孔 萌，黃 彬，石劍飛，彭明國，何 方，毛林強，張文藝

(1.常州大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.江蘇中東化肥股份有限公司，江蘇 常州 213153；3.武農(nóng)生態(tài)能源有限公司，江蘇 常州 213165)

氯酚類化合物是一種具有“致癌、致畸、致突變”效應(yīng)的持久性有機污染物，廣泛存在于土壤、地表水、地下水中，其潛在風(fēng)險備受關(guān)注。農(nóng)藥及化學(xué)肥料的肆意使用，嚴(yán)重影響了土壤的微生態(tài)環(huán)境，加上我國大多數(shù)地區(qū)作物連作制度，致使土壤板結(jié)、營養(yǎng)元素虧缺、質(zhì)地惡化、微生物群落變遷等情況日益嚴(yán)重。近年來，處理氯酚類化合物污染的方法主要集中在生物處理技術(shù)、物理化學(xué)法、化學(xué)還原法和化學(xué)氧化法[1]。其中微生物修復(fù)有機氯農(nóng)藥污染土壤具有成本低、修復(fù)效率高、二次污染效應(yīng)小等特點，受到廣泛的關(guān)注[2]。唐晨[3]歸納討論了生物降解酚類化合物的機制及影響因素，而范燕燕[4]的研究則證實了微生物降解氯酚類化合物的有效性。沼渣除了含有大量的氮、磷、鉀營養(yǎng)元素還有植物生長必須的氨基酸、生長素、腐殖酸等，不僅對提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)有良好的作用[5-7]，還能夠改良土壤的理化性質(zhì)[8-9]，增加微生物的活性。本課題組前期將微生物與沼渣結(jié)合制備出沼渣生物菌肥[10-11]，對2,4-DCP污染土壤具有較好的改良效果。

錢家忠、董繼元等曾研究沼液對水環(huán)境潛在的生態(tài)危害進(jìn)行了健康風(fēng)險評價[12-14]，但對于農(nóng)田土壤污染潛在的人群健康風(fēng)險評估的研究尚未見報導(dǎo)。生物毒性檢測是一種化學(xué)污染物檢測的補充[15]，可以有效直觀的反映受污染土壤毒性，從而體現(xiàn)污染物對于人類健康和生態(tài)環(huán)境的影響。有研究對廢棄農(nóng)藥廠污染場地土壤浸出液進(jìn)行生物毒性檢測證明生物毒性測試法可以運用于污染土壤浸出液的毒性評價[16]。美國環(huán)境保護(hù)所(USPEA)健康風(fēng)險評價模型曾被用于評價鎘污染對不同人群暴露的健康風(fēng)險[17]。為了確保居民的健康與安全，對改良土壤進(jìn)行生物毒性檢測和健康風(fēng)險評價是十分有必要的。目前，國內(nèi)外大多研究集中于沼渣作為有機肥對土壤養(yǎng)分含量、生態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，但對生物菌劑協(xié)同沼渣制備生物菌有機復(fù)合肥，對降解農(nóng)藥污染土壤毒性報道較少。本課題組基于生物菌-沼渣協(xié)同改良受污染土壤研究基礎(chǔ)，對修復(fù)后的土壤進(jìn)行急性毒性與健康風(fēng)險評價研究。

本研究以受2,4-DCP污染的農(nóng)田土壤為研究對象，通過添加本課題組制備的HD-1沼渣生物菌肥和菌液[18]，利用發(fā)光菌法對改良后土壤浸提液毒性以及土壤中種植的水稻、花生果實浸提液毒性進(jìn)行分析，考察施用生物菌有機復(fù)合肥對改良后農(nóng)田土壤對人群健康風(fēng)險評估的影響，為農(nóng)藥污染土壤的改良和生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)建提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料

菌種來源：農(nóng)殘降解菌HD-1篩選自南京某廢棄農(nóng)藥廠的土壤中，是一株具有降解2,4-DCP能力的菌，經(jīng)過理化特性和分子鑒定判斷屬于摩式假單胞菌?，F(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。保藏編號：CGMCC NO.15123。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 L，pH值7.0，121℃，100 kPa上海申安立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS)高溫滅菌20 min后使用。

干燥污泥磷酸銨鎂(MgNH4PO4·6H2O簡稱MAP)：將分散式養(yǎng)豬場沼液通過磷酸銨鎂結(jié)晶法制備MAP[10]。

改性沸石：采用經(jīng)NaCl溶液改性后的斜發(fā)沸石，理化參數(shù)：粒徑1～3 mm，孔隙率30%～40%，比表面積25～35 m2·g-1，平均吸附孔徑4.36 nm。將改性后的斜發(fā)沸石對MAP結(jié)晶法處理后的沼液進(jìn)行吸附，吸附比10 g·100 mL-1，得到含氮、磷的斜發(fā)沸石。

