朱金帥 李秋瑩 于昕睿 孫 彤 勵建榮

(1. 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2. 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013)

腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)是一種革蘭氏陰性運動桿菌，具有較強(qiáng)的致腐敗能力，是水產(chǎn)品的特定腐敗菌之一，其生長代謝活動中能夠分解肌肉蛋白，將氨基酸脫羧生成腐胺、尸胺等生物胺[1]，產(chǎn)生H2S等臭味物質(zhì)[2]，其形成的生物被膜可導(dǎo)致水產(chǎn)品表面發(fā)黏。微生物的生長和繁殖是引起水產(chǎn)品腐敗的主要因素。

酚酸是高等植物中分布廣泛的一類含有酚羥基和羧基的重要次生代謝產(chǎn)物[3]，有調(diào)查[4]顯示，人體內(nèi)每日攝入的酚酸是所攝入總酚含量的1/3，攝入含量為25～1 000 mg，目前許多保健品中均含有綠原酸及咖啡酸等成分，可以有效地促進(jìn)血液循環(huán)、淡化黃褐斑、緩解腰酸腿痛等癥狀。將酚酸作為功能性食品添加劑，添加到各類啤酒和葡萄酒當(dāng)中，能起到保肝護(hù)脾的作用[5]。常見酚酸如沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸等，已被應(yīng)用于食品加工和保鮮等領(lǐng)域[6]。沒食子酸作為一種較為常見的酚酸，對各種食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和弗氏志賀菌均具有較強(qiáng)的抗菌作用[7]。沒食子酸在體外具有抗假單胞菌的效果[8]。然而，目前尚未見沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸對水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的抑制作用的研究報道。研究擬比較沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸3種酚酸對腐敗希瓦氏菌的抑制活性，并通過掃描電鏡、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞膜完整性和通透性測定研究沒食子酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌作用及機(jī)制，以期為酚酸在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌SP22(ShewanellaputrefaciensSP22)：渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實驗室從腐敗大菱鲆中分離獲得并在-80 ℃下保藏；

LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)肉湯：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；

沒食子酸、綠原酸、原兒茶酸：上海源葉生物科技有限公司；

蛋白濃度測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

碘化丙啶(PI)、戊二醛、PBS溶液：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

立式高壓蒸汽滅菌鍋：mLS-3030CH型，日本三洋有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH-150型，上海恒科技有限公司；

超速離心機(jī)：cs 150 gx3型，日本日立公司；

酶標(biāo)儀：Victor X3型，新加坡珀金埃爾默儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV2550型，尤尼柯儀器有限公司；

電子分析天平：MS105UD型，瑞士Mettler Toledo公司；

掃描電鏡：S-4800型，美國BIO-RAD公司；

電導(dǎo)率儀：FE38-Meter型，瑞士Mettler Toledo公司；

流式細(xì)胞儀：Accuri C6 Plus型，美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將貯藏于-80 ℃的腐敗希瓦氏菌取出，接種于LB肉湯培養(yǎng)基中在28 ℃，110 r/min搖床震蕩培養(yǎng)活化 2代，并稀釋菌液濃度為105CFU/mL，備用。

1.2.2 不同酚酸的抑菌直徑測定 分別配制濃度為7.5，5.0，2.5 mg/mL沒食子酸(GA)、綠原酸(CA)和原兒茶酸(PA)水溶液。將2 mL菌懸液(105CFU/mL)加入到200 mL 無菌LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，向垂直放置3個牛津杯的培養(yǎng)皿中傾注約20 mL，放置至LB營養(yǎng)瓊脂徹底凝固。取出牛津杯，分別向孔中加入不同酚酸溶液200 μL，每個濃度做3個平行組。將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑大小。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)測定 采用微量肉湯二倍稀釋法[9]進(jìn)行抑菌劑MIC和MBC測定。采用LB液體培養(yǎng)基在96孔板中進(jìn)行酚酸溶液的二倍梯度稀釋，分別獲得最終濃度為5.000 0，2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.372 50，0.156 25 mg/mL的3種酚酸系列溶液。每孔接種100 μL腐敗希瓦氏菌菌懸液(105CFU/mL)，混勻后放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以肉眼觀察，沒有變渾濁的最低濃度為酚酸對該菌的MIC，每組重復(fù)3次。將無菌生長的孔中的液體吸出涂布于LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，無菌生長的濃度為酚酸的MBC。

1.2.4 生長曲線和時間殺菌曲線的測定 將沒食子酸添加到腐敗希瓦氏菌菌懸液(105CFU/mL)中，使其最終濃度為MIC，于28 ℃、110 r/min 條件下培養(yǎng)。以未添加沒食子酸的菌液為對照組。每隔2 h用酶標(biāo)儀測定OD595 nm值，每組重復(fù)3次，取平均值，繪制腐敗希瓦氏菌生長曲線。每隔2 h吸取各組培養(yǎng)液200 μL，進(jìn)行平板活菌菌落計數(shù)并繪制時間殺菌曲線[10]。

