魏丹丹，謝中藝，楊帆帆，尹芬芬，黃新祥，張 盈

VI型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system，T6SS)存在于約25%的革蘭陰性細菌中，是2006年P(guān)ukatzki等[1]首次在霍亂弧菌(V.cholerae)中發(fā)現(xiàn)的一個細菌膜表面結(jié)構(gòu)類似于T4噬菌體，以一步法將效應(yīng)因子分泌至胞外的分泌系統(tǒng)[2]。T6SS可將毒性效應(yīng)物注入真核細胞或原核細胞，進而可被細菌用于破壞真核宿主細胞或?qū)蛊渌毦?，而表達T6SS的細菌自身可合成免疫蛋白，以防止自我中毒或成為周圍同類細菌群體的攻擊目標(biāo)[3]。T6SS自發(fā)現(xiàn)以來被認(rèn)為是革蘭氏陰性菌重要的毒力決定因子[4]。本文主要圍繞T6SS分泌裝置的結(jié)構(gòu)、表達及其功能來進行簡要綜述。

1 T6SS的結(jié)構(gòu)

在單個細菌基因組中常發(fā)現(xiàn)多個T6SS基因簇，例如副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)有2個T6SS基因簇[5]、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(B.pseudomallei)有6個T6SS基因簇[6]，它們的功能通常不具有冗余性。

T6SS是由13種VI型分泌系統(tǒng)核心結(jié)構(gòu)蛋白(Tss)組成的收縮裝置[7]。這個收縮裝置由3個主要復(fù)合物構(gòu)成：跨膜復(fù)合物、底板復(fù)合物和尾刺。以腸集聚性大腸埃希菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli，EAEC)為例(圖1)。

1.1跨膜復(fù)合物 該復(fù)合物通常由3種蛋白質(zhì)TssM，TssL和TssJ組成，構(gòu)成1個環(huán)狀的通道結(jié)構(gòu)跨越細胞膜[8]。TagL直接與TssL作用，通過單一的C-末端TMS(跨膜片段)將裝置錨定在膜上[9]。

1.2底板復(fù)合物 由TssE，TssF，TssG和TssK形成的底板復(fù)合物可連接跨膜復(fù)合物和尾部。組成底板復(fù)合物的這4種蛋白質(zhì)的比例是1∶2∶1∶6。TssG肽是核心，2個TssF與TssG一起形成三角形狀，而TssG的2個擴展區(qū)域分別與2個TssK三聚體連接[10]。

1.3尾刺 尾刺主要由溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)六聚體形成的內(nèi)管及其頂部的尖峰復(fù)合物組成。尖峰復(fù)合物由纈氨酸-甘氨酸重復(fù)蛋白G(VgrG)的三聚體組成，并且在大多數(shù)情況下與脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸重復(fù)蛋白(PAAR)共同組成[10]，Hcp和VgrG同時也是分泌至胞外的轉(zhuǎn)位蛋白[11]。由TssB-TssC(VipA/VipB)組成的收縮鞘圍繞著尾刺[12]。尾部的組裝需要TssA，其與基板復(fù)合物，內(nèi)管和鞘組件相互作用并穩(wěn)定尾管的遠端[13]。ClpB家族的AAA+ ATPase ClpV(TssH)可將尾管鞘解聚成單體成分再循環(huán)利用，并為尾管鞘的收縮提供能量[14]。在合適的條件下，T6SS可進行組裝并發(fā)揮功能。

除了上述核心結(jié)構(gòu)蛋白外，T6SS基因簇還編碼輔助蛋白，其包含組裝分泌裝置所需的組分，控制T6SS的表達或活性作用的調(diào)節(jié)蛋白等[15]。編碼效應(yīng)蛋白的基因下游總是編碼1個同源的免疫蛋白，被稱為效應(yīng)蛋白/免疫對。如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)T6SS免疫蛋白(Tse-specific immunity protein)Tsi1、Tsi3可以分別抑制T6SS效應(yīng)蛋白(Type six exported)Tse1、Tse3水解細菌細胞壁的肽聚糖[16]，而免疫蛋白Tsi2直接與胞質(zhì)效應(yīng)蛋白Tse2結(jié)合形成毒素-免疫蛋白模塊，而使效應(yīng)蛋白失活[17]。

