神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine neoplasm，NE?Ns）是一種起源于彌漫性神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的異質(zhì)性腫瘤。胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（gastroenteropancreat?ic neuroendocrine neoplasms，GEP-NENs）是一類(lèi)發(fā)病率最高的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[1]。根據(jù)胚胎來(lái)源，可將GEP-NENs 分為前腸（胃十二指腸和胰腺）、中腸（空腸、回腸、盲腸和闌尾）和后腸（遠(yuǎn)端結(jié)腸和直腸）腫瘤。目前，GEP-NENs的診斷主要依靠組織活檢技術(shù)及影像學(xué)檢查。但現(xiàn)行的組織活檢技術(shù)在GEP-NENs中存在許多局限，如：無(wú)法對(duì)特殊部位進(jìn)行組織活檢，反復(fù)取樣活檢對(duì)患者創(chuàng)傷較大，腫瘤異質(zhì)性較大，單個(gè)轉(zhuǎn)移部位的活檢結(jié)果無(wú)法反映腫瘤整體特點(diǎn)。此外，組織活檢很難對(duì)患者病情進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。而影像學(xué)檢測(cè)手段仍然以?xún)?nèi)鏡、CT、MRI 結(jié)合18F-PET/CT為主，導(dǎo)致大部分患者缺乏對(duì)生長(zhǎng)抑素受體的檢測(cè)并暴露于輻射中，同時(shí)影像學(xué)手段不易發(fā)現(xiàn)隱匿性轉(zhuǎn)移灶或術(shù)后微小殘留灶。因此開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于GEP-NENs診斷勢(shì)在必行。

液體活檢是一種快速、方便、無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于可以通過(guò)非侵入性的方法獲取患者的血液、尿液和糞便等樣本進(jìn)行診斷，并且能實(shí)時(shí)、精準(zhǔn)地反應(yīng)患者的整體情況。目前液體活檢常用的檢測(cè)樣本為患者的血液，主要的檢測(cè)物包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤RNA（包括NETest及microRNA）和循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulat?ing tumor cells，CTCs）[2]。本文就GEP-NENs 診斷手段中傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的局限及液體活檢技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的局限

神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和GEP-NENs 可向循環(huán)系統(tǒng)中分泌肽、胺和其他分子，這些分子可作為生物標(biāo)志物用于疾病診斷和病情監(jiān)測(cè)。其中非特異性循環(huán)腫瘤標(biāo)志物包括嗜鉻粒蛋白A（chromogranin，CgA）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）等。但受某些疾病及藥物影響，其敏感性和特異性均不高。CgA的靈敏度在32%～92%之間，特異性在50%以下[3]。NSE 敏感性?xún)H39%～43%，特異性?xún)H65%～73%。因此僅能用作輔助診斷，不能單獨(dú)作為診斷和評(píng)價(jià)療效的指標(biāo)。特異性循環(huán)腫瘤標(biāo)志物包括5-羥基吲哚乙酸、胰島素、胃泌素、血管活性腸肽、促腎上皮質(zhì)激素、甲狀旁腺激素和生長(zhǎng)激素釋放激素等。相比于非特異性循環(huán)腫瘤標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物的特異性稍高，但由于GEP-NENs的臨床癥狀缺乏特異性，不能僅憑單一循環(huán)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行診斷，往往需要協(xié)同影像學(xué)及組織活檢等手段進(jìn)行診斷。因此，若能探索新的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物以輔助診斷和治療，將為GEP-NENs患者帶來(lái)極大獲益。