1.2.5 掃描電鏡 取一定量已培養(yǎng)的腐敗希瓦氏菌菌懸液，于3 000 r/min離心10 min，棄去上清液。將菌體用0.1 mol/L PBS (pH=7.4)清洗2次，于3 000 r/min離心10 min，再用PBS稀釋，使菌懸液OD595 nm≈0.5。將沒食子酸添加到菌懸液中，使其終濃度為MIC，置于28 ℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min) 12 h。以未添加沒食子酸的菌液為對照組。將各組培養(yǎng)液于3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用無菌水清洗2次。將菌體與20 mL 2.5%的戊二醛溶液混勻，固定處理2 h。無菌水清洗2次后，分別在50%，70%，80%，90%的乙醇中浸泡30 min，在100%的無水乙醇中浸泡1 h進(jìn)行逐級脫水。取適量菌懸液于蓋玻片上，37 ℃下干燥72 h。將菌體進(jìn)行噴金處理，采用掃描電鏡對菌體微觀形貌進(jìn)行表征分析[11]。

1.2.6 細(xì)胞凋亡測定 細(xì)菌前處理參照1.2.5，置于28 ℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min) 12 h后，將培養(yǎng)液于1 000 r/min離心5 min，棄上清液，0.1 mol/L PBS (pH=7.4)清洗2次，于1 000 r/min離心5 min，棄上清液。菌體用1 mL PI染液染色，于4 ℃避光放置30 min。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況[12]。

1.2.7 細(xì)菌核酸泄漏測定 細(xì)菌前處理參照1.2.5，置于28 ℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min)12 h后，用0.22 μm濾膜過濾菌懸液，用酶標(biāo)儀測定濾液在260 nm波長下OD值，每組重復(fù)測定3次[13]。

1.2.8 細(xì)菌蛋白泄露測定 細(xì)菌前處理參照1.2.5，置于28 ℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min)12 h后，用BCA蛋白檢測試劑盒對菌懸液蛋白濃度進(jìn)行測定。

1.2.9 電導(dǎo)率測定 細(xì)菌前處理參照1.2.5，置于28 ℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min)，每間隔10 min用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，直至電導(dǎo)率值達(dá)到平衡值。

1.2.10 統(tǒng)計分析 采用Excel 2010及Origin 8.5軟件處理數(shù)據(jù)和生成圖表，數(shù)據(jù)為重復(fù)3次所得的平均值，用SPSS 19.0 (統(tǒng)計分析系統(tǒng))進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚酸對腐敗希瓦氏菌的抑制活性

沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌直徑見表1。抑菌直徑最大的為7.5 mg/mL的沒食子酸，最小的為5 mg/mL的綠原酸，而2.5 mg/mL綠原酸幾乎沒有抑菌圈出現(xiàn)。3種酚酸的抑菌直徑均隨抑菌劑濃度的增加而增大，表明酚酸抑菌活性與其濃度呈正比。同等濃度的沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸中，沒食子酸的抑菌直徑均為最大，其次是原兒茶酸。表明3種酚酸對水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌抑菌活性從大到小依次為沒食子酸>原兒茶酸>綠原酸。

表1 酚酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌圈直徑

采用肉湯二倍稀釋法測定不同酚酸的MIC和MBC的數(shù)值，進(jìn)一步比較各個酚酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌能力。沒食子酸對腐敗希瓦氏菌的MIC為1.25 mg/mL，MBC值為2.5 mg/mL，與其他兩種酚酸相比，MIC和MBC值均最低(表2)，表明其具有較強(qiáng)的抗菌活性。李建科等[14]研究了不同細(xì)菌對沒食子酸的抑制效果，研究表明沒食子酸對金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC分別為2，4，4，4 mg/mL。表明沒食子酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌效果比對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌的好。

表2 酚酸對腐敗希瓦氏菌的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度

2.2 沒食子酸對腐敗希瓦氏菌生長曲線和殺菌曲線的影響

腐敗希瓦氏菌的生長曲線見圖1(a)，整個培養(yǎng)期，對照組的腐敗希瓦氏菌菌數(shù)呈逐漸增長趨勢，經(jīng)歷了延滯期、指數(shù)生長期和穩(wěn)定期[15]。而1.25 mg/mL (MIC)沒食子酸處理組沒有明顯增長的趨勢，不能進(jìn)入對數(shù)生長期。表明在此濃度下，腐敗希瓦氏菌的生長被完全抑制[16]。時間殺菌曲線如圖1(b)所示，腐敗希瓦氏菌培養(yǎng)過程中，對照組活菌數(shù)呈明顯的上升趨勢，經(jīng)歷了延滯期、指數(shù)生長期和穩(wěn)定期，與生長曲線一致。沒食子酸處理組的活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，表明此濃度下的沒食子酸具有一定殺菌活性。結(jié)合生長曲線與殺菌曲線可說明，沒食子酸在1.25 mg/mL (MIC)濃度下，活菌數(shù)量逐漸減少，能完全抑制腐敗希瓦氏菌的生長。

