王 磊 任憲云 宋 柳 呂建建 高保全 劉 萍 孫東方

三疣梭子蟹基因的克隆及其在低鹽和病原脅迫后的表達(dá)分析*

王 磊1,3任憲云2,3宋 柳1,3呂建建2,3高保全2,3劉 萍2,3①孫東方3

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

本研究利用RACE方法克隆獲得三疣梭子蟹()凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apoptotic protease activating factor-1,基因，該基因cDNA全長(zhǎng)為2032 bp，其中，ORF為1050 bp，編碼349個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為39.13 kDa，理論等電點(diǎn)為7.67。同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，與凡納濱對(duì)蝦()的同源性最高，為51.27%，并與凡納濱對(duì)蝦聚為一支。組織表達(dá)分析顯示，基因的相對(duì)表達(dá)水平在肝胰臟最高，其次是肌肉、心臟、鰓和眼柄，血細(xì)胞和表皮最低。不同鹽度脅迫后，在Ⅱ期幼蟹體內(nèi)表達(dá)水平在3 h達(dá)到最大值，此后，呈先下降再上升趨勢(shì)；在80日齡鹽度20脅迫后三疣梭子蟹的鰓中呈上升趨勢(shì)，在肝胰腺中為先上升后下降趨勢(shì)，表明鹽度改變能影響該基因在鰓和肝胰腺組織中的表達(dá)。不同病原感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在血細(xì)胞中，注射副溶血弧菌()后的表達(dá)于48 h到達(dá)峰值，為對(duì)照組的2.76倍(<0.05)，注射白斑綜合征病毒(WSSV)后，僅在12 h表達(dá)水平上調(diào)，為對(duì)照組的1.25倍(<0.05)；在肝胰腺中，注射副溶血弧菌后在72 h到達(dá)峰值，為對(duì)照組的5.44倍(<0.05)，注射WSSV后在12 h到達(dá)峰值，為對(duì)照組的5.89倍(<0.05)，整體呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。本研究為進(jìn)一步理解三疣梭子蟹基因的生理功能提供了參考。

三疣梭子蟹；；低鹽度脅迫；副溶血弧菌；WSSV

凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apaf-1蛋白)是促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生的一個(gè)重要基因，Zou等(1997、1999)首次從子宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)胞漿內(nèi)純化和克隆出Apaf-1蛋白，已有報(bào)道證實(shí)，它在線粒體介導(dǎo)的凋亡過(guò)程中起核心作用(Campioni, 2005)。Apaf-1是發(fā)育性程序化細(xì)胞死亡的重要組成部分(Cecconi, 2001)，多種凋亡刺激干擾線粒體正常的電子轉(zhuǎn)移鏈過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體向胞漿釋放，釋放的細(xì)胞色素c易與Apaf-1結(jié)合，引發(fā)Apaf-1蛋白構(gòu)象改變，從而使其與dATP穩(wěn)定結(jié)合，這一過(guò)程導(dǎo)致凋亡小體的形成，進(jìn)一步促使了凋亡的發(fā)生。