2 ctDNA在GEP-NENs中的應(yīng)用

2.1 ctDNA的概述

ctDNA 在1948年首次被描述，主要由凋亡或壞死的細(xì)胞在血液中所釋放的短核酸片段組成[4]。研究表明ctDNA應(yīng)用廣泛，如腫瘤診斷、微創(chuàng)分子分析、治療監(jiān)測(cè)、殘留疾病檢測(cè)和耐藥突變識(shí)別。檢測(cè)ctD?NA的技術(shù)主要包括1999年起提出的數(shù)字PCR（dP?CR）[5]、液滴數(shù)字PCR（ddPCR）[6]以及聯(lián)合流式技術(shù)及dPCR 技術(shù)的乳液微滴數(shù)字分析技術(shù)（BEAM?ing）[7]。2012年起隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，定向測(cè)序方法如標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序技術(shù)、全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序及下一代基因測(cè)序技術(shù)成為檢測(cè)ctDNA的主要手段[8]。

2.2 ctDNA能夠提高診斷的準(zhǔn)確性

目前對(duì)于GEP-NENs 中ctDNA的研究主要集中于識(shí)別ctDNA中的突變基因或轉(zhuǎn)錄譜，以提高診斷的準(zhǔn)確性。Boons等[9]在1例依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2010 標(biāo)準(zhǔn)被定義為G3級(jí)患者的血液和組織中均檢測(cè)到了DAXX 的缺失，依據(jù)WHO2017 重新修訂的標(biāo)準(zhǔn)，該患者經(jīng)病理證實(shí)被定義為分化良好的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤（neuroendocrine tumor，NET），這說(shuō)明基于液體活檢檢測(cè)同樣可以對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）和分化良好的G3 NET患者進(jìn)行更好的劃分。2016年歐洲神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤學(xué)會(huì)（ENETS）大會(huì)上有報(bào)道提出，利用全外顯子組測(cè)序可以在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrineneo?plasm，pNENs）患者的血液中檢測(cè)到ctDNA的突變，且與組織學(xué)檢測(cè)到的突變一致[10]。目前針對(duì)pNENs分子研究中發(fā)現(xiàn)的突變基因除了DAXX 外還包括MEN1和ATRX[11]。針對(duì)小腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（small intestinal neuroendocrine neoplasm，siNENs）的研究中發(fā)現(xiàn)8%的患者發(fā)生CDKN1B突變[12]。盡管目前有關(guān)ctDNA 在GEP-NENs 診斷方面的研究取得了一定的成果，但大多數(shù)研究仍處于初級(jí)階段，缺乏大數(shù)據(jù)驗(yàn)證及理論支持，仍需高質(zhì)量研究以增加其可信度。

2.3 ctDNA能夠指導(dǎo)治療并實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

傳統(tǒng)組織活檢的并發(fā)癥發(fā)生率較高，且往往難以獲得足夠的組織材料用于基因組分析（失敗率為10%～30%）。反復(fù)及多部位穿刺為患者帶來(lái)了身心壓力及經(jīng)濟(jì)損失，為疾病的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)造成了障礙。ctDNA具有指導(dǎo)治療并實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的作用，但目前的研究主要為個(gè)案報(bào)導(dǎo)。Wang等[13]利用ctDNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1例轉(zhuǎn)移性非典型性類(lèi)癌患者中存在ALK異位，在使用ALK抑制劑阿來(lái)替尼后患者腫瘤持續(xù)縮小。Klempner 等[14]在1例直腸神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者的尿液中檢測(cè)到了BRAF V600E突變，且該患者在使用BRAF/MEK抑制劑后，癥狀得到明顯的改善。除了對(duì)ctDNA的研究，Boons 等[9]對(duì)10例pNENs 患者的腫瘤特異性無(wú)細(xì)胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）進(jìn)行檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移患者中，腫瘤組織的拷貝數(shù)變異分布與cfDNA顯著相關(guān)，因此cfDNA可能與患者的預(yù)后相關(guān)。檢測(cè)血液中DNA甲基化的研究仍然在探索中。