圖1 食子酸對腐敗希瓦氏菌的生長曲線和時間殺菌曲線

2.3 沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響

通過SEM觀察1.25 mg/mL (MIC)沒食子酸處理前后腐敗希瓦氏菌細(xì)胞的形態(tài)變化。如圖2(a)所示，對照組的腐敗希瓦氏菌菌體完整飽滿，菌體表面沒有破損。而經(jīng)沒食子酸[圖2(b)]處理細(xì)菌形貌發(fā)生變化，細(xì)胞破裂，扭曲變形，一些部位開始凹陷。可能是細(xì)胞膜破損造成細(xì)胞內(nèi)容物的大量泄露，從而使細(xì)胞明顯變形，粘連在一起。結(jié)果表明，沒食子酸可引起腐敗希瓦氏菌細(xì)胞的破損和變形，嚴(yán)重影響細(xì)胞正常生長，甚至造成細(xì)胞死亡。沒食子酸分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基可能是其產(chǎn)生抑菌作用的活性基團(tuán)，與細(xì)菌細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生反應(yīng)，改變細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，從而破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞形變[17]。

圖2 沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響

2.4 沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞圖分為4個區(qū)域，LL區(qū)為細(xì)胞存活，LR區(qū)為早期凋亡，UR區(qū)為晚期凋亡，UL區(qū)為細(xì)胞壞死。圖3(a)為對照組流式細(xì)胞分析結(jié)果，LL區(qū)細(xì)胞存活率高達(dá)96.1%，細(xì)胞壞死率為2.5%，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為0.6%和0.8%。由此可見，未經(jīng)處理的細(xì)菌存活率非常高。經(jīng)MIC沒食子酸[圖3(b)]處理的腐敗希瓦氏菌，存活率達(dá)到78.6%，細(xì)胞壞死率為20.8%，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為0.0%，0.6%，壞死率顯著高于對照組。較對照組相比，經(jīng)沒食子酸作用后的腐敗希瓦氏菌的凋亡率明顯增大，可能是沒食子酸能夠破壞細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜通透性增大。

圖3 沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜完整性的影響

經(jīng)沒食子酸處理的腐敗希瓦氏菌細(xì)胞中蛋白及核酸泄漏情況用于反映細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的變化。圖4(a)是1.25 mg/mL (MIC)沒食子酸處理的腐敗希瓦氏菌菌懸液在260 nm下的吸光值。對照組的OD260 nm為0.526，經(jīng)沒食子酸處理后的腐敗希瓦氏菌菌懸液的OD260 nm達(dá)到1.024，顯著高于對照組，表明沒食子酸處理引起腐敗希瓦氏菌核酸的外泄。對照組腐敗希瓦氏菌菌懸液中總蛋白濃度為3.689 mg/mL，沒食子酸處理后的蛋白濃度明顯增加至15.841 mg/mL，表明沒食子酸處理引起腐敗希瓦氏菌蛋白的外泄。以上結(jié)果說明腐敗希瓦氏菌的膜結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞的內(nèi)容物滲漏，進(jìn)一步影響了菌體的代謝與生長。這可能是因為沒食子酸具有較強(qiáng)的抗氧化性能，酚羥基能夠提供質(zhì)子，直接吸附于細(xì)胞，打破菌體原有的保護(hù)屏障，從而導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏增加[18]。

圖4 沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞完整性的影響

圖5 沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜通透性的影響

2.6 沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜通透性的影響

測定1.25 mg/mL (MIC)沒食子酸處理對腐敗希瓦氏菌菌懸液電導(dǎo)率的變化，進(jìn)而分析對細(xì)胞膜通透性的影響(圖5)。前60 min，各組電導(dǎo)率均有所增加，對照組電導(dǎo)率從13.46 mS/cm升至15.32 mS/cm，沒食子酸處理組腐敗希瓦氏菌菌懸液電導(dǎo)率從13.46 mS/cm迅速增加至16.91 mS/cm，其電導(dǎo)率顯著高于對照組。60 min 后，隨著時間的延長，各組電導(dǎo)率趨于穩(wěn)定。這一趨勢與Li等[19]的研究結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)ε-聚賴氨酸處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的電導(dǎo)率在培養(yǎng)前45 min下顯著增加。結(jié)果表明，沒食子酸處理使菌體的細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)大量的電解質(zhì)泄露至培養(yǎng)液中，電導(dǎo)率增加，這會影響其正常代謝，最終導(dǎo)致死亡[18]。

3 結(jié)論

沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸對腐敗希瓦氏菌均具有較好的抑制作用，其中沒食子酸對腐敗希瓦氏菌的抑制作用更強(qiáng)，其最小抑菌濃度為1.25 mg/mL。1.25 mg/mL (MIC)沒食子酸處理引起腐敗希瓦氏菌細(xì)胞形態(tài)的改變，細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞膜通透性增大，核酸、蛋白質(zhì)等大分子大量泄漏，致使細(xì)菌細(xì)胞凋亡率增加。沒食子酸是一種具有潛在應(yīng)用前景的水產(chǎn)品保鮮劑，后續(xù)研究可考慮探究沒食子酸在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用。