三疣梭子蟹()主要分布于中國(guó)、朝鮮、日本等國(guó)家的沿海水域(戴愛(ài)云等, 1977)，是重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi)，在我國(guó)具有較大的養(yǎng)殖規(guī)模。鹽度和病原感染均能引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，鹽度是三疣梭子蟹生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子之一，在蛻皮、生長(zhǎng)、代謝和免疫等生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Cheng, 2000; Sang, 2004; Romano, 2006; 楊其彬等, 2008; 王沖等, 2010)。當(dāng)外界水環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，鰓是水生生物感受鹽度變化最為敏感的器官。魚(yú)類(lèi)的鹽度適應(yīng)是凋亡機(jī)制的觸發(fā)因素，尤其是在鰓的氯化物(或線粒體)細(xì)胞、皮膚和胃腸道的表皮成份中(Anvarifar, 2016)。Bonga等(1989)研究認(rèn)為，無(wú)論是在淡水適應(yīng)還是海水適應(yīng)的樣品中，羅非魚(yú)()鰓纖維和板層上皮細(xì)胞的變性和死亡均主要是通過(guò)細(xì)胞凋亡發(fā)生。Iger等(1994)通過(guò)研究鯉魚(yú)()經(jīng)海水浸泡處理后表皮細(xì)胞、鄰近細(xì)絲細(xì)胞和白細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，隨著海水鹽分含量的增加，細(xì)胞凋亡的細(xì)絲細(xì)胞數(shù)量增加。韓曉琳等(2014)關(guān)于低鹽對(duì)三疣梭子蟹鰓和肝胰腺組織的顯微結(jié)構(gòu)的研究表明，低鹽脅迫能分別對(duì)鰓和肝胰腺組織中的鰓上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞造成損傷，從而間接影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，無(wú)論是在魚(yú)類(lèi)還是三疣梭子蟹中，細(xì)胞凋亡均是存在的，其在鹽度適應(yīng)過(guò)程中普遍發(fā)生并發(fā)揮著不可替代的功能。甲殼動(dòng)物病原感染是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，已在許多蝦類(lèi)中進(jìn)行了關(guān)于病原感染在細(xì)胞凋亡中的研究，但在三疣梭子蟹中還未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)消除病原感染的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在包括對(duì)蝦在內(nèi)的許多生物的抗病原過(guò)程中也發(fā)揮重要作用(Granja, 2006; Kanokpan, 2003)。細(xì)胞凋亡除了在細(xì)胞發(fā)育和轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮重要作用外，在先天免疫中也具有關(guān)鍵作用(Everett, 1999)。免疫反應(yīng)是由病原感染引起的，從病原的角度來(lái)看，入侵者必須避免宿主誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(McLean, 2008; Irusta, 2003; Hilleman, 2004; Helen, 2002; Galluzzi, 2008)。甲殼類(lèi)動(dòng)物和其他無(wú)脊椎動(dòng)物一樣依賴(lài)先天免疫，而不存在基于抗體的適應(yīng)性免疫(Bayne, 2003)。Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是甲殼動(dòng)物抗病毒免疫的重要機(jī)制(Lei, 2008; Wang, 2013)，甲殼動(dòng)物凋亡進(jìn)程的發(fā)生是通過(guò)直接抑制啟動(dòng)子caspase上游的基因來(lái)控制的。為了探究在低鹽脅迫和病原感染后基因是否參與細(xì)胞凋亡，本研究以基因作為研究對(duì)象，分析該基因在低鹽脅迫和病原感染環(huán)境條件下的表達(dá)規(guī)律，為后續(xù)研究三疣梭子蟹凋亡途徑的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)分別于2018年5月和8月在山東昌邑海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司內(nèi)進(jìn)行，5月實(shí)驗(yàn)所用個(gè)體為Ⅱ期幼蟹，隨機(jī)選取健康的Ⅱ期幼蟹置于大小規(guī)格相同的整理箱中，用于鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)，每天更換1/3海水，定時(shí)投喂大鹵蟲(chóng)；8月實(shí)驗(yàn)所用個(gè)體為80日齡蟹(通過(guò)顯微鏡下觀察三疣梭子蟹游泳足趾節(jié)末端結(jié)構(gòu)，選取處在蛻皮間期的梭子蟹)，體重為(32.0±0.8) g，于室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng)7 d用于后續(xù)的鹽度脅迫和病原感染實(shí)驗(yàn)，暫養(yǎng)期間，水溫為(24±2)℃，鹽度為33，連續(xù)充氧，每天更換約1/3體積海水，定時(shí)投喂新鮮雜魚(yú)。

1.2 三疣梭子蟹Apaf-1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選得到基因的序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3′和5′特異性RACE引物(表1)、長(zhǎng)短鏈UPM、NUP通用引物進(jìn)行RACE克隆，本實(shí)驗(yàn)使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用TaKaRa LA?試劑盒進(jìn)行3′和5′末端全長(zhǎng)序列片段擴(kuò)增。3′末端擴(kuò)增以AP-F1和通用引物UPM混合進(jìn)行第1次PCR；然后以第1次反應(yīng)產(chǎn)物為模板，以AP-F2和通用引物NUP混合進(jìn)行第2次PCR。5′末端擴(kuò)增以AP-R1和通用引物UPM配對(duì)進(jìn)行第1次擴(kuò)增；然后以第1次反應(yīng)產(chǎn)物為模板，以AP-R2和通用引物NUP配對(duì)進(jìn)行第2次擴(kuò)增。PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57.0℃ 30 s，70℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；70℃ 10 min。將獲得的PCR產(chǎn)物切膠回收、載體連接、轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中，挑取并利用通用引物進(jìn)行菌落PCR，對(duì)陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行鑒定，篩選目的菌液測(cè)序。