沼渣：將分散式養(yǎng)豬場沼渣進(jìn)行150℃高溫干燥72 h，剔除雜質(zhì)，使用上海福絮鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9620A)達(dá)到干燥效果。

包膜材料：取一定量蒸餾水加熱至約90℃后加入聚乙烯醇不停攪拌，保溫攪拌至其完全溶解，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的聚乙烯醇溶液，密封保存冷卻至室溫。

1.2 菌液和菌肥的制備

(1)HD-1菌液制備：將配置好的LB培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋121℃，滅菌20 min，待冷卻到約30℃時，將菌種轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基中，于30℃，130 r·min-1上海一恒恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-X100A)中震蕩3 d。

(2)沼渣生物菌肥的制備：將上述MAP，改性沸石，沼渣進(jìn)行研磨，并過60目篩網(wǎng)。將1 gMAP，4 g改性沸石，25 g沼渣與對數(shù)生長期的HD-1菌液混合、造粒，控制粒徑范圍4～6 mm,使得有效活菌數(shù)大于0.2 cfu·g-1，再將6.0 mL 8%聚乙烯醇作為封面材料均勻包裹在復(fù)混肥表面，復(fù)混比0.2 mL·g-1，待35℃烘干后為生物菌復(fù)混肥成品。

(3)模擬2,4-DCP受污染土壤：取適量未滅菌農(nóng)田土，自然風(fēng)干，過60目篩，制備2,4-DCP濃度為30 mg·kg-1。

1.3 發(fā)光細(xì)菌急性毒性測定

(1)取兩份400 g 2,4-DCP濃度為30 mg·kg-1的土壤，其中一份加入267 mL的HD-1菌液及10 g沼渣生物菌肥，另一份為空白，使得含水率為40%，每隔兩天取10 g土壤于50 mL離心管中，加入40 mL蒸餾水，超聲波提取30 min，4000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液過0.45 μm針孔過濾器，得到不同時間段的浸提液樣品。超聲波提取使用寧波新芝超聲波清洗機(SB-5200D)，離心機使用金壇市杰瑞爾臺式大型離心機(XYJ-A)。

(2)將在施加30 g沼渣生物菌肥的土壤里種植的盆栽水稻、花生果實碾碎分別取5 g浸入100 mL無菌蒸餾水中，超聲波萃取30 min，4000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液過0.45 μm針孔過濾器，得到果實浸提液樣品。

將浸提樣品分別通過北京金達(dá)JQ LID-P1發(fā)光細(xì)菌毒性檢測分析儀檢測，測定結(jié)果以抑光率公式(1)表示：

1.4 盆栽實驗栽種

盆栽實驗農(nóng)作物有水稻、玉米、花生、紅薯等，盆栽分別施加市售復(fù)合肥和沼渣生物菌肥，并設(shè)置平行對照組。盆栽實驗在室外進(jìn)行，種植農(nóng)作物的器皿為陶瓷盆，土壤層厚度為25 cm，農(nóng)作物秧苗采自常州市洛陽鎮(zhèn)農(nóng)田。實驗前期對每盆盆栽施加30 g基肥，中后期(1～3個月)對照盆栽每10 d施加沼渣生物菌肥、市售復(fù)合肥15 g，施加4次。

1.5 土壤樣品主要污染物產(chǎn)物檢測

2,4-DCP在土壤中濃度的測定：配置一定濃度的2,4-DCP土壤，攪拌均勻后，取10 g土壤于50 mL離心管中，加入一定量的蒸餾水使其含水率為40%，超聲波提取30 min，4000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液過0.45 μm針孔過濾器，轉(zhuǎn)入試劑瓶通過日本島津紫外分光光度計(UV1800)檢測。

菌種在土壤中降解能力的測定：取200 g土壤加入135 mL菌液，保持含水率為40%，不加菌做空白樣，按照土壤測定方法每天檢測。

南京索益盟檢測技術(shù)有限公司檢測土壤中污染物方法：氣相色譜氣質(zhì)聯(lián)用法測土壤中的酚類化合物[19-20]。

1.6 污染土壤健康風(fēng)險模型構(gòu)建

土壤中污染物進(jìn)入人體主要暴露途徑有皮膚接觸、呼吸攝入及經(jīng)口攝入。不同污染物經(jīng)過不同途徑對人體產(chǎn)生危害所引起的健康風(fēng)險模型分為致癌物健康風(fēng)險模型和非致癌物健康風(fēng)險模型[21-24]。

根據(jù)《污染場地風(fēng)險評估技術(shù)導(dǎo)則》，污染物致癌風(fēng)險為10-6，非致癌風(fēng)險危害商值為1。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)運用origin9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與討論