ctDNA的檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、取材方便等優(yōu)勢(shì)，為不能進(jìn)行腫瘤活檢的患者提供檢測(cè)機(jī)會(huì)。同時(shí)隨著檢測(cè)技術(shù)的提高，其準(zhǔn)確性也得到驗(yàn)證，為替代重復(fù)有創(chuàng)活檢以實(shí)現(xiàn)病情動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了可能。但ctDNA的檢測(cè)需要大量的腫瘤DNA釋放和腫瘤相關(guān)突變的存在，這導(dǎo)致了NENs患者檢測(cè)的局限性。因此目前針對(duì)ctDNA 在GEP-NENs 應(yīng)用的探索仍然集中于發(fā)現(xiàn)新的突變基因，尚缺乏統(tǒng)一的定量標(biāo)準(zhǔn)，且檢測(cè)成本過(guò)高以至于在一定時(shí)間內(nèi)難以在臨床實(shí)踐中推廣。因此開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)，尋找新的突變基因，統(tǒng)一定量標(biāo)準(zhǔn)，降低檢測(cè)成本是未來(lái)需要研究探索的方向。

3 ctRNA在GEP-NENs中的應(yīng)用

3.1 NETest在GEP-NENs診斷中的意義

除了避免多次活檢，在臨床實(shí)踐中還需考慮如何早診斷“隱匿”部位的原發(fā)腫瘤，以及生長(zhǎng)抑素受體低表達(dá)所致的影像學(xué)不易識(shí)別的微小肝轉(zhuǎn)移灶。因此除了對(duì)影像學(xué)技術(shù)的開(kāi)發(fā)，NETest是目前較有前景的檢測(cè)手段，其通過(guò)對(duì)2個(gè)GEP-NENs的微陣列數(shù)據(jù)集和1個(gè)包含正常腫瘤組織以及其他癌組織的微陣列數(shù)據(jù)集進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作，排除正常組織基因及與其他癌種相同的基因，最終可在外周血中檢測(cè)到51個(gè)針對(duì)NENs 的候選基因。目前的檢測(cè)方法是從全血中分離mRNA，利用PCR 檢測(cè)cDNA的產(chǎn)生[15]。51個(gè)轉(zhuǎn)錄本被列入NETest 中[16-17]，最終結(jié)果用NE?Test 得分（0～100 分）表示[18-19]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：≤20 分診斷為正常，21～40 分診斷為疾病穩(wěn)定，41～100 分診斷為進(jìn)行性發(fā)病[20-22]。在GEP-NENs患者的診斷中，NETest 的敏感性和特異性均＞90%，較CgA和胰抑素顯示出了良好的優(yōu)越性[17]。同時(shí)也為GEP-NENs 特別是siNENs這種隱匿部位的早診帶來(lái)了機(jī)遇。

3.2 NETest相較于影像學(xué)的優(yōu)勢(shì)

NETest 具有極高的敏感性，能識(shí)別所有類(lèi)型的NENs。在確診陽(yáng)性的患者中，相較于68Ga-SSA PET/CT，NETest 診斷的準(zhǔn)確性達(dá)到98%，說(shuō)明NETests 可能具有生長(zhǎng)抑素成像的輔助價(jià)值[23]。一項(xiàng)來(lái)自美國(guó)的真實(shí)世界研究（NCT02270567）證明NETest可以預(yù)測(cè)患者對(duì)生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物（somatostatin analogues，SSA）治療的療效，準(zhǔn)確性達(dá)到100%，可減少50%影像檢查的使用[21，23]，同時(shí)還可以對(duì)使用SSA的患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。此外，NETest可以檢測(cè)到影像學(xué)或單個(gè)生物標(biāo)記無(wú)法檢測(cè)到，但經(jīng)組織學(xué)證實(shí)的隱匿性肝轉(zhuǎn)移疾病[24]。這彌補(bǔ)了影像學(xué)檢查的不足，證明NETest 具有早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶和術(shù)后殘留灶的優(yōu)勢(shì)。Laskaratos 等[25]對(duì)34例接受原發(fā)部位手術(shù)的siNENs患者腸系膜纖維化（mesenteric fibrosis，MF）進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示NETest-纖維小體對(duì)顯微鏡下MF 的檢測(cè)準(zhǔn)確率為100%。因此NETest 對(duì)于放射學(xué)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)圖像陰性的MF 患者是一種有前途的非侵入性生物標(biāo)志物。