IM為內(nèi)膜；OM為外膜；Tss為Type six secretion；PAAR為Proline-Alanine-Alanine-Arginine；VgrG為Valine-glycine repeat proteins G；Hcp為Hemolysin-coregulated protein；TagA為3-methyl-adenine DNA glycosylase A圖1 VI型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖[56]Fig.1 Schematic representation of the T6SS[56]

2 T6SS的表達

T6SS的表達及活性受到各種機制的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，其機制可歸類為環(huán)境因素及自身調(diào)控因素。在不同細菌及不同T6SS亞型中T6SS被誘導(dǎo)表達所需的條件往往各不相同，這可能與其發(fā)揮功能的環(huán)境相關(guān)。

2.1環(huán)境因素對T6SS表達的影響V.parahaemolyticus的T6SS1分泌蛋白Hcp1在模擬海洋環(huán)境條件(2% NaCl，23～30 ℃)下表達水平較高，而T6SS2分泌蛋白Hcp2卻在模擬宿主體內(nèi)環(huán)境條件(0.5% NaCl，37 ℃)下表達水平高，這可能與V.parahaemolyticus在海水中時T6SS1起作用，而在海洋動物體內(nèi)時T6SS2起作用有關(guān)[18]。

B.Pseudomallei的6個T6SS基因簇中只有T6SS2基因可在M9低鹽0.4%葡萄糖瓊脂造成的營養(yǎng)缺乏環(huán)境中表達。有趣的是亞抑菌濃度的喹諾酮類抗生素能夠促進此菌T6SS2、T6SS3、T6SS4、T6SS6的Hcp蛋白的表達，這提示了抗感染治療過程中抗生素足量使用的重要性[6]。

通過采用分裂GFP技術(shù)，Clemens DL等人確定了3種刺激物可以誘導(dǎo)新兇手弗朗西絲菌(Francisellanovicida)中T6SS IglA/IglB(VipA/VipB同系物)鞘的組裝，分別是1)巨噬細胞內(nèi)環(huán)境，2)在5% KCl環(huán)境下指數(shù)晚期的高密度細菌條件，3)放置在蓋玻片下。KCl是巨噬細胞內(nèi)的一種刺激物，在體外培養(yǎng)基中可能需要更高濃度的KCl以補償細胞內(nèi)其他刺激物的缺失，而蓋玻片下的誘導(dǎo)機制目前尚不清楚，可能涉及物理刺激，氧氣張力改變或其他環(huán)境影響[19]。

Yang X等人發(fā)現(xiàn)假結(jié)核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)中GDP/GTP焦磷酸激酶RelA是主要的ppGpp合成酶，細胞內(nèi)氨基酸缺乏時，RelA響應(yīng)于核糖體A位點中未攜帶氨基酸的tRNA而合成(p)ppGpp(鳥苷四磷酸和鳥苷五磷酸)，通過調(diào)節(jié)因子RovM和RovA上調(diào)T6SS4的表達，以對抗?fàn)I養(yǎng)饑餓引起的壓力[20]。

