劉昭清, 萬(wàn) 眾, 江 政, 庹 潯*

(1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌 330000; 2.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330000)

羅非昔布(Rofecoxib,RFB)是一種非甾體類抗炎藥物，它也是環(huán)氧化酶(COX)抑制劑的代表性藥物,具有解熱，鎮(zhèn)痛和消炎等作用，主要用于止痛與治療骨關(guān)節(jié)炎。與傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥相比，服用RFB可有效地降低胃腸道不良反應(yīng)的發(fā)生率。然而，持續(xù)服用RFB會(huì)導(dǎo)致心血管風(fēng)險(xiǎn)的增加，2004年該藥物也因此安全問(wèn)題而撤市[1]。但Tremeau Pharmaceuticals制藥公司在2018年宣布計(jì)劃將該藥重新推向市場(chǎng)，且該藥主要應(yīng)用于治療血友病引起的嚴(yán)重關(guān)節(jié)疼痛。因此研究RFB在體內(nèi)的作用機(jī)制可以為相關(guān)的監(jiān)管機(jī)構(gòu)確定該藥的利弊提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[2]。

血清白蛋白是生體內(nèi)含量最豐富的載體蛋白，能夠與很多小分子藥物廣泛結(jié)合，在血液物質(zhì)的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中擔(dān)任了重要的角色[3]。通過(guò)光譜法研究單一(多個(gè))藥物與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的報(bào)道較多，但是對(duì)于RFB與BSA之間相互作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本文結(jié)合光譜學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探究RFB與BSA之間的相互作用的機(jī)理，為進(jìn)一步揭示RFB對(duì)生物體的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

F-4500熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)，帶溫控系統(tǒng)；Cary Eclipse熒光光譜儀(美國(guó)，安捷倫公司)；UV-5500PC紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；Terson-27紅外光譜儀(布魯克)，帶ATR附件。

牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich公司)溶液：溶于超純水中，配制成1.0×10-3mol/L的溶液，于-20 ℃保存；羅非昔布(RFB)(上海源葉生物，≥98%)溶液：配制成1.0×10-3mol/L貯備溶液，4 ℃保存；Tris-HCl緩沖液：稱取2.42 g Tris和3.51 g NaCl，溶于500 mL超純水中，配制成pH=7.40的緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 熒光光譜測(cè)定準(zhǔn)確移取3 mL的Tris-HCl緩沖液至1 cm的比色皿中，固定溶液中BSA的濃度(1.7×10-6mol/L)，逐漸增加RFB的濃度至8.3×10-7mol/L，設(shè)置合適的儀器參數(shù)，以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在300～400 nm范圍內(nèi)測(cè)定RFB對(duì)BSA熒光光譜的影響。

改變BSA-RFB體系的溫度(288 K、293 K、298 K),以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量300～400 nm的熒光光譜。固定Δλ(λex-λem)=15 nm與Δλ(λex-λem)=60 nm，測(cè)定BSA在250～320 nm范圍內(nèi)的同步熒光光譜。固定溶液中BSA(1.7×10-6mol/L)與RFB(1.7×0-7mol/L)的濃度，設(shè)置合適的儀器參數(shù)，在激發(fā)波長(zhǎng)每增加2 nm的情況下，繪制200～300 nm的三維熒光光譜。

1.2.2 紅外光譜測(cè)定在分辨率為4 cm-1，背景掃描和樣品掃描都是64次的情況下，測(cè)定游離態(tài)和復(fù)合態(tài)BSA的紅外光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 RFB與BSA的結(jié)合方式

分子中的色氨酸殘基(Trp)與酪氨酸殘基(Tyr)是BSA內(nèi)源性熒光的主要來(lái)源[4,6]。如圖1所示，BSA的熒光強(qiáng)度隨著RFB濃度的增加而顯著下降，表明BSA內(nèi)源性熒光發(fā)生猝滅是因?yàn)镽FB與BSA發(fā)生了相互作用[5]。

圖1 BSA-RFB體系的熒光光譜(A)和BSA與RFB相互作用的雙對(duì)數(shù)圖(B)Fig.1 Fluorescence spectra of BSA-RFB system(A) and plots of log[(F0/F)-1] versus logc for BSA-RFB system(B) [BSA]=1.7×10-6 mol/L;1 - 6:[RFB]=0、1.7、3.3、4.9、6.6、8.3×10-7 mol/L.

