賀茂芳*，張 博，胡婭琪，唐一梅，張育珍

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，西安醫(yī)學(xué)院藥物研究所，陜西西安 710021)

碳納米管(Carbon Nanotubes，CNTs)是由石墨片曲卷形成的一種無(wú)縫納米管，包括單壁碳納米管(Single-wall Carbon Nanotubes,SWCNTs)和多壁碳納米管(Multi-wall Carbon Nanotubes,MWCNTs)。CNTs不僅具有高模量、高強(qiáng)度、導(dǎo)電性好、比表面積大、表面易修飾等優(yōu)點(diǎn)，而且具有較強(qiáng)的吸附活性[1]。因此，CNTs被廣泛應(yīng)用于分析科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，如生物、環(huán)境樣品前處理[2 - 4]，生物傳感器[5,6]，蛋白質(zhì)、DNA和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體等[7,8]。

CNTs作為固相萃取吸附劑是其重要應(yīng)用之一。CNTs具有較強(qiáng)的疏水性能，其表面的大π鍵能與具有共軛結(jié)構(gòu)的分子以非共價(jià)鍵結(jié)合，從而產(chǎn)生吸附活性。同時(shí)，CNTs的比表面積高達(dá)3 000 m2/g,此外，其制備工藝成熟，直徑和長(zhǎng)度可控且表面易修飾[9,10]。因此，CNTs被作為吸附劑廣泛應(yīng)用于生物、環(huán)境樣品前處理中。例如，尿液中β2-agonists的固相分散微萃取[11]、血清中血紅蛋白的分離富集[12]、水樣中多環(huán)芳烴的固相分散微萃取[13]等。然而，由于CNTs的尺寸小、疏水性強(qiáng)，CNTs在水溶液中的分散性差、易團(tuán)聚，而且通過(guò)傳統(tǒng)的離心、過(guò)濾等方法難以實(shí)現(xiàn)液固分離。同時(shí)，CNTs通過(guò)范德華力、疏水作用力等與生物分子相互作用，導(dǎo)致其選擇性差，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的特異性識(shí)別，極大地限制了CNTs在生物分離方面的應(yīng)用[14]。

將CNTs負(fù)載在剛性基質(zhì)表面同時(shí)進(jìn)行親水改性是解決這一問(wèn)題的有效途徑。例如，周等[12]采用層層組裝法將羧基化MWCNTs固定在石英棉上，建立了在線(xiàn)固相萃取堿性蛋白質(zhì)的方法。Du等[15]將MWCNTs鍵合在SiO2表面，再包覆聚合物，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞色素c的分離富集。將CNTs與Fe3O4磁性納米粒子復(fù)合，制得的磁性碳納米管具有分散性好、比表面積大、吸附性能好、易于實(shí)現(xiàn)液固分離等優(yōu)點(diǎn)，是一種應(yīng)用前景十分廣泛的納米載體[16]。因此，本研究首先制備了磁性多壁碳納米管(Magnetic Multi-wall Carbon Nanotubes，mMWCNTs)，然后通過(guò)靜電自組裝法將親水聚合物聚丙烯酸(Polyacrylic Acid，PAA)修飾在其表面。經(jīng)過(guò)PAA修飾的mMWCNTs(Fe3O4@MWCNTs@PAA)在pH=6.0的緩沖液中表現(xiàn)出陽(yáng)離子交換性能，對(duì)堿性蛋白質(zhì)具有較高的吸附容量和選擇性。最終，F(xiàn)e3O4@MWCNTs@PAA成功應(yīng)用于雞蛋清中溶菌酶(Lys)的分離純化，獲得了較高的純度。本文的研究成果為CNTs的表面改性提供了新途徑，拓寬了CNTs在生物分離方面的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary 60紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)，安捷倫公司)；SB-5200DT型超聲清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TENSOR 27傅立葉紅外光譜儀(德國(guó)，布魯克公司)；H-7650透射電子顯微鏡(日本，Hitachi)；K-Alpha X射線(xiàn)光電子能譜儀(美國(guó)，Thermo Fisher)；TS-211BQ型恒溫振蕩器(上海島析實(shí)業(yè)有限公司)；100 mL高壓反應(yīng)釜(天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)；JJ-1型增壓電動(dòng)攪拌器(上海司樂(lè)有限公司)。

