涉及的自然發(fā)酵過程易受環(huán)境中微生物的污染，且腐乳中含有豐富的氨基酸，含氮類化合物的不完全代謝會產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，如生物胺、氨基甲酸乙酯等[3]。

生物胺是一種有機含氮低分子化合物，主要由氨基酸的脫羧或醛酮的胺化和轉氨作用形成，主要包括色胺、組胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺和亞精胺[4]。攝入一定的生物胺，對人體健康有危害，食品和藥物管理局規(guī)定組胺在金槍魚等相關魚類中的限量值為50 mg/kg, 且總生物胺含量在500～1000 mg/kg會對人體健康產(chǎn)生潛在危害[5]。關于腐乳中生物胺的研究，大多數(shù)研究者集中在腐乳中生物胺分布的調(diào)查、接種不同毛霉對生物胺產(chǎn)生的影響、后發(fā)酵輔料對生物胺產(chǎn)生的影響等。例如，Kung等[6]對市售的32個腐乳樣品中的生物胺進行了檢測，共檢測到8種生物胺，其中白方和紅方腐乳中組胺平均含量低于50 mg/kg，只有1個紅方腐乳樣品中組胺含量高達158 mg/kg，具有安全隱患。對于儲藏條件對腐乳生物胺的研究鮮有報道。

腐乳作為美味可口的佐餐小菜和烹飪中的調(diào)味料，通常人們開瓶后不會一次性食用完，而是放置于冰箱或室溫保存。本研究旨在探討不同儲藏溫度和儲藏時間對開蓋紅方腐乳的生物胺含量和理化性質(zhì)變化的影響，旨在為消費者提供合理的儲藏方式和食用建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅方腐乳：購自河北省保定市當?shù)爻?；色譜乙腈：購自上海Merck試劑有限公司；丹磺酰氯(HPLC，≥98%)：購自上海麥克林試劑有限公司；濃鹽酸(37%)、氨水、乙酸銨、丙酮、無水乙酸鈉、三乙胺、氫氧化鈉、碳酸氫鈉：購自天津市天力化學試劑有限公司；純凈水：購自杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀 美國Waters儀器有限公司；液相色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm) 美國Agilent儀器有限公司；XHF-DY攪拌分離器 上海奧克斯儀器有限公司；5424R高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；SPX生化培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司；QL-861渦旋機 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Novasina CH-8533水分活度儀 瑞士AG公司。

1.3 不同溫度下開蓋紅方腐乳儲藏試驗

8瓶紅方腐乳購自河北省保定市當?shù)爻校_蓋后在不同溫度(4，15，25，35 ℃)下各放置兩瓶，分別于儲藏1，15，30，45，60 d取樣測定。

1.4 生物胺含量測定

樣品的前處理及生物胺的衍生參考李大偉等的方法[7]。

1.5 理化指標測定方法

水分活度的測定：使用水分活度測定儀測定，操作如下：在溫度18～25 ℃、濕度50%～80%的條件下，首先用飽和的鹽溶液校正儀器，準確稱取約1 g(精確至0.01 g)樣品，放入樣品皿中，再封閉測量倉，然后測定讀數(shù)。5 min后記錄儀器的響應值。同一樣品重復測定3次。

pH的測定：參照劉振鋒的方法[8]。取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL去離子水后用攪拌分離器均質(zhì)，然后在4 ℃下3600×g離心25 min，取上清液轉移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，用pH計測定，同一樣品重復測定3次。

氨基酸態(tài)氮的測定：參照SB/T 10170-2007的方法[9]。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，顯著水平為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 紅方腐乳開蓋貯藏過程中生物胺含量的變化

在不同溫度下，隨著儲藏時間的延長，開蓋紅方腐乳中8種生物胺的含量變化見表1。

表1 紅方腐乳開蓋貯藏過程中生物胺含量的變化Table 1 Changes of biogenic amines content in lid-opened red sufu during storage mg/kg