RFB導(dǎo)致BSA熒光猝滅的機(jī)制包括動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅[4,6]。所以，可以通過(guò)溫度與結(jié)合常數(shù)之間的關(guān)系和Stern-Volmer方程來(lái)判斷熒光猝滅機(jī)制[7]。

F0/F=1 +KSV[Q]=1 +Kqτ0[Q]

(1)

式中的F0為BSA的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為BSA中加入不同濃度的RFB后的熒光強(qiáng)度，KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，[Q]為RFB的濃度，τ0為RFB不存在時(shí)BSA的熒光壽命(10-8s)，Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)。

根據(jù)式(1)可以計(jì)算出溫度分別為288 K、293 K和298 K時(shí)，RFB對(duì)BSA的猝滅常數(shù)Kq分別是2.98×1013L/(mol·s)，2.47×1013L/(mol·s)，2.20×1013L/(mol·s)，比最大碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)高出3個(gè)數(shù)量級(jí)，表明了RFB與BSA是分子間結(jié)合形成不發(fā)光物質(zhì)而引起了靜態(tài)猝滅[8]。同時(shí)動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而降低，與動(dòng)態(tài)猝滅的機(jī)制不符，證明了RFB與BSA的熒光猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅[9]。

2.2 熒光光譜分析

對(duì)于靜態(tài)猝滅來(lái)說(shuō)，RFB-BSA體系的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，可由公式(2)得到

log[(F0-F)/F]=logKA+nlog[Q]

(2)

如圖1所示，根據(jù)線性方程的斜率與截距即可得到結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)KA[10]。由表(1)可知，RFB與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而降低進(jìn)一步證明了RFB與BSA之間的熒光猝滅機(jī)理是靜態(tài)猝滅。RFB與BSA之間結(jié)合常數(shù)的數(shù)量級(jí)是105，說(shuō)明了RFB與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用[10]。不同溫度條件下，n值均為1說(shuō)明RFB和BSA兩者之間有一個(gè)有效的結(jié)合位點(diǎn)。

BSA有兩個(gè)位點(diǎn)與小分子結(jié)合，位點(diǎn)Ⅰ有Trp與Tyr兩個(gè)芳香族的氨基酸殘基，位點(diǎn)Ⅱ僅有Tyr一個(gè)芳香族氨基酸殘基[11]。因此，可以利用同步光譜單獨(dú)區(qū)分Trp與Tyr的特征熒光光譜，從而確定BSA與RFB之間的結(jié)合位點(diǎn)。其中Δλ=15 nm僅顯示Tyr的特征光譜，Δλ=60 nm僅表現(xiàn)為T(mén)rp的特征光譜[11 - 12]，結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著RFB濃度的增加([RFB]∶[BSA]<1)，Tyr、Trp熒光均被猝滅，Tyr的熒光強(qiáng)度下降22.59%；Trp的熒光強(qiáng)度下降27.14%，揭示了RFB與Tyr和Trp都發(fā)生了相互作用，且RFB與BSA的結(jié)合位點(diǎn)更接近Trp殘基。因此，可判斷RFB和BSA之間的結(jié)合位點(diǎn)是在位點(diǎn)Ⅰ。

圖2 RFB-BSA體系的同步熒光光譜Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of BSA-RFB system[BSA]=1.7×10-6 mol/L;1 - 6:[RFB]=0,1.7,3.3,4.9,6.6,8.3×10-7 mol/L.

2.3 RFB和BSA的相互作用力

靜電作用力、范德華力、氫鍵和疏水作用力等作用力是化學(xué)小分子與生物大分子之間形成超分子復(fù)合物的主要驅(qū)動(dòng)力[12 - 13]。通過(guò)RFB與BSA之間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，能夠推斷出它們之間相互結(jié)合的作用力類型。由表1可知，ΔG<0，由此說(shuō)明了反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的；ΔH<0、ΔS<0，表明RFB和BSA之間的相互作用力主要為氫鍵與范德華力。

表1 不同溫度下BSA-RFB體系的熱力學(xué)常數(shù)

2.4 RFB-BSA之間的能量轉(zhuǎn)移與結(jié)合距離

根據(jù)F?rter的偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移定理可以計(jì)算出BSA-RFB之間的結(jié)合距離。由圖3可以看出，BSA熒光光譜與RFB紫外可見(jiàn)光譜的重疊面積J0=2.65×10-14cm2·L/mol，進(jìn)一步計(jì)算得臨界距離R0=2.88 nm，RFB與氨基酸殘基Trp之間的結(jié)合距離r0=3.50 nm<7 nm,即RFB與BSA之間發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移[13]。0.5R0

圖3 BSA的熒光發(fā)射光譜(a)和RFB的紫外吸收光譜(b)Fig.3 Spectral overlap between fluorescence emission spectrum of BSA(a)and the absorption spectrum of RFB(b)[BSA]=[RFB]=1.7×10-6 mol/L.

2.5 RFB對(duì)BSA構(gòu)象的影響

三維熒光光譜可以為BSA的構(gòu)象變化提供更多和更為詳細(xì)的信息[15]。如圖4與表2所示，加入RFB后，Peak1 Stoke位移由70 nm變化到了73 nm且熒光強(qiáng)度由496.04降低到了370.27;Peak2 stoke位移由120 nm變化到了122 nm且熒光強(qiáng)度由709.22下降到了373.63。三維熒光的結(jié)果表明研究體系中RFB的存在誘導(dǎo)BSA構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖4 BSA(A)和RFB-BSA(B)體系的三維熒光光譜Fig.4 Three-dimensional spectroscopy of BSA(A)and BSA-RFB(B) [BSA]=1.7×10-6 mol/L,[RFB]=0，1.7×10-7 mol/L.

