胡 伊 于泓鵬 吳克剛 劉曉麗

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院， 廣東 廣州 510000)

牡丹籽中含有7%～8%的油脂、9.9%的淀粉、20.35%的蛋白質(zhì)和多種生物活性物質(zhì)，尤其是不飽和脂肪酸含量較高[1]。2011年，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布《關(guān)于批準(zhǔn)元寶楓籽油和牡丹籽油作為新資源食品的公告》，將牡丹籽列為新資源食品[2]。牡丹籽粕是牡丹籽經(jīng)壓榨取油后的一種副產(chǎn)品，年產(chǎn)量達(dá)2.25萬t[3]，但大部分都被廢棄。牡丹籽粕不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、8種必需氨基酸、不飽和脂肪酸和亞麻酸[4]，還含有多糖、多酚、VE、植物甾醇、黃酮等抗氧化活性成分[5]，可開發(fā)成食品、藥品等。牡丹籽粕中富有微生物生長代謝的碳源，可作為微生物培養(yǎng)基物的來源，生產(chǎn)相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品。宋王婷等[6]利用牡丹籽粕和白酒曲研制開發(fā)出一種具有特殊風(fēng)味的牡丹籽酒。李杰[7]采用牡丹籽粕或辣木籽粕為主要原料制成一種具有抗氧化、降血壓等功能的牡丹辣木醬油。利用牡丹籽粕釀造醬油，即以牡丹籽粕全替代大豆或豆粕，并輔以面粉和麩皮經(jīng)制曲和發(fā)酵而成的一種新型液態(tài)調(diào)味品，不僅營養(yǎng)豐富，還具有典型的醬油風(fēng)味和獨特的香氣及滋味。目前，相關(guān)的研究主要集中在釀造工藝條件的優(yōu)化上，對其品質(zhì)分析和功能性的研究尚未見報道。

試驗擬以提取油脂后的牡丹籽粕為原料，優(yōu)化其醬油發(fā)酵工藝，并研究牡丹籽粕醬油的抗氧化活性，旨在為提高牡丹籽粕的資源利用和精深化發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牡丹籽粕大曲：牡丹籽粕與麥麩以8∶2的比例制得，自制；

醬油品牌S1、醬油品牌S2：市售；

氫氧化鈉、甲醛、無水乙醇、濃硫酸、鹽酸、冰乙酸、六水三氯化鐵、硫酸亞鐵、無水醋酸鈉：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱：LRH型，上海恒科學(xué)儀器有限公司；

pH計：PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

恒溫振蕩器：SHA-BA型，常州澳華儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：FC型，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗設(shè)計

(1) 發(fā)酵溫度：準(zhǔn)確稱取300 g成曲分裝于3個錐形瓶中，按料液比1∶1.5 (g/mL)加入11%鹽水，恒溫發(fā)酵20 d，考察發(fā)酵溫度(30，35，40，45，50 ℃)對牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮和可溶性無鹽固形物的影響。

(2) 發(fā)酵時間：稱取300 g成曲分裝于3個錐形瓶中，按料液比1∶1.5 (g/mL)加入11%鹽水，45 ℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，考察發(fā)酵時間(15，20，25，30，35 d)對牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮和可溶性無鹽固形物的影響。

(3) 鹽水濃度：稱取300 g成曲分裝于3個錐形瓶中，按料液比1∶1.5 (g/mL)加入鹽水，45 ℃恒溫發(fā)酵20 d，考察鹽水濃度(7%，9%，11%，13%，15%)對牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮和可溶性無鹽固形物的影響。

1.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、鹽水濃度為自變量，以氨基態(tài)氮含量為評價指標(biāo)，根據(jù)Box-Benheken中心組合設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗優(yōu)化醬油發(fā)酵工藝條件。

1.3.3 滅菌工藝對牡丹籽粕醬油抗氧化能力的影響 取10 mL牡丹籽粕生醬油按表1進(jìn)行滅菌，測定滅菌后醬油的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力及鐵離子還原力，并與兩種市售醬油進(jìn)行比較。以生醬油為對照。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 氨基態(tài)氮 按GB 18186—2000執(zhí)行。