續(xù) 表

在4 ℃儲藏下，總生物胺呈先升高再降低的趨勢，發(fā)現(xiàn)最高的生物胺含量(876.20 mg/kg)在儲藏第15天的樣品中檢測到，是未經(jīng)儲藏樣品總胺含量的10倍左右。對于每種胺，均在樣品儲藏第15天檢測到最高值，為色胺(132.94 mg/kg)、苯乙胺(79.47 mg/kg)、腐胺(76.50 mg/kg)、尸胺(51.65 mg/kg)、組胺(280.21 mg/kg)、酪胺(45.24 mg/kg)、亞精胺(180.94 mg/kg)、精胺(29.26 mg/kg)，由此可知，儲藏第15天的樣品中主要的生物胺是色胺、組胺、亞精胺，分別占總生物胺的15.17%、31.98%和20.65%。隨著儲藏時間的延長，色胺、苯乙胺、酪胺、精胺均呈現(xiàn)先增加到最高值后呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，特別是精胺在儲藏第45天時幾乎檢測不到；腐胺、組胺、尸胺、亞精胺除了在第15天達到最高值，在第45天也會以高含量出現(xiàn)，所以在第45天高含量的生物胺是腐胺、組胺、尸胺、亞精胺的增加所導致的。

在15 ℃儲藏下，儲藏第15天的總生物胺含量與第60天的生物胺含量無顯著差異，不同時間節(jié)點總生物胺含量高低排序為：第60天>第15天>第45天>第30天>第0天。每種胺的變化趨勢也不一致，大多呈現(xiàn)波動趨勢，且在儲藏第15天檢測到腐胺和組胺的最高值，在儲藏第30天檢測到色胺、苯乙胺和精胺的最高值，在儲藏第60天檢測到尸胺和亞精胺的最高值。值得注意的是，亞精胺在儲藏第60天才檢測到，且以高濃度出現(xiàn)，儲藏最后出現(xiàn)的最高的生物胺總量(555.49 mg/kg)是由亞精胺的增加(0～153.77 mg/kg)引起的。而儲藏第15天時較高的生物胺總量是由于組胺的驟然增加引起的，從28.37 mg/kg增加至290.02 mg/kg。

在25 ℃儲藏下，總生物胺在儲藏第15天檢測到最高含量(596.63 mg/kg)，其中組胺占總生物胺的57.55%，為主要的生物胺。亞精胺在整個儲藏過程都沒有檢測到，精胺只在儲藏第15天和第30天檢測到。除了尸胺和酪胺，所有生物胺的最高值在儲藏第15天檢測到，且大多生物胺的變化呈現(xiàn)波動趨勢。

在35 ℃儲藏下，總生物胺含量也是呈現(xiàn)波動趨勢，也在儲藏第15天出現(xiàn)了最高值(643.16 mg/kg)，其中組胺占總生物胺的53.03%。大多數(shù)胺包括色胺、苯乙胺、腐胺和組胺在儲藏第15天出現(xiàn)最高值，酪胺在第30天出現(xiàn)最高值，這幾種胺的變化與在25 ℃儲藏下的變化趨勢相同。

綜合比較不同溫度下儲藏生物胺的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)不論在哪個溫度下儲藏，較高的總生物胺量均在第15天可以檢測到；亞精胺隨著溫度的升高，含量減少至幾乎檢測不到；作為最主要和毒性最大的胺——組胺，在高溫下更容易生成組胺。Ordonez等[10]研究了儲存條件對開瓶葡萄酒中生物胺的影響，發(fā)現(xiàn)在不同儲存條件檢測到某些生物胺的濃度略有變化。Ngapo等[11]對加拿大豬肉在不同溫度貯藏過程中生物胺的含量和變化過程進行研究，宰后48 h腰部位的豬肉分別在-1.7 ℃冷藏(分別于13，28，43，58 d取樣)和4 ℃貯藏5 d，腐胺、精胺和亞精胺含量隨冷藏時間的延長而增加；尸胺被檢測出不受冷藏條件的影響，僅在-1.7 ℃貯藏至43 d后在部分樣品中檢測到。在整個貯藏過程中生物胺的濃度不高，不會造成中毒風險。

2.2 紅方腐乳開蓋貯藏過程中理化性質(zhì)的變化

生物胺的生成與水分活度有密切的關聯(lián)，水分活度通過影響微生物的生長代謝和微生物分泌的氨基酸脫羧酶活性間接影響生物胺合成。在不同溫度下，隨著儲藏時間的延長，開蓋紅方腐乳水分活度的變化見圖1。

圖1 紅方腐乳開蓋貯藏過程中水分活度(Aw)的變化Fig.1 The change of water activity of lid-opened red sufu during storage