3.3 NETest對(duì)于預(yù)后的判斷

NETest也可以判斷腫瘤活性從而判斷療效及預(yù)后。依據(jù)NETest可將腫瘤活性分為低、中、高三種類(lèi)型，其中低活性組評(píng)分≤40分，中活性組評(píng)分41～79分，高活性組評(píng)分80～100分。真實(shí)世界研究（NCT02270567）中納入100例患者，其中68%為GEP-NENs，該研究對(duì)患者進(jìn)行了為期6～12個(gè)月的隨訪，結(jié)果顯示腫瘤活性低的患者可能獲得更好的療效和預(yù)后[20-23]。多肽受體介導(dǎo)的放射性核素治療（peptide receptor radionuclide therapy，PRRT）一般被用于治療轉(zhuǎn)移性或者不可手術(shù)的患者，研究證明NETest還可被用于評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)對(duì)PRRT治療的反應(yīng)[24]。一項(xiàng)納入35例pNENs及siNENs患者的NETest檢測(cè)結(jié)果顯示術(shù)前所有患者的NETest均升高，而CgA升高的僅14例。并且術(shù)后NETest有下降趨勢(shì)：從（80±5）分降至（29±5）分（P＜0.0001），術(shù)后NETest數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)顯示R0切除的患者中有4例回升，且6個(gè)月后經(jīng)影像學(xué)證實(shí)為復(fù)發(fā)[26]。一項(xiàng)研究對(duì)13例接受原發(fā)性腫瘤和/或腸系膜腫塊手術(shù)切除的siNENs患者，進(jìn)行術(shù)前術(shù)后的NETest和CgA的監(jiān)測(cè)并與影像學(xué)檢查進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示siNENs患者經(jīng)根治性手術(shù)治療后NETest評(píng)分明顯降低，即NETest評(píng)分能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)siNENs患者的手術(shù)療效，且術(shù)后監(jiān)測(cè)NETest可以識(shí)別腫瘤殘留并及早發(fā)現(xiàn)病情進(jìn)展[27]。

NETest是目前最具前景的循環(huán)標(biāo)志物之一，在診斷中具有早期診斷及發(fā)現(xiàn)隱匿病灶的優(yōu)勢(shì)，在治療方面能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)藥物療效和實(shí)現(xiàn)病情動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，同時(shí)能對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行判斷。但是由于其成本較高導(dǎo)致了其臨床應(yīng)用的局限性，且其實(shí)際應(yīng)用仍需大樣本數(shù)據(jù)的評(píng)估。因此，如何提高檢測(cè)技術(shù)，降低檢測(cè)成本是NETest未來(lái)發(fā)展的方向。

3.4 microRNA在GEP-NENs中的應(yīng)用

microRNA是一種非編碼性小RNA，長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸，可與mRNA的3'UTR 進(jìn)行特異性相互作用，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。目前多項(xiàng)研究探索microRNA在GEP-NENs中的應(yīng)用。miR-140和miR-21 在pNENs 中高表達(dá)，同時(shí)miR-21 的表達(dá)與Ki67 指數(shù)和肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以通過(guò)靶向PDCD4調(diào)節(jié)腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[28]。在siNENs 中miR-96、miR-182、miR-183、miR196a、miR-200a 等均為高表達(dá)[29]。高表達(dá)的miR-196與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高有絲分裂計(jì)數(shù)、高Ki67 指數(shù)、總生存期（overall survival，OS）和無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS）降低顯著相關(guān)[30]。此外，部分microRNA的表達(dá)下調(diào)也提示腫瘤可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，例如miR-133a、miR-1和miR-143-3p 與轉(zhuǎn)移相關(guān)。盡管上述多項(xiàng)研究證實(shí)microRNA能夠調(diào)節(jié)GEP-NENs的增殖轉(zhuǎn)移，但是目前對(duì)于循環(huán)microRNA的檢測(cè)缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且患者個(gè)體差異較大，因此有待繼續(xù)研究[31]。