表1 滅菌工藝

1.3.2 可溶性無鹽固形物 按GB 18186—2000執(zhí)行。

1.3.3 DPPH·清除能力 參照Brand-Williams等[8]的方法。用無水乙醇配制濃度為0.20 mmol/L的DPPH醇溶液和6.25 g/L的Trolox溶液。將醬油稀釋10倍，取2 mL待測液加至2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中，混勻，室溫避光反應(yīng)60 min，測定517 nm處吸光度值。取2 mL一系列梯度的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液，加至2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中，混勻，室溫避光反應(yīng)60 min，測定517 nm處吸光度值。按式(1)計算DPPH·清除率。

(1)

式中：

SCR——DPPH·清除率，%；

Ac——對照溶液吸光度值；

As——樣品溶液吸光度值；

Ab——空白吸光度值。

1.3.4 ABTS+·清除能力 參照Siddhuraju[9]的方法。配置0.625 g/L的Trolox母液、ABTS儲備液、ABTS工作液(用20 mmol/L、pH 4.5醋酸緩沖溶液按適當(dāng)比例稀釋ABTS儲備液，使A734 nm為(0.7±0.02)，以此得到ABTS+工作液)。將醬油稀釋10倍，取樣品提取液500 μL加至5 mL ABTS+·工作液中，混勻，避光反應(yīng)6 min，測定734 nm處吸光值。將500 μL 50%的乙醇代替樣品做空白對照。取500 μL一系列梯度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，加至5 mL ABTS+·工作液中，混勻，避光反應(yīng)6 min，測定734 nm處吸光值。按式(2)計算ABTS+·清除率。

(2)

式中：

C——ABTS+·清除率，%；

A1——樣品溶液吸光度值；

A0——空白對照溶液吸光度值。

1.3.5 鐵離子還原力 參照Benzie等[10]的方法。將0.3 mol/L 醋酸—醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)、0.01 mol/L TPTZ溶液、0.02 mol/L FeCl3溶液按體積比10∶1∶1混勻，配制6.25 g/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。將醬油稀釋10倍，取樣品提取液200 μL加至2.8 mL Fe3+-TPTZ試劑中，混勻，37 ℃水浴60 min，測定593 nm處吸光值，用去離子水代替樣品提取液作空白對照。以FeSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)品繪制曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次取平均值，采用Origin 2017軟件繪圖，采用Design-expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1可知，牡丹籽粕醬油中氨基態(tài)氮含量隨發(fā)酵溫度的升高先增加后降低，當(dāng)發(fā)酵溫度為45 ℃時達(dá)最大值。研究表明低溫下肽酶的作用時間大于高溫，說明低溫有利于酶活的保存[11]，高溫下蛋白酶活力會降低甚至失活[12]，同時高溫促進(jìn)了氨基酸和戊糖之間的美拉德反應(yīng)，消耗了氨基酸[13]。氨基態(tài)氮含量隨發(fā)酵時間的增加而減少，是由于發(fā)酵后期酶活力下降，基本不生成氨基態(tài)氮，同時酵母菌與耐鹽乳酸菌繁殖以及美拉德反應(yīng)會消耗部分氨基態(tài)氮[14]；當(dāng)發(fā)酵15 d時，可溶性無鹽固形物含量為9.34 g/100 mL，達(dá)不到低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的標(biāo)準(zhǔn)(≥10 g/100 mL)，故選擇最佳發(fā)酵時間為20 d。氨基態(tài)氮含量隨鹽水濃度的增加先上升后下降，當(dāng)鹽水濃度為11%時達(dá)最大值，氨基態(tài)氮含量下降是因為食鹽含量增加，酶活力受抑制，降低了對蛋白質(zhì)的分解能力[15]。綜上，牡丹籽粕低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的最適溫度為45 ℃、發(fā)酵時間為20 d、最適鹽水濃度為11%。

圖1 各因素對牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮和可溶性無鹽固形物含量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

2.2.1 試驗設(shè)計與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以氨基態(tài)氮含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，試驗因素水平表見表2，試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表2 試驗因素水平表

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量(Y)為響應(yīng)值的二次多項回歸方程：

Y=0.60+0.030A+0.018B-0.030C-0.015AB+0.010AC+0.000BC-0.024A2-0.059B2-0.029C2。

(3)

為檢驗回歸方程中各因素對牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量的影響程度及有效性，對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸模型方差分析?