FeCl3(分析純，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)，乙二醇(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，氨基化多壁碳納米管(長(zhǎng)度50 μm，外徑8～15 nm，江蘇先豐納米材料科技有限公司)，聚丙烯酸(PAA，分析純，上海麥克林生物試劑有限公司)，Lys(>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，卵清蛋白(OVA，>98%，Sigma-aldrich)，牛血清白蛋白(BSA，>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 PAA修飾的磁性碳納米管(Fe3O4@MWCNTs@PAA)的制備

1.2.1 磁性碳納米管的制備通過(guò)水熱法制備Fe3O4@MWCNTs，具體合成路線(xiàn)如下：1.4 g FeCl3溶解于75 mL乙二醇和3.6 mL水中，在超聲處理下將0.4 g MWCNTs懸浮于上述溶液中，靜置10 min后再超聲處理10 min，再加入3.6 g NaAc，在室溫下攪拌30 min，最后將所得混合物轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中加熱至200 ℃反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，依次用水和醇交替洗滌合成產(chǎn)物3次，將得到的固體在40 ℃下真空干燥6 h，即得Fe3O4@MWCNTs。

1.2.2 PAA修飾磁性碳納米管將2 g的PAA溶解于50 mL 0.1 mol/mL的pH=7.0磷酸鹽緩沖液，再加入0.5 g Fe3O4@MWCNTs，超聲使其分散均勻，然后常溫下機(jī)械攪拌反應(yīng)12 h，將產(chǎn)物依次用水和醇交替洗滌3次，最后在50 ℃下真空干燥6 h，即得到Fe3O4@MWCNTs@PAA。

1.3 Fe3O4@MWCNTs@PAA對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能研究

1.3.1 吸附方法及吸附容量的計(jì)算稱(chēng)取10.0 mg Fe3O4@MWCNTs@PAA于10 mL離心管中，加入5.0 mL蛋白質(zhì)溶液，超聲分散1 min，然后于25 ℃、200 r/min的恒溫振蕩器中反應(yīng)2 h，最后用強(qiáng)磁鐵將Fe3O4@MWCNTs@PAA吸在管壁，收集吸附后的蛋白質(zhì)溶液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定λ=280 nm處的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法算吸附后蛋白質(zhì)溶液的濃度(ce，mg/mL)，并計(jì)算吸附容量(Q):

(1)

式中，Q為吸附容量(μg/mg)，c0為吸附前蛋白質(zhì)溶液的初始濃度(mg/mL)，ce為吸附后蛋白質(zhì)溶液的平衡濃度(mg/mL)，V0為蛋白質(zhì)溶液的體積(mL)，m為吸附劑的質(zhì)量(mg)。

1.3.2 吸附時(shí)間的影響稱(chēng)取10.0 mg Fe3O4@MWCNTs@PAA于10 mL離心管中，向其中加入5.0 mL濃度為0.5 mg/mL 的蛋白溶液(用pH=7.0的磷酸鹽緩沖液配制)，設(shè)定吸附時(shí)間為5 min、10 min、20 min、40 min、60 min、120 min(平行三份)，吸附結(jié)束后，測(cè)定不同時(shí)間的吸附容量。

1.3.3 pH的影響稱(chēng)取10.0 mg Fe3O4@MWCNTs@PAA于10 mL離心管中，向其中加入5.0 mL濃度為0.5 mg/mL蛋白溶液(分別用pH=5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液配制)，設(shè)定吸附時(shí)間為120 min(平行三份)，吸附結(jié)束后，測(cè)定不同pH時(shí)的吸附容量。

1.3.4 靜態(tài)等溫吸附線(xiàn)在最佳的吸附時(shí)間和緩沖液pH的條件下，將10.0 mg Fe3O4@MWCNTs@-PAA分散于濃度為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL蛋白溶液中(每種濃度三份平行)，吸附結(jié)束后，測(cè)定吸附容量。以吸附容量Q對(duì)ce作圖，繪制靜態(tài)等溫吸附線(xiàn)，并利用Langmuir方程對(duì)吸附等溫線(xiàn)進(jìn)行擬合，以計(jì)算飽和吸附容量。

(2)