2.1 HD-1在土壤中降解性能研究

模擬受污染土壤加入新鮮制備過夜的HD-1菌液，保持土壤含水率為40%，不加菌劑空白對照組，每隔2 d取10 g土測定2,4-DCP在土壤中的殘余濃度。本實驗設(shè)置不加菌劑空白組，以相同時間處理土壤，不投加HD-1菌的受污染土壤經(jīng)10d改良后，土壤中的2,4-DCP降解率為23.09%，濃度從28.42 mg·kg-1降低到23.25 mg·kg-1，投加HD-1菌的受污染土壤經(jīng)過10 d改良后，降解率為64.16%，殘余濃度由28.01 mg·kg-1降為10.83 mg·kg-1。將投加HD-1菌的受污染土壤又自然降解20 d委托南京索益盟檢測技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測，檢測2,4-DCP濃度為8.01 mg·kg-1。實驗證明，本文所篩選出的HD-1降解菌可有效修復(fù)2,4-DCP污染土壤。

當(dāng)農(nóng)藥濃度過高時，微生物降解農(nóng)藥會發(fā)生吸附和解析過程，即菌株降解農(nóng)藥時，會將藥劑先吸附到菌體表面，再轉(zhuǎn)移至菌體體內(nèi)進(jìn)行降解，當(dāng)菌體體內(nèi)農(nóng)藥積攢濃度過高時，菌體自身會開啟保護(hù)機能，將農(nóng)藥排斥出去，防止自身受到傷害，同時代謝產(chǎn)物也會使菌體產(chǎn)生生物毒性，從而導(dǎo)致農(nóng)藥降解率逐漸下降[25](如圖1)。

圖1 加菌與未加菌對土壤中2,4-DCP的降解效果

2.2 施加菌液后土壤浸提液急性毒性分析

發(fā)光細(xì)菌是一類在正常生理條件下可以發(fā)射熒光的細(xì)菌，用于監(jiān)測樣品中毒性的一種生物測試技術(shù)。運用具有發(fā)光特性的天然微生物，樣品中的毒性物質(zhì)具有抑制微生物發(fā)光的作用，毒性越強這種抑制作用越明顯。韋淑穩(wěn)[26]等曾用發(fā)光細(xì)菌法用于檢測農(nóng)藥污染毒性，并提出了發(fā)光細(xì)菌法在農(nóng)藥與其他多重污染物毒性檢測中的應(yīng)用前景。發(fā)光細(xì)菌急性毒性評價標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)南京土壤研究所推薦的百分?jǐn)?shù)等級分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)見表1[27]。

表1 發(fā)光細(xì)菌急性毒性評價標(biāo)準(zhǔn)

圖2顯示了經(jīng)過15 min浸提之后受污染原土、未稀釋和稀釋10倍的土壤浸提液對發(fā)光細(xì)菌發(fā)光抑制情況，由該圖可以看出施加菌液后的土壤隨時間的增加，其浸提液都對發(fā)光細(xì)菌的抑制效果呈減弱趨勢，未稀釋的浸提液在第2天抑光率高達(dá)88.14%，稀釋后的浸提液抑光率為67.17%，未稀釋和稀釋10倍的浸提液在10 d內(nèi)抑光率分別下降到了56.65%和40.19%，自然降解的土壤浸提液其抑光率由89.41%降低到84.50%，抑光率變化不大。施加菌液10 d后的土壤浸提液樣品毒性仍為重毒標(biāo)準(zhǔn)，受污染原土浸提液毒性為劇毒標(biāo)準(zhǔn)。在第8天之前，施加菌液土的抑光率變化不大，第8天到第10天變化明顯，與HD-1菌降解效果變化基本吻合。由此可知，HD-1降解菌有效降解2,4-DCP后，對土壤毒性起到了降低的作用，證實了HD-1降解菌的有效性。

圖2 土壤樣品浸提液急性毒性

2.3 農(nóng)作物果實浸提液發(fā)光細(xì)菌毒性分析

盆栽實驗種植農(nóng)作物有水稻、玉米、花生、紅薯等，選取具有代表性的水稻(桔桿果實)和花生(生長在土壤中根莖果實)進(jìn)行果實浸提液發(fā)光細(xì)菌毒性分析。在分別施加市售復(fù)合肥和沼渣生物菌肥的模擬受2,4-DCP污染土壤中種植水稻與花生，果實成熟后對果實長勢對比，果實浸提液進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性分析。由表2可以看出，2,4-DCP污染土壤盆栽實驗中施加市售的復(fù)合肥的水稻長勢略好，花生長勢相差無幾。盆栽果實浸提液樣品急性毒性檢測結(jié)果顯示，水稻、花生的浸提液相對發(fā)光率均大于90%，毒性級別為無毒。施加沼渣生物菌肥的盆栽水稻果實相對發(fā)光率大于施加市售復(fù)合肥的盆栽，由此可知，水稻與沼渣生物菌肥聯(lián)合對受2,4-DCP污染土壤的降解效果相對較好，盆栽花生中土壤降解效果相對較差。可以推測到，水稻水生的生長環(huán)境更加適合沼渣生物菌肥的釋放作用。水中的微生物群落更加均勻而又豐富，使得沼渣生物菌肥的效果更佳[28]。