1.3 Apaf-1基因的生物信息學(xué)分析

利用Contig Express軟件對(duì)測(cè)序得到的3′序列、5′序列與驗(yàn)證的基因EST序列進(jìn)行拼接，得到基因的cDNA全長(zhǎng)；使用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)提供的ORF查找器識(shí)別得到開(kāi)放閱讀框架(ORF)，并對(duì)編碼的氨基酸進(jìn)行翻譯；用BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)檢測(cè)核苷酸序列相似性，ExPASy (http://web.expasy. org/computepi/)在線軟件進(jìn)行分子量及等電點(diǎn)的預(yù)測(cè)；通過(guò)Pfam (http://pfam.xfam.org/search)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析；以氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用近鄰連接法，利用分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析MEGA 6.0，建立基于氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)比較分析各物種之間的親緣關(guān)系。

1.4 低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)

1.4.1 Ⅱ期幼蟹鹽度脅迫實(shí)驗(yàn) 取1200只健康活潑的Ⅱ期幼蟹，平均分成4組，包括1個(gè)對(duì)照組，為鹽度35的自然海水，3個(gè)低鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)組，鹽度分別為30、25、20，低鹽水體調(diào)配方法詳見(jiàn)隋延明等(2012)。鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)在完全一致的整理箱中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。鹽度脅迫后，分別在0、3、6、12、24、48和72 h時(shí)進(jìn)行取樣。由于Ⅱ期幼蟹個(gè)體比較小，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取10只進(jìn)行混合，置于凍存管中，樣品置于液氮中保存。

1.4.2 80日齡三疣梭子蟹鹽度脅迫實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取30只暫養(yǎng)后健康的三疣梭子蟹進(jìn)行72 h半致死鹽度(72h-LC50)預(yù)實(shí)驗(yàn)(韓曉琳等, 2014; 隋延鳴, 2012)，確定72h-LC50為11。根據(jù)隋延明等(2012)的方法進(jìn)行鹽度脅迫預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出本實(shí)驗(yàn)80日齡梭子蟹72 h半致死的鹽度為11。正式實(shí)驗(yàn)前，連續(xù)充氣暫養(yǎng)7 d，每天定時(shí)換水投喂餌料。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，設(shè)置鹽度33的對(duì)照組、低鹽20實(shí)驗(yàn)組和低鹽11實(shí)驗(yàn)組。低鹽水體的調(diào)配方法見(jiàn)隋延明等(2012)，實(shí)驗(yàn)期間的飼養(yǎng)管理與暫養(yǎng)期保持一致，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組90只蟹子，設(shè)置3個(gè)平行。各鹽度實(shí)驗(yàn)組取樣時(shí)間與Ⅱ期幼蟹相同。各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取3只梭子蟹，并取3個(gè)平行樣品的鰓組織和肝胰腺組織樣本，標(biāo)記編號(hào)后置于液氮保存。

1.5 病原感染實(shí)驗(yàn)

取暫養(yǎng)后健康活潑的80日齡三疣梭子蟹300只，均分為3組，每組100只，均于游泳足第一關(guān)節(jié)基膜處(謝建軍等, 2011; Ren, 2017)進(jìn)行注射，空白對(duì)照組注射100 μl無(wú)菌的海洋甲殼動(dòng)物生理鹽水，副溶血弧菌()實(shí)驗(yàn)組和WSSV實(shí)驗(yàn)組注射濃度參照張杰等(2018)的72 h半致死濃度，預(yù)實(shí)驗(yàn)得到副溶血弧菌和白斑綜合征病毒(WSSV)分別為2.5×107CFU/ml、3.4×107拷貝/ml，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，其中，WSSV粗提液和副溶血弧菌懸液參照竇全偉等(2019)的方法提取制備，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，飼養(yǎng)管理與暫養(yǎng)期一致。在注射病原后的0、3、6、12、24、48和72 h取梭子蟹的血細(xì)胞和肝胰腺組織樣本，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取3只梭子蟹進(jìn)行混合處理，每只都于游泳足第1關(guān)節(jié)基膜處或心臟處抽取1 ml血液，并與1 ml抗凝劑均勻混合，轉(zhuǎn)移置l.5 ml無(wú)RNA酶離心管中，4℃ 4000 r/min離心15 min，然后將上清液即血清去掉，保留血細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，樣品標(biāo)記編號(hào)后置于液氮中保存。