式中，Q為吸附容量(μg/mg)，c0為蛋白質(zhì)溶液的起始濃度(mg/mL)，ce為吸附平衡時(shí)蛋白質(zhì)溶液的濃度(mg/mL)，Kd是解離常數(shù)(mg/mL)，Qm是飽和吸附容量(μg/mg)。

1.4 Fe3O4@MWCNTs@PAA對(duì)雞蛋清中蛋白質(zhì)的分離

取新鮮的生雞蛋，分離蛋清與蛋黃，取5.0 mL蛋清，向其中加入95 mL pH=6.0的磷酸鹽緩沖液，室溫下攪拌30 min，于4 ℃下10 000 r/min離心15 min，取上層清液作為雞蛋清樣品。

稱(chēng)取100 mg Fe3O4@MWCNTs@PAA加入到3.0 mL雞蛋清樣品中，25 ℃、150 r/min持續(xù)振蕩反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，將Fe3O4@MWCNTs@PAA用pH=6.0的緩沖液2.0 mL依次清洗兩次，最后加入1.0 mL含有0.5 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH=8.0)洗脫6 h。將吸附前的雞蛋清樣品、吸附后的樣品及洗脫液進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@MWCNTs@PAA的制備與表征

如圖1所示，本實(shí)驗(yàn)首先將Fe3O4與氨基化的MWCNTs結(jié)合，使MWCNTs具有磁性；然后通過(guò)靜電吸引力使PAA與MWCNTs表面的氨基結(jié)合，從而將PAA修飾在MWCNTs表面。Fe3O4@MWCNTs表面修飾PAA后，引入大量羧基，有利于提高離子交換容量，因此獲得高吸附容量的離子交換吸附劑。將制得的Fe3O4@MWCNTs@PAA分散在水中，在外加磁場(chǎng)的作用下可迅速實(shí)現(xiàn)液固分離(圖2)，說(shuō)明Fe3O4@MWCNTs@PAA的磁響應(yīng)性好，將其用于磁性分散固相萃取中，操作簡(jiǎn)便，分離效率高。

圖2 Fe3O4@MWCNTs@PAA的分散液未加磁場(chǎng)(A)，加磁場(chǎng)后(B)Fig.2 The suspension of Fe3O4@MWCNTs@PAA without (A) and with (B) a magnetic field

圖1 Fe3O4@MWCNTs@PAA的合成路線(xiàn)示意圖Fig.1 The preparation route of Fe3O4@MWCNTs@PAA

吸附劑紅外光譜如圖3。620 cm-1為Fe-O-Fe的特征吸收峰，證明了Fe3O4的存在；1 650 cm-1為N-H的伸縮振動(dòng)峰，1 053 cm-1為C-N的伸縮振動(dòng)，2 920 cm-1為C-H非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，2 851 cm-1為C-H的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，1 462 cm-1為C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)，證明了氨基化碳納米管的存在。因此，F(xiàn)e3O4@MWCNTs的制備是成功的。自組裝PAA后，由于C=O的吸收峰與N-H的吸收峰重疊，因此未出現(xiàn)新的吸收峰。為了進(jìn)一步驗(yàn)證材料的制備是否成功，我們通過(guò)透射電鏡和X射線(xiàn)光電子能譜對(duì)Fe3O4@MWCNTs和Fe3O4@MWCNTs@PAA進(jìn)一步表征。由透射電鏡圖可以觀察到，F(xiàn)e3O4磁性微球均勻地分散附著在線(xiàn)狀的MWCNTs表面，粒徑約為200 nm(圖4A)；與PAA反應(yīng)后，在MWCNTs表面可以明顯地觀察到聚合物涂層(圖4B)。X射線(xiàn)光電子能譜(圖5)分析顯示，F(xiàn)e3O4@MWCNTs表面的C含量和O含量分別為76.6%和16.7%，和PAA反應(yīng)后，C含量和O含量分別升高至78.2%和18.1%，這一結(jié)果表明PAA成功修飾在Fe3O4@MWCNTs的表面。

圖3 Fe3O4@MWCNTs和Fe3O4@MWCNTs@PAA的紅外光譜圖Fig.3 Fourier transform infrared (FT-IR) spectra of Fe3O4@MWCNTs and Fe3O4@MWCNTs@PAA