表2 盆栽農(nóng)作物生長情況、果實浸提液相對發(fā)光率及毒性級別

2.4 改良后土壤樣品主要污染物產(chǎn)物分析

將施加菌液后的模擬受污染土壤樣品送至南京索益盟檢測技術(shù)有限公司檢測，檢測主要污染物如表3所示，檢出污染物37種，檢出率71.15%，主要高濃度的污染物有苯酚、萘、2,4-DCP、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯、鄰苯二甲酸二丁酯、菲、芘等。其中大多數(shù)污染物質(zhì)具有致癌危險，因此需對污染的農(nóng)田土壤進(jìn)行毒性分析及健康風(fēng)險評估。改良后污染物中大部分得到有效降低，而鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯和鄰苯二甲酸二丁酯濃度變高。鄰苯二甲酸二甲酯毒性等級為低毒，還未有中毒報道，動物經(jīng)口劑量大時對腸道等有刺激作用，對皮膚無刺激和致敏作用。鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯毒性等級為中毒，口服-大鼠LD50: 30000 mg·kg-1;口服-小鼠LD50: 1500mg·kg-1，皮膚-兔:500 mg·24 h-1為輕度; 眼睛-兔:500 mg輕度。鄰苯二甲酸二丁酯，毒性分級為中毒，可引起輕度致敏作用，具有中等程度的蓄積作用和輕度刺激作用。受污染土壤經(jīng)過改良后污染物濃度大幅度降低，使得受污染土壤對環(huán)境影響減小，由此可知，HD-1菌不僅對土壤中的2,4-DCP具有有效的降解能力，對苯酚等高毒污染物也具有降解效果，對萘、菲等低毒污染物也具有一定的降解能力。

表3 土壤樣品中有機污染物種類及濃度 (μg·kg-1)

2.5 2,4-DCP污染土壤健康風(fēng)險評價

部分高濃度半揮發(fā)性有機物通過不同途徑對人體健康造成的風(fēng)險高低依次為：經(jīng)口攝入>皮膚接觸>呼吸攝入。以模擬受2,4-DCP污染農(nóng)田土為研究目標(biāo)，部分高濃度污染物致癌、非致癌風(fēng)險指數(shù)見表4，土壤中2,4-DCP，2,6-二硝基甲苯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯濃度較高對人體健康危害相對突出。通常認(rèn)為致癌風(fēng)險大于10-6，非致癌危害商值大于1，會對人體產(chǎn)生健康風(fēng)險[26]，2,4-DCP經(jīng)口攝入、皮膚接觸、呼吸攝入土壤非致癌風(fēng)險分別為2.31×10-2，1.26×10-2，1.61×10-5小于非致癌危害商值1，鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯的致癌風(fēng)險為2.74×10-8，1.5×10-8，2.15×10-10小于致癌可接受水平10-6，表明經(jīng)過菌液改良后的農(nóng)田土，致癌和非致癌風(fēng)險極小，為可接受水平，即對受污染農(nóng)田土進(jìn)行菌液改良的效果顯著。

表4 部分高濃度污染物致癌、非致癌風(fēng)險指數(shù)

3 結(jié)論

(1)施加菌液后受2,4-DCP污染土壤浸提液急性毒性降低明顯，原土浸提液毒性為劇毒，施加菌液改良的土壤經(jīng)過10 d降解后，土壤浸提液毒性等級降低到重毒，在施加沼渣生物菌肥土壤中種植的水稻和花生果實浸提液毒性等級為無毒。HD-1菌可以降低土壤中2,4-DCP濃度，水稻與沼渣生物菌肥協(xié)同對受2,4-DCP污染土壤的降解效果更好，土壤毒性解毒效果更佳。

(2)依據(jù)構(gòu)建的致癌和非致癌健康風(fēng)險模型，施加菌液改良后的農(nóng)田污染土高濃度污染物2,4-DCP、2,6-二硝基甲苯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯的致癌風(fēng)險分別為2.74×10-8，1.5×10-8，2.15×10-10小于10-6即為可接受水平，非致癌危害商值小于1，致癌和非致癌風(fēng)險極小。沼渣生物菌肥可用于改良2,4-二氯苯酚污染土壤。