1.6 三疣梭子蟹Apaf-1基因的表達(dá)分析

采用TRIzol (Roche公司)方法提取總RNA，選取高質(zhì)量的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR定量分析檢測(cè)，參照PrimeScriptRTreagent Kit說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成20 μl cDNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。定量的引物設(shè)計(jì)基于所獲得的基因的cDNA全長(zhǎng)序列(表1)，內(nèi)參基因選用β-actin(表1)，樣品的熒光定量分析通過(guò)使用Applied BiosystemsTM7500 Real Time PCR instrument定量?jī)x，采用2-ΔΔCt的計(jì)算方法進(jìn)行。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系為10 μl，其中，SYBR Premix ExTMⅡ 5 μl、cDNA 1 μl、10 pmol/μl正反引物各0.4 μl、ROX Reference dye Ⅱ 0.2 μl和去離子水3 μl。反應(yīng)程序: 95℃ 10 min; 95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40個(gè)循環(huán); 95℃ 15 s; 60℃ 1 min; 95℃ 15 s。反應(yīng)完成后，采用Excel (Somboonna, 2010)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用2-ΔΔCt來(lái)比較值法計(jì)算數(shù)據(jù)，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，<0.05表示差異顯著。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列

Tab.1 Sequences of the primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 Apaf-1基因的cDNA全長(zhǎng)及序列同源性分析

實(shí)驗(yàn)獲得的三疣梭子蟹基因(GenBank登錄號(hào)MH178242)的結(jié)構(gòu)特征見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，該基因的cDNA序列全長(zhǎng)為2032 bp，其中，ORF為1050 bp，共編碼349個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)理論等電點(diǎn)為7.67，分子量為39.13 kDa，且不穩(wěn)定系數(shù)為45.84，推測(cè)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。SMART預(yù)測(cè)該基因存在Ⅱ類(lèi)醛縮酶和內(nèi)收蛋白N端結(jié)構(gòu)域(圖1)。利用Blast在線軟件來(lái)比較三疣梭子蟹和其他物種的Apaf-1氨基酸序列(圖2)，結(jié)果顯示，三疣梭子蟹基因與凡納濱對(duì)蝦的同源性最高為51.27%。使用MEGA 6.0軟件對(duì)三疣梭子蟹基因系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖3)，結(jié)果顯示，與凡納濱對(duì)蝦聚為一支，在進(jìn)化上關(guān)系較近，而與脊椎動(dòng)物等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 Apaf-1基因組織表達(dá)分析

基因組織分布情況如圖4所示，各組織中均有該基因表達(dá)，其中，在肝胰腺中表達(dá)量最高，然后是肌肉、心臟、鰓和眼柄和血細(xì)胞，表皮中表達(dá)量最低。

圖1 三疣梭子蟹Apaf-1基因cDNA全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列

ATG：起始密碼子；*：終止密碼子；下劃線區(qū)域?yàn)榛颌蝾?lèi)醛縮酶和內(nèi)收蛋白N-末端結(jié)構(gòu)域

ATG: Start codon; *: Stop codon; Bold underlines indicate Class II Aldolase and Adducin N-terminal domain

圖2 三疣梭子蟹Apaf-1氨基酸序列比對(duì)

圖3 基于Apaf-1氨基酸序列的不同物種進(jìn)化樹(shù)分析

圖4 三疣梭子蟹Apaf-1基因在各組織中的表達(dá)

He：肝胰腺；M：肌肉；H：心臟；G：鰓；E：眼柄；Hem：血細(xì)胞；C：表皮柱上不同字母代表差異顯著(<0.05)，下同

He: Hepatopancreas; M: Muscle; H: Heart; G: Gill; E: Eyestalk; Hem: Hemocyte; C: Cutex Different letters indicate significant difference (<0.05). The same as below

2.3 三疣梭子蟹低鹽脅迫下Apaf-1基因的表達(dá)分析

2.3.1 三疣梭子蟹Ⅱ期幼蟹鹽度脅迫下的表達(dá)分 析 三疣梭子蟹Ⅱ期幼蟹在低鹽脅迫后基因表達(dá)情況如圖5所示。不同鹽度脅迫后，基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化，在鹽度30、25、20脅迫后，該基因的表達(dá)水平均于3 h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的6.7倍、23.9倍和5.6倍，均為上調(diào)表達(dá)(<0.05)。

2.3.2 三疣梭子蟹80日齡個(gè)體低鹽脅迫后的表達(dá)分析 三疣梭子蟹在鹽度脅迫后的鰓和肝胰腺組織中的基因表達(dá)情況如圖6所示。在鰓組織中，鹽度20脅迫后，基因表達(dá)量整體呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，除3 h、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之外，其余時(shí)間點(diǎn)該基因均為上調(diào)表達(dá)(<0.05)，72 h基因表達(dá)量最高，為對(duì)照組的

圖5 低鹽脅迫下Ⅱ期幼蟹的表達(dá)水平

圖6 三疣梭子蟹Apaf-1基因在低鹽脅迫下鰓和肝胰腺中的表達(dá)