2.2.2 試驗因素間的交互作用 由圖2可知，發(fā)酵溫度與鹽水濃度之間的交互作用顯著，其次依次為發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間、鹽水濃度與發(fā)酵時間之間的相互作用。通過響應(yīng)面的陡峭程度可以看出，發(fā)酵溫度影響最大，發(fā)酵時間的影響大于鹽水濃度，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 各因素交互作用對牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量的影響

2.2.3 驗證實驗 根據(jù)所建立的模型得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度45.42 ℃、鹽水濃度12.02%、發(fā)酵時間17.86 d，此時醬油的實測氨基態(tài)氮含量預(yù)測值為0.623 g/100 mL。為檢驗響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，對最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行驗證實驗(n=3)，根據(jù)實際操作情況，將驗證條件修正為發(fā)酵溫度45.5 ℃、鹽水濃度12%、發(fā)酵時間18 d，此時醬油的實測氨基態(tài)氮含量為0.616 g/100 mL，與預(yù)測值基本一致，證明用所建模型預(yù)測牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量是準(zhǔn)確可行的。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH·清除能力 由圖3可知，不同滅菌工藝的牡丹籽粕醬油的DPPH·清除能力不同。經(jīng)滅菌處理后的牡丹籽粕醬油的DPPH·清除能力高于牡丹籽粕生醬油，可能是滅菌過程中生成了一些抗氧化物質(zhì)，如多肽、氨基酸、類黑精和醛酮類風(fēng)味物質(zhì)[17]。牡丹籽粕生醬油的DPPH·清除能力高于市售品牌大豆醬油S2，與市售品牌大豆醬油S1的清除能力一致，且經(jīng)滅菌后的牡丹籽粕醬油DPPH·清除能力高于市售的兩種大豆醬油。表明牡丹籽粕醬油具有很強的DPPH·清除能力。

圖3 醬油DPPH·清除能力

2.3.2 鐵離子還原力 由圖4可知，滅菌工藝對牡丹籽粕醬油還原力有一定影響，高溫高壓滅菌條件下牡丹籽粕醬油還原力較生醬油的提高了85.6%。恒溫水浴、煮沸滅菌、巴氏滅菌條件下，牡丹籽粕醬油還原力較生醬油分別降低了10.8%，0.3%，3.0%，且這3種滅菌處理前后的還原力差異不明顯，說明高溫高壓滅菌對牡丹籽粕醬油鐵離子還原力有提高作用。高溫高壓滅菌工藝下的牡丹籽粕醬油(FRAP值為1.30 mmol/L)的抗氧化能力高于市售品牌醬油S1的，表明高溫高壓滅菌條件下的牡丹籽粕醬油抗氧化能力較強。

圖4 醬油的鐵離子還原力

2.3.3 ABTS+·清除能力 由圖5可知，醬油對ABTS+·有一定的清除能力。高溫高壓滅菌的牡丹籽粕醬油的ABTS+·清除率(26.41%)最強，高于牡丹籽粕生醬油和市售品牌醬油S1。另一方面，高溫高壓滅菌的牡丹籽粕醬油的TEAC值為79.90 mmol Trolox/mL，抗壞血酸的為283.48 mmol Trolox/mg，表明3 μL醬油樣品的ABTS+·清除能力相當(dāng)于1 μg抗壞血酸的，說明牡丹籽粕醬油具有較強的抗氧化能力。

圖5 醬油的ABTS+·清除能力

3 結(jié)論

試驗表明，牡丹籽粕醬油的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度45.5 ℃、發(fā)酵時間18 d、鹽水濃度12%，此時牡丹籽粕醬油氨基態(tài)氮含量為0.616 g/100 mL。體外抗氧化活性表明，經(jīng)高溫高壓滅菌的牡丹籽粕醬油的DPPH·清除能力、鐵離子還原力及ABTS+·清除能力都高于牡丹籽粕生醬油，且高溫高壓滅菌的牡丹籽粕醬油的DPPH·清除能力高于兩種市售大豆醬油S1、S2，表明高溫高壓滅菌下的牡丹籽粕醬油具有較好的抗氧化能力。試驗僅涉及牡丹籽粕低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的抗氧化性，并未研究其具體的抗氧化物質(zhì)。因此，分離鑒別牡丹籽粕醬油具體的以及特有的抗氧化物質(zhì)是后續(xù)研究的重點。