圖4 透射電鏡圖。(A)Fe3O4@MWCNTs，放大40 000倍；(B)Fe3O4@MWCNTs@PAA，放大70 000倍Fig.4 Transmission electron microscopy (TEM) images.(A)Fe3O4@MWCNTs with 40 000 amplification;(B) Fe3O4@MWCNTs@PAA with 70 000 amplification

圖5 X射線(xiàn)光電子能譜圖。(A)Fe3O4@MWCNTs;(B)Fe3O4@MWCNTs@PAAFig.5 X-ray photoelectron spectra(XPS).(A):Fe3O4@MWCNTs;(B):Fe3O4@MWCNTs@PAA

2.2 Fe3O4@MWCNTs@PAA對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能

2.2.1 pH對(duì)蛋白質(zhì)吸附容量的影響在離子交換色譜中，pH值對(duì)吸附容量的影響是pH值對(duì)蛋白質(zhì)和吸附劑表面電荷共同作用的結(jié)果。本文以Cyt c和Lys為模型蛋白，研究了pH=5.0～10.0之間Fe3O4@-MWCNTs@PAA對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量(圖6)。Fe3O4@MWCNTs@PAA的外層是PAA分子，其pKa約為5.0，當(dāng)吸附體系的pH在5.0～10.0之間時(shí)，PAA主要以酸根離子形式存在，吸附劑表面帶負(fù)電荷；Lys的等電點(diǎn)約為11，Cyt c的等電點(diǎn)約為10，故當(dāng)pH<10.0時(shí)，Cyt c和Lys均帶正電荷。當(dāng)吸附體系的pH由5.0～8.0逐漸增大時(shí)，由于PAA是弱酸，隨著溶液pH的增大，吸附劑表面解離出的酸根離子增加，吸附劑表面所帶負(fù)電荷密度也逐漸加大；但由于pH增大，越來(lái)越接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，導(dǎo)致Cyt c和Lys所帶的正電荷逐漸減少。因此，當(dāng)吸附體系的pH為6.0時(shí)，F(xiàn)e3O4@MWCNTs@PAA對(duì)Cyt c和Lys的吸附量達(dá)到最大值，此時(shí)靜電吸引力發(fā)揮主導(dǎo)作用。而當(dāng)吸附體系的pH由8.0～10.0繼續(xù)增大時(shí)，Cyt c和Lys所帶的正電荷進(jìn)一步減少，故其主要以分子形式存在，由于MWCNTs對(duì)蛋白質(zhì)具有疏水作用力，吸附劑對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量又逐漸加大。為了提高吸附劑對(duì)堿性蛋白質(zhì)的選擇性，本研究選擇pH=6.0時(shí)吸附，此時(shí)靜電吸引力發(fā)揮主導(dǎo)作用。

圖6 pH對(duì)Lys和Cyt c的吸附容量的影響Fig.6 Effect of pH on the adsorption capacityfor Lys and Cyt c

2.2.2 時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)吸附容量的影響為了提高分離純化效率，以L(fǎng)ys和Cyt c為模型蛋白對(duì)吸附時(shí)間進(jìn)行了研究。如圖7所示，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到1 h以上時(shí)，吸附量升高不再明顯。因此，該吸附劑對(duì)蛋白質(zhì)具有較快的吸附動(dòng)力學(xué)，其最佳吸附時(shí)間為1 h。

圖7 吸附時(shí)間對(duì)Lys和Cyt c吸附容量的影響Fig.7 Effect of the adsorption time on the adsorption capacity for Lys and Cyt c

2.3 靜態(tài)吸附等溫線(xiàn)