6.67倍。在鹽度11脅迫后，基因表達(dá)量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，從3 h起，該基因的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著下調(diào)(<0.05)，且在3 h該基因表達(dá)量下調(diào)至最低值，為對(duì)照組的0.04倍，在24 h表達(dá)量有所回升，為正常對(duì)照組的0.59倍(<0.05)。在肝胰腺組織中，在鹽度20脅迫下，在3 h該基因表達(dá)量最少，是對(duì)照組的0.55倍(<0.05)，此后，表達(dá)量上升至72 h，整體均為上調(diào)表達(dá)，其中，12 h到達(dá)最大值，為對(duì)照組的5.11倍(<0.05)。在鹽度11脅迫下，基因表達(dá)量在24 h降至最低值，為對(duì)照組的0.07倍(<0.05)，除12 h、72 h外，整體均呈下調(diào)表達(dá)(<0.05)。

2.3.3 三疣梭子蟹80日齡個(gè)體病原感染后的表達(dá)分析基因病原感染在三疣梭子蟹血細(xì)胞和肝胰腺組織中表達(dá)情況如圖7所示。注射副溶血弧菌后，在血細(xì)胞中，基因表達(dá)呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，在48 h到達(dá)峰值，為生理鹽水對(duì)照組的2.76倍(<0.05)，WSSV注射后，基因僅在12 h血細(xì)胞中出現(xiàn)上調(diào)，表達(dá)水平為生理鹽水對(duì)照組的1.25倍(<0.05)，其余時(shí)間為下調(diào)表達(dá)。在肝胰腺中，注射副溶血弧菌后，基因表達(dá)呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，在72 h到達(dá)峰值，為生理鹽水對(duì)照組的5.44倍(<0.05)，在感染W(wǎng)SSV后，基因表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在12 h到達(dá)峰值，為對(duì)照組的5.89倍(<0.05)，在72 h恢復(fù)到對(duì)照組的正常水平，整體表達(dá)水平均呈顯著上調(diào)。

圖7 三疣梭子蟹血細(xì)胞和肝胰腺感染副溶血弧菌和 WSSV病毒后Apaf-1基因的表達(dá)

3 討論

本研究首次克隆獲得三疣梭子蟹凋亡蛋白酶激活因子-1基因全長(zhǎng)，將其命名為，cDNA全長(zhǎng)為2032 bp，其中，開(kāi)放閱讀框1050 bp，編碼1個(gè)由349個(gè)氨基酸所組成的多肽?；蚓幋a的蛋白質(zhì)經(jīng)Blast在線比對(duì)顯示，與其他無(wú)脊椎動(dòng)物以及脊椎動(dòng)物的同源性都較高(73%~98%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)得出，三疣梭子蟹與凡納濱對(duì)蝦聚為一支，與其他無(wú)脊椎動(dòng)物聚為一類(lèi)。同源性分析表明，基因編碼的氨基酸與其他物種的基因編碼的氨基酸一樣高度保守，具有特定的內(nèi)收蛋白N端結(jié)構(gòu)域。綜上所述，可以確定該序列為三疣梭子蟹基因序列。

根據(jù)組織表達(dá)分布，得出該基因在肝胰腺中表達(dá)量最高，推測(cè)肝胰腺是其基因發(fā)生作用的主要場(chǎng)所。鹽度脅迫后，Ⅱ期幼蟹中基因的表達(dá)量在3 h時(shí)到達(dá)峰值，可能由于鹽度驟變Ⅱ期幼蟹對(duì)鹽度的響應(yīng)性較強(qiáng)，王沖等(2010)研究表明，鹽度驟變20或以上時(shí)，顯著影響三疣梭子蟹Ⅱ期幼蟹的存活率，當(dāng)幼蟹適應(yīng)鹽度變化后，基因的表達(dá)量就會(huì)隨著時(shí)間的推移而慢慢上升。80日齡在鹽度20脅迫后，該基因在鰓中的表達(dá)量增加，Kammerer等(2009)研究認(rèn)為，鹽度脅迫下羅非魚(yú)鰓組織的鰓上皮的凋亡細(xì)胞隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在鹽度11時(shí)，該基因的表達(dá)量低于對(duì)照組水平，推測(cè)可能由于鹽度脅迫導(dǎo)致機(jī)體生命活動(dòng)紊亂，鰓的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致該基因表達(dá)量降低。肝胰腺中基因的表達(dá)量在鹽度20和11時(shí)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，不同之處在于前者整體呈上調(diào)表達(dá)，后者為下調(diào)表達(dá)。根據(jù)韓曉琳等(2014)低鹽脅迫后三疣梭子蟹的肝胰腺的顯微鏡結(jié)構(gòu)，低鹽脅迫后肝胰腺組織中的肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的變化，反映了凋亡活化因子的對(duì)應(yīng)表達(dá)。表明低鹽脅迫通過(guò)影響基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。