由圖1可知，在25 ℃和35 ℃貯藏的紅方腐乳，Aw的變化都呈先下降后上升的趨勢，而在4 ℃和15 ℃貯藏的腐乳Aw變化規(guī)律與25 ℃和35 ℃相反，呈先上升后下降的趨勢。所有樣品的水分活度均大于0.85，為各種微生物的生長和酶的分泌提供了很好的水環(huán)境。

pH值主要是通過影響微生物的生長代謝和微生物分泌的氨基酸脫羧酶活性來影響生物胺的生成，其生成也被認為是微生物抵抗酸性環(huán)境的作用。Bubelova等[12]研究了不同pH(4，5，6，7，8)對沙雷氏菌CCM 303生長、腐胺和尸胺含量的綜合影響，結果表明在pH 5～7的培養(yǎng)條件下，腐胺和尸胺濃度最高。Greif等[13]研究了NaCl濃度和初始pH值對GTY發(fā)酵液中產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌生成生物胺的影響。在含3% NaCl的肉湯中，尸胺和組胺濃度最高。在NaCl濃度為0.5%、pH值為6時，腐胺含量最高。在不同溫度下，隨著儲藏時間的延長，開蓋紅方腐乳pH值的變化見圖2。

圖2 紅方腐乳開蓋貯藏過程中pH值的變化Fig.2 The change of pH values of lid-opened red sufu during storage

由圖2可知，在4 ℃儲藏下的pH值偏高，在15 ℃和25 ℃儲藏下的pH值偏低，且從第0～45 d，pH值呈波動變化，45 d以后，所有溫度下的pH都大幅度下降，除了在15 ℃下儲藏的樣品。

氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸狀態(tài)存在的氮元素，發(fā)酵產(chǎn)品中通過測定氨基酸態(tài)氮含量來了解氮源的量及被微生物利用的情況[14]。不同溫度下，隨著儲藏時間的延長，開蓋紅方腐乳氨基酸態(tài)氮含量的變化見圖3。

圖3 紅方腐乳開蓋貯藏過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.3 The change of amino acid nitrogen content of lid-opened red sufu during storage

紅方腐乳在整個貯藏過程中，除25 ℃貯藏的腐乳外，其他3種貯藏溫度下的腐乳FAAN含量有相同的變化規(guī)律。在15 ℃貯藏的紅方腐乳在整個貯藏過程中FAAN含量變化不大，4 ℃貯藏的紅方腐乳在第60天時FAAN達到最大值(0.42 g/100 g)，通過分析可得，F(xiàn)AAN和生物胺之間存在著一定的關系，在貯藏過程中FAAN含量的變化一定程度上也反映出總胺含量的動態(tài)變化，之前也有研究者表明氨基酸態(tài)氮與生物胺存在正相關[15]。

2.3 主成分分析

為了更直觀地反映不同溫度下儲藏的樣品與各種生物胺之間的關聯(lián)，使用主成分分析法對8種生物胺進行主成分加權，由圖4可知，前2個主成分解釋了累計方差貢獻率的98.1%，可以說明樣品的大部分信息。其中除了組胺以外的7種胺均在主成分1的正半軸，其中酪胺和尸胺分布在主成分2的負半軸，其余的胺分布在主成分2的正半軸。

圖4 主成分分析載荷圖Fig.4 Load diagram of principal component analysis

圖5 主成分分析的因子得分圖Fig.5 Factor scoring chart of principal component analysis

由圖5可知，在4 ℃下，更有利于促進亞精胺的生成；25 ℃和35 ℃儲藏下的樣品分布在組胺的象限中，說明在此溫度下，可以促進組胺的合成；25 ℃和35 ℃儲藏下的樣品聚集在一起，說明在儲藏過程中，這兩個溫度下的樣品中生物胺的變化類似；隨著儲藏溫度的升高，樣品從主成分1的正半軸轉向負半軸，更易受組胺含量的影響。

3 結論

通過對紅方腐乳開蓋后在不同溫度條件下貯藏對生物胺影響的研究，初步明確了貯藏溫度對紅方腐乳開蓋后生物胺的影響。腐乳在剛開蓋時苯乙胺含量低于30 mg/kg，組胺含量低于100 mg/kg，酪胺低于100 mg/kg。在4種溫度貯藏至第15天，苯乙胺和組胺含量分別超過30 mg/kg和100 mg/kg。在25 ℃和35 ℃貯藏的腐乳，前期(0～15 d)苯乙胺和組胺含量均顯著高于其他兩種貯藏溫度下的腐乳。在35 ℃條件下貯藏的腐乳酪胺含量顯著高于其他3個貯藏溫度的腐乳，且在整個貯藏過程中酪胺含量均在100 mg/kg以下。從試驗結果來看，腐乳開蓋后即使在4 ℃貯藏，在第15天也可能出現(xiàn)組胺和苯乙胺中毒情況，綜上所述，為了保證食用安全性，紅方腐乳開蓋后盡量在15 d內(nèi)食用完。