為了研究Fe3O4@MWCNTs@PAA對(duì)堿性蛋白質(zhì)的吸附容量和選擇性，本實(shí)驗(yàn)在最佳吸附時(shí)間和pH值條件下，測(cè)定了Fe3O4@MWCNTs@PAA對(duì)堿性蛋白質(zhì)(Lys和Cyt c)和對(duì)酸性蛋白(BSA)的靜態(tài)吸附等溫線(xiàn)，如圖8。由圖可知，F(xiàn)e3O4@MWCNTs@PAA對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量隨著蛋白質(zhì)溶液濃度的增大而逐漸增大，最后達(dá)到飽和。但是，F(xiàn)e3O4@MWCNTs@PAA對(duì)Lys和Cyt c吸附容量要遠(yuǎn)高于BSA。這與吸附劑表面的電荷性質(zhì)以及蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有關(guān)：當(dāng)溶液的pH值為6.0時(shí)，Lys和Cyt c帶凈的正電荷，F(xiàn)e3O4@MWCNTs@PAA表面帶負(fù)電荷，二者發(fā)生靜電吸引作用，因而Fe3O4@MWCNTs@PAA對(duì)Lys和Cyt c具有較高的吸附容量；而pH=6.0時(shí)，BSA帶凈的負(fù)電荷，與Fe3O4@MWCNTs@PAA發(fā)生靜電排斥作用，因此Fe3O4@MWCNTs@PAA對(duì)其基本不產(chǎn)生吸附。因此，F(xiàn)e3O4@MWCNTs@PAA對(duì)堿性性蛋白具有較高的吸附選擇性。

圖8 Fe3O4@MWCNTs@PAA對(duì)蛋白質(zhì)的靜態(tài)吸附等溫線(xiàn)Fig.8 Adsorption isotherms of Fe3O4@MWCNTs-@PAA for protein

經(jīng)Langmuir擬合發(fā)現(xiàn)，對(duì)于Lys和Cyt c，其ce/Q與ce之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程分別為ce/Q=0.00421ce+0.36(r=0.993)、ce/Q=0.00489ce+0.52(r=0.985)，因此Fe3O4@MWCNTs@PAA對(duì)Lys和Cyt c屬于典型的Langmuir單分子層吸附。經(jīng)計(jì)算，F(xiàn)e3O4@MWCNTs@PAA對(duì)Lys和Cyt c的最大吸附容量分別為237.5 μg/mg和204.5 μg/mg。相比于用羧基化碳納米管直接進(jìn)行固相萃取[12]，F(xiàn)e3O4@MWCNTs@PAA對(duì)堿性蛋白質(zhì)具有更高的吸附容量，這是由于PAA的引入使碳納米管表面具有更高密度的羧基。因此，將聚合物大分子修飾在材料表面是提高吸附容量的有效方法。

2.4 實(shí)際樣品分析

雞蛋清中含有豐富的蛋白質(zhì)，除了Lys(pI=11)以外，其他蛋白質(zhì)(OVA，pI=4.6；卵類(lèi)粘蛋白，pI=4.0；伴清蛋白，pI=6.6)均為酸性蛋白，而且，Lys的含量只占雞蛋清中總蛋白質(zhì)含量的3.5%[17]。因此，雞蛋清是最易得的、適合于測(cè)試陽(yáng)離子交換選擇性的生物樣本。將Fe3O4-@MWCNTs@PAA用于雞蛋清中Lys的分離純化，結(jié)果如圖9。相比于未經(jīng)Fe3O4@MWCNTs@PAA吸附的雞蛋清樣品(條帶2)，經(jīng)過(guò)Fe3O4@MWCNTs@PAA吸附后的雞蛋清樣品中只有Lys條帶變淺(條帶3)，說(shuō)明只有Lys被吸附；而在洗脫液中(條帶4)，僅能觀察到Lys的條帶，說(shuō)明Lys被Fe3O4@MWCNTs@PAA 從雞蛋清中分離純化出來(lái)。因此，本文制備的陽(yáng)離子交換磁性吸附劑具有一定的實(shí)用價(jià)值。

圖9 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Fig.9 SDS -PAGE analysislane:1.protein marker,lane;2.egg white before adsorption,lane;3.egg white after adsorption,lane;4.the elution.

3 結(jié)論

成功制備了Fe3O4@MWCNTs并將PAA通過(guò)靜電自組裝法修飾在其表面，得到了一種新型陽(yáng)離子交換磁性吸附劑。這種制備方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和無(wú)毒，并且得到了較高的離子交換容量和蛋白質(zhì)吸附容量。同時(shí)，該磁性納米吸附劑在蛋白質(zhì)分離純化方面具有操作簡(jiǎn)便、快速，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，該陽(yáng)離子交換磁性吸附劑在生物大分子的分離純化方面具有良好的應(yīng)用前景。