甲殼動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中血細(xì)胞和肝胰腺具有清除受損細(xì)胞的作用(Yao, 2006)。凋亡基因在病原體入侵過(guò)程中的可能作用是參與機(jī)體清除受損細(xì)胞過(guò)程，在病原脅迫實(shí)驗(yàn)中，甲殼類(lèi)血細(xì)胞主要參與對(duì)外來(lái)物質(zhì)的識(shí)別和清除，其免疫應(yīng)答多發(fā)生在感染后的前12 h (S?derh?ll, 1998)，感染副溶血弧菌后，基因在12 h表達(dá)量增加；感染W(wǎng)SSV后，該基因在24 h到達(dá)峰值，此過(guò)程中，該基因的表達(dá)量上升，清除對(duì)機(jī)體免疫產(chǎn)生的受損細(xì)胞，保持機(jī)體正常的生理活動(dòng)。基因在注射副溶血弧菌后的肝胰腺中的表達(dá)量呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，病原脅迫后，機(jī)體細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，來(lái)主動(dòng)防御外來(lái)物質(zhì)的入侵，此時(shí)的表達(dá)量會(huì)上升，幫助機(jī)體清除受損細(xì)胞，來(lái)保護(hù)機(jī)體正常生理機(jī)能(Chang, 2008)?；蛟谌嗨笞有犯腥網(wǎng)SSV后的肝胰腺中出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)(<0.05)，在血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)不同，推測(cè)可能是由于在血細(xì)胞和肝胰腺中，二者的調(diào)控機(jī)制不同，受病原感染之后的凋亡機(jī)制也不一樣。病原感染實(shí)驗(yàn)表明，基因參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究探討了三疣梭子蟹低鹽脅迫和病原感染后凋亡通路基因的表達(dá)模式及可能的調(diào)控機(jī)制，克隆了基因cDNA全長(zhǎng)，分析了基因在主要組織中的表達(dá)情況，明確了在低鹽脅迫過(guò)程中，該基因在肝胰腺和鰓組織中的表達(dá)變化模式，初步了解基因在免疫防御的響應(yīng)機(jī)理，為深入研究三疣梭子蟹凋亡通路在鹽度適應(yīng)和病原感染中的作用機(jī)制提供了參考。

Anvarifar H, Amirkolaie AK, Miandare HK,. Apoptosis in fish: Environmental factors and programmed cell death. Cell and Tissue Research, 2016, 368(3): 425–439

Bayne CJ. Origins and evolutionary relationships between the innate and adaptive arms of immune systems. Integrative and Comparative Biology, 2003, 43(2): 293–299

Bonga SEW, Meij CJMVD. Degeneration and death, by apoptosis and necrosis, of the pavement and chloride cells in the gills of the teleost. Cell and Tissue Research, 1989, 255(1): 235–243

Campioni M, Santini D, Tonini G,Role of Apaf-1, a key regulator of apoptosis, in melanoma progression and chemoresistance. Experimental Dermatology, 2005, 14(11): 811–818

Cecconi F, Gruss P. Human genome and diseases: Apaf1 in developmental apoptosis and cancer: How many ways to die? Cellular and Molecular Life Sciences, 2001, 58(11): 1688–1697

Chang CC, Yeh MS, Lin HK,The effect ofinfection on caspase-3 expression and activity in white shrimp. Fish and Shellfish Immunology, 2008, 25(5): 672–678

Cheng W, Chen JC. Effects of pH, temperature and salinity on immune parameters of the freshwater prawn. Fish and Shellfish Immunology, 2000, 10(4): 387–391

Dou QW, Li JT, Liu P,. cDNA and immunological properties of two variants of hemocyanin subunit with higher molecular weight in. Acta Hydrobiologica Sinica, 2019, 43(1): 37–44 [竇全偉, 李吉濤, 劉萍, 等. 脊尾白蝦2種血藍(lán)蛋白大亞基變體的克隆及功能分析. 水生生物學(xué)報(bào), 2019, 43(1): 37–44]