表2 三維熒光光譜的特征參數(shù)

蛋白質(zhì)的紅外光譜主要是由肽基的羰基伸縮振動(dòng)、肽基N-H平面內(nèi)彎曲和C-N伸縮振動(dòng)所誘導(dǎo)的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶組成[16]。一般來(lái)說(shuō)，酰胺Ⅰ帶比酰胺Ⅱ帶對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化更敏感。利用分峰技術(shù)分析BSA酰胺Ⅰ 帶的紅外光譜可以得到α-螺旋(1 660～1 650 cm-1)、β-折疊(1 640～1 610 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 680～1 640 cm-1)、β-片層結(jié)構(gòu)(1 690～1 680 cm-1)、無(wú)規(guī)則卷(1 648～1 441 cm-1)等蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的具體信息[16]。游離態(tài)和復(fù)合態(tài)BSA的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量如圖5和表2所示，BSA的α-螺旋的含量從游離態(tài)的67.16%下降到了復(fù)合態(tài)的57.58%，證明RFB與BSA發(fā)生相互作用時(shí)導(dǎo)致BSA的構(gòu)象發(fā)生變化。該結(jié)論與三維熒光的結(jié)論一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了RFB誘導(dǎo)BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖5 BSA和BSA-RFB的紅外光譜圖Fig.5 The infrared spectra of BSA and BSA-RFB

表3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)

2.6 分子對(duì)接

分子對(duì)接技術(shù)為光譜學(xué)研究小分子藥物與生物大分子之間的相互作用提供了有利的佐證[12,17]。因此本研究運(yùn)用Autodock4.2對(duì)RFB與BSA在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ與Ⅱ處的結(jié)合模式進(jìn)行了研究。研究表明RFB分別進(jìn)入BSA的結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ與結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ時(shí)，它們結(jié)合的吉布斯自由能是-9.2 kcal/mol(位點(diǎn)Ⅰ)和-5.1 kcal/mol(位點(diǎn)Ⅱ)，說(shuō)明了RFB更傾向于與BSA的位點(diǎn)Ⅰ進(jìn)行結(jié)合。對(duì)接技術(shù)的結(jié)論與同步熒光的結(jié)論一致。

利用PyMOL進(jìn)一步對(duì)結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ的分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BSA的Arg194/198/217/347、Ser201、Trp213、Tyr451、Asp450等氨基酸殘基與RFB具有相互作用。其中絕大多數(shù)氨基酸都是疏水性氨基酸，表明了RFB與BSA之間具有較強(qiáng)的疏水作用力；Ser201、Arg194與RFB還形成了三個(gè)氫鍵，鍵長(zhǎng)分別是2.9 ?、3.1 ?和3.2 ?；芳香族氨基酸Tyr451、Trp213和RFB之間的π-π堆積作用可能是導(dǎo)致其熒光下降的主要因素；同時(shí)，RFB附近存在一些極性帶電氨基酸殘基，例如Arg194/198/217/347、ASP450，因此，BSA與RFB之間的π-cation作用同樣值得關(guān)注。綜上所述，這些作用力的協(xié)同作用對(duì)維持RFB-BSA復(fù)合物的穩(wěn)定性具有重要作用。

圖6 RFB與BSA的分子對(duì)接模擬圖。A：BSA-RFB復(fù)合物結(jié)構(gòu)圖，B：RFB位于BSA疏水性空腔Ⅰ中放大圖，C：RFB與BSA相互作用Fig.6 Simulation of molecular docking between RFB and BSA.A:Structure diagram of BSA-RFB complex;B:Enlarged diagraming of RFB located on BSA site Ⅰ;C:Interaction between RFB and BSA

3 結(jié)論

本工作結(jié)合光譜學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)研究RFB與BSA之間的相互作用機(jī)制，結(jié)果表明：RFB和BSA之間形成了復(fù)合物，其過(guò)程為靜態(tài)猝滅與非輻射能量轉(zhuǎn)移；疏水作用力、π-π堆積作用、氫鍵和π-cation作用等對(duì)于維持RFB-BSA復(fù)合物的穩(wěn)定性起到了重要作用；三維熒光與紅外光譜相互印證了RFB誘導(dǎo)BSA的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；分子對(duì)接的結(jié)果與光譜學(xué)的結(jié)果一致，表明了RFB-BSA的結(jié)合位點(diǎn)在位點(diǎn)Ⅰ,為RFB的進(jìn)一步研究提供了更有力的參考。