4 CTCs在GEP-NENs中的應(yīng)用

絕大部分CTCs 的表面存在上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM），Cell?Search 平臺(tái)可通過(guò)對(duì)EpCAM 的富集來(lái)檢測(cè)并計(jì)數(shù)CTCs。Khan等[32]在2011年首次證實(shí)了NENs中存在EpCAM 的表達(dá)，并將CTCs 描述為NENs 的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物。CTCs 雖然與腫瘤有直接關(guān)系，但因研究技術(shù)的局限性相關(guān)報(bào)道較少。有研究表明CTCs來(lái)源于原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性疾病部位，通常與疾病進(jìn)展相關(guān)。同時(shí)，研究顯示在G1、G2 期NENs 中，CTCs 的存在與腫瘤負(fù)荷增加及CgA升高有關(guān)，并且與較低的無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）和OS 相關(guān)[33]。此外，CTCs 計(jì)數(shù)可對(duì)患者的治療療效進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。一項(xiàng)對(duì)138例NENs 轉(zhuǎn)移患者的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)CTCs的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有助于預(yù)測(cè)患者總生存和對(duì)于治療的反應(yīng)性。相較于治療前的基線(xiàn)檢測(cè)，治療后CTCs降低50%以上或者檢測(cè)不到代表患者的預(yù)后更好[33]。此外，CTCs 與生長(zhǎng)抑素受體和骨轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系仍在探索。研究發(fā)現(xiàn)CTCs的存在與GEP-NETs骨轉(zhuǎn)移相關(guān)[34]。但CTCs 的敏感性較差，通過(guò)Cell?Search平臺(tái)搜索顯示，中腸NENs和胰腺NENs患者中CTCs檢出率分別為43%和21%[35]。

綜上所述，CTCs敏感性和特異性較差，因此目前研究仍?xún)H限于患者療效的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及預(yù)后的判斷，其診斷方面的研究仍需探索。目前多項(xiàng)研究證實(shí)在GEP-NENs中，液體活檢技術(shù)可能是未來(lái)最具潛力的診斷手段，但距離臨床應(yīng)用尚面臨一定的挑戰(zhàn)，其優(yōu)勢(shì)和局限見(jiàn)表1。

表1 液體活檢技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與局限

5 結(jié)語(yǔ)

GEP-NENs 的傳統(tǒng)診斷方法主要為組織病理學(xué)檢查和影像學(xué)檢查。新興診斷方法如液體活檢的應(yīng)用彌補(bǔ)了組織活檢和影像學(xué)反復(fù)取樣及漏診隱匿病灶等不足。液體活檢除用于疾病診斷外，還可用于疾病監(jiān)測(cè)及療效判斷。ctDNA、NETest、microRNA和CTCs是目前研究的熱點(diǎn)標(biāo)志物。其能從更宏觀的角度評(píng)價(jià)患者的整體情況，相較于組織學(xué)和影像學(xué)更加精準(zhǔn)、方便，為實(shí)現(xiàn)GEP-NENs 患者的個(gè)體化診療提供了新的機(jī)遇。但由于檢測(cè)手段的限制以及缺乏大樣本數(shù)據(jù)支持，其臨床實(shí)際應(yīng)用仍具有局限性。對(duì)于未來(lái)液體活檢的探索應(yīng)該結(jié)合多學(xué)科多角度，積極尋找新的生物標(biāo)志物，增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度，提高檢測(cè)技術(shù)，降低檢測(cè)成本，實(shí)現(xiàn)集早診、治療指導(dǎo)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)為一體的診療技術(shù)。