Dai AY, Feng ZQ, Song YZ,. Preliminary investigation on fishery biology of. Journal of Zoology, 1977(2): 36–39 [戴愛(ài)云, 馮鐘琪, 宋玉枝, 等. 三疣梭子蟹漁業(yè)生物學(xué)的初步調(diào)查. 動(dòng)物學(xué)雜志, 1977(2): 36–39]

Everett H, McFadden G. Apoptosis: An innate immune response to virus infection. Trends in Microbiology, 1999, 7(7): 160–165

Galluzzi L, Brenner C, Morselli E,Viral control of mitochondrial apoptosis. PLoS Pathogens, 2008, 4(5): e1000018

Granja CB, Vidal OM, Gustavo P,Hyperthermia reduces viral load of white spot syndrome virus in. Diseases of Aquatic Organisms, 2006, 68(2): 175–180

Han XL, Gao BQ, Wang HF,. Effects of low salt stress on gill and hepatopancreas and family survival rate of. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(1): 104–110 [韓曉琳, 高保全, 王好鋒, 等. 低鹽脅迫對(duì)三疣梭子蟹鰓和肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)及家系存活的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2014, 35(1): 104–110]

Helen E, Michele B, Xuejun S,The myxoma poxvirus protein, M11L, prevents apoptosis by direct interaction with the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Experimental Medicine, 2002, 196(9): 1127–1140

Hilleman MR. Strategies and mechanisms for host and pathogen survival in acute and persistent viral infections. Proceeding of National Academy of Sciences of USA, 2004, 101(2): 14560–14566

Iger Y, Abraham M, Bonga SEW. Response of club cells in the skin of the carpto exogenous stressors. Cell and Tissue Research, 1994, 277 (3): 485–491

Irusta PM, Chen YB, Hardwick JM. Viral modulators of cell death provide new links to old pathways. Current Opinion in Cell Biology, 2003, 15(6): 700–705

Kammerer BD, Kultz D. Prolonged apoptosis in mitochondria- rich cells of tilapia () exposed to elevated salinity. Journal of Comparative Physiology B Biochemical, Systems, and Environmental Physiology, 2009, 179(4): 535–542

Kanokpan W, Kornnika K, Supatra SG,Time-course and levels of apoptosis in various tissues of black tiger shrimpinfected with white-spot syndrome virus. Diseases of Aquatic Organisms, 2003, 55(1): 3–10

Lei W, Zhi B, Wu W,Requirement for shrimp caspase in apoptosis against virus infection. Developmental and Comparative Immunology, 2008, 32(6): 706–715

McLean JE, Ruck A, Shirazian A,Viral manipulation of cell death. Current Pharmaceutical Design, 2008, 14(3): 198–220

Ren X, Lü J, Gao B,Immune response and antioxidant status ofinoculated with pathogens. Fish and Shellfish Immunology, 2017, 63: 322–333

Romano N, Zeng C. The effects of salinity on the survival, growth and haemolymph osmolality of early juvenile blue swimmer crabs,. Aquaculture, 2006, 260(1): 151–162

Sang HM, Fotedar R. Growth, survival, haemolymph osmolality and organosomatic indices of the western king prawn (Kishinouye, 1896) reared at different salinities. Aquaculture, 2004, 234(1): 601–614

S?derh?ll K, Cerenius L. Role of the prophenoloxidase- activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology, 1998, 10(1): 23–28

Somboonna N, Mangkalanan S, Udompetcharaporn A,Mud crab susceptibility to disease from white spot syndrome virus is species-dependent. BMC Research Notes, 2010, 3(1): 315

Sui YM, Gao BQ, Liu P,. Preliminary studies on the salinity tolerance of "Huangxuan No.1"Progress in Fishery Science, 2012, 33(2): 63–68 [隋延鳴, 高保全, 劉萍, 等. 三疣梭子蟹“黃選1號(hào)”鹽度耐受性分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(2): 63–68]

Sui YM. The effects of salinity on growth, immune-related and metabolism-related enzymes activity of"Huangxuan No.1". Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2012 [隋延鳴. 鹽度對(duì)三疣梭子蟹“黃選1號(hào)”生長(zhǎng)及免疫、代謝相關(guān)酶的影響. 上海海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2012]

Wang C, Jiang LX, Wang RJ,. Effect of abrupt and gradual changes in salinity on development and feeding in juvenile swimming crab (). Fisheries Science, 2010, 29 (9): 510–514 [王沖, 姜令緒, 王仁杰, 等. 鹽度驟變和漸變對(duì)三疣梭子蟹幼蟹發(fā)育和攝食的影響. 水產(chǎn)科學(xué), 2010, 29(9): 510–514]

Wang PH, Wan DH, Chen YG,Characterization of four novel caspases from(Lvcaspase2-5) and their role in WSSV infection through dsRNA-mediated gene silencing. PLoS One, 2013, 8(12): 804–818

Xie JJ, Xu WJ, Shi H,. Evaluation of hemato- immunological parameters in the swimming crabinfected. Journal of Fisheries of China, 2011, 35(9): 1392–1398 [謝建軍, 許文軍, 施慧, 等. 溶藻弧菌誘導(dǎo)對(duì)三疣梭子蟹血淋巴非特異性免疫水平的影響. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(9): 1392–1398]

Yang QB, Ye L, Wen WG,. Effect of salinity on molting, survival, growth and feed conversion rate of juvenile. South China Fisheries Science, 2008, 4(1): 16–21 [楊其彬, 葉樂(lè), 溫為庚, 等. 鹽度對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦蛻殼、存活、生長(zhǎng)和飼料轉(zhuǎn)化率的影響. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2008, 4(1): 16–21]

Yao CL, Wang ZY, Xiang JH. Crustacean haemocytes and their function in immune responses. Zoological Research, 2006, 27(5): 549–557

Zhang J, Lü JJ, Liu P,Cloning of Toll4 inand its expression in responding to pathogenic infection and low salinity stress. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(2): 146–155 [張杰, 呂建建, 劉萍, 等. 三疣梭子蟹Toll4基因克隆及其在病原和低鹽脅迫中的表達(dá)特征分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(2): 146–155]

Zou H, Henzel WJ, Liu X,Apaf-1, a human protein homologous toCED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. 1997, 90(3): 405–413

Zou H, Li Y, Liu X,An APAF-1·cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(17): 11549–11556

Cloning and Expression Analysis of theGene inafter Exposure to Low Salt and Pathogenic Stresses

WANG Lei1,3, REN Xianyun2,3, SONG Liu1,3, Lü Jianjian2,3, GAO Baoquan2,3, LIU Ping2,3①, SUN Dongfang3

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071)

In this study, the apoptotic protein activator 1 (apoptotic protease activating factor-1,) gene of the swimming crab () was cloned using the RACE technique. The full length of the gene was 2032 bp, and the ORF was 1050 bp, encoding 349 amino acids, with a predicted molecular weight of 39.13 kDa, and a theoretical isoelectric point of 7.67. The homology and phylogenetic analysis showed that the homology ofwithwas 51.27%, and it was also clustered with. Tissue expression analysis showed that the relative expression level of thegene was highest in the hepatopancreas, followed by the muscle, heart, gill, and eyestalk, and was lowest in the hemocytes and epidermis. After different salinity stresses, the expression level ofin the stage Ⅱ juvenile crab reached its maximum at 3 h, and then decreased and then increased.showed an upward trend in the gills after salinity 20 stress after 80 d, and an upward and downward trend in the hepatopancreas, suggesting that the change of salinity could affect the expression ofin the gill and hepatopancreas. The results showed that the expression ofreached its peak at 48 h after injection of, which was 2.76 times higher than that of the control group (<0.05), and increased 12 h after the injection of white spot syndrome virus (WSSV), which was 1.25 times higher than that of the control group (<0.05). In the hepatopancreas, the expression ofreached its peak at 72 h after the injection of, which was 5.44 times higher than that of the control group (<0.05), and 12 h after the injection of WSSV. The peak value was 5.89 times higher than that of the control group (<0.05), and the expression was up-regulated as a whole. This study provides a reference for further understanding the physiological function of thegene in.

;; Low salinity stress;; WSSV

LIU Ping, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

S917

A

2095-9869(2020)04-0085-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190418001

http://www.yykxjz.cn/

王磊, 任憲云, 宋柳, 呂建建, 高保全, 劉萍, 孫東方. 三疣梭子蟹基因的克隆及其在低鹽和病原脅迫后的表達(dá)分析.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(4): 85–93

Wang L, Ren XY, Song L, Lü JJ, Gao BQ, Liu P, Sun DF. Cloning and expression analysis of thegene inafter exposure to low salt and pathogenic stresses. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(4): 85–93

* 國(guó)家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-48)、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41876186)、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(面上項(xiàng)目) (BE2017325)和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2020TD46)共同資助[This work was supported by the National Shrimp and Crab Industry Technology System (CARS-48), National Natural Science Foundation of China (41876186), Key Research and Development Plan of Jiangsu Province (BE2017325), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD46)]. 王 磊，E-mail: 1006966437@qq.com

劉 萍, 研究員, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

2019-04-18,

2019-05-15

(編輯 馮小花)