2.2細菌自身對T6SS表達的調(diào)控 細菌自身的調(diào)控對T6SS的表達及活性可總結(jié)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及翻譯后調(diào)控。1)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。腸集聚性大腸埃希菌EAEC在鐵富足的條件下，鐵攝取調(diào)控因子(ferric uptake regulator, Fur)可與sci1 T6SS基因簇啟動子附近的Fur盒序列結(jié)合，從而抑制T6SS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[21]。細菌增強子結(jié)合蛋白(bacterial enhancer binding proteins, bEBP)(即σ54激活蛋白)由T6SS毒力相關(guān)的分泌基因簇(Vas)編碼，可在T6SS啟動子區(qū)域與σ54結(jié)合序列結(jié)合從而激活轉(zhuǎn)錄[22]。 2)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。P.aeruginosaT6SS含3個溶血素共調(diào)節(jié)蛋白分泌島(Hemolysin-coregulated protein secretion island，HSI)，分別為HSI-Ⅰ、HSI-Ⅱ和HSI-Ⅲ，其中HSI-I直接受二甲基轉(zhuǎn)移酶RsmA的負(fù)調(diào)控。雙組份調(diào)控系統(tǒng)GacS/GacA通過調(diào)節(jié)下游小RNA(rsmY和rsmZ)的表達來調(diào)控靶基因的表達。rsmZ為RsmA的拮抗劑，而傳感器激酶RetS是RsmA調(diào)控途徑的一部分。RetS是一種多功能調(diào)節(jié)劑，RetS突變可導(dǎo)致T6SS的上調(diào)[23]。3)翻譯后調(diào)控。如P.aeruginosaH1-T6SS翻譯后受到絲蘇氨酸蛋白激酶PpkA的正向調(diào)控，而受到同源磷酸酶PppA的負(fù)向調(diào)控，這種控制是通過含有插頭結(jié)構(gòu)域(Forkhead-associated domain，F(xiàn)HA)的Fha1蛋白結(jié)構(gòu)中蘇氨酸殘基的磷酸化來實現(xiàn)的[24]。

3 T6SS的功能

3.1T6SS對細菌生物膜形成的影響 生物膜是細菌分泌脂質(zhì)蛋白、纖維蛋白、多糖基質(zhì)等形成大量聚集的細菌膜樣物，常粘附于固體表面。研究發(fā)現(xiàn)，T6SS突變菌形成生物膜能力顯著降低[25]。1)先前在E.coli和V.parahaemolyticus中的研究表明，T6SS本身編碼的蛋白具有促進生物膜形成的能力，如外膜脂蛋白SciN[26]。2)在生物膜生長期間T6SS相關(guān)蛋白被激活表達，與表征的生物膜因子如膜外多糖共同調(diào)節(jié)生物膜的形成[27]。3)T6SS也可通過影響生物膜相關(guān)基因發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，弗氏枸櫞酸桿菌CF74的T6SS缺陷株的全菌蛋白中FliC的表達明顯下調(diào)；在其培養(yǎng)上清中FliC、FlgK和FliD的表達下調(diào)均十分明顯[28]。EAEC中sci1 T6SS激活可促進粘附，生物膜形成與黏附相關(guān)基因有密切關(guān)系。

3.2T6SS對細菌抗菌作用的影響 近年來不斷有報道，革蘭陰性菌利用T6SS分泌的抗菌因子參與細菌間的生存競爭。T6SS可將效應(yīng)因子注射入鄰近的靶細胞以對抗其競爭者。對于T6SS裝置的作用方式近些年通過活細胞熒光顯微技術(shù)在V.cholerae、沙雷氏菌和E.coli中直接觀察到了TssB鞘運動，分為3個步驟：1)鞘聚合成完全伸展?fàn)顟B(tài)，2)快速收縮，3)ClpV的分解[29-31]。目前己知的與細菌競爭相關(guān)的T6SS效應(yīng)因子可歸為4類，分別為1)裂解細胞壁類效應(yīng)因子，如水解肽聚糖的酰胺酶Tse1、多糖酵解酶Tse3[32]；2)損傷細胞膜類效應(yīng)因子，如直接水解細胞膜脂質(zhì)成分的磷脂酶效應(yīng)因子Tle家族[33]，刺入細胞膜導(dǎo)致滲透壓失衡的穿孔蛋白Colicin[34]；3)降解核酸效應(yīng)因子，如Rhs(Rearrangement hotspot)蛋白，編碼效應(yīng)因子C端核酸內(nèi)切酶區(qū)域，可降解靶細胞DNA[35]；4)生長抑制因子如NAD(P)+糖基水解酶等[36]。其中針對于細胞膜的效應(yīng)因子也意味著對真核細胞膜起作用。

細菌在感染過程中往往需要比原土著菌群有更強的競爭優(yōu)勢以競爭營養(yǎng)和生存空間。Fu Y等[37]觀察到T6SS賦予V.cholerae特別的定植競爭優(yōu)勢，并且該優(yōu)勢不依賴于抗真核效應(yīng)物VgrG1，表明T6SS可能通過其它效應(yīng)物作用于常駐的共生細菌物種。近期研究表明小鼠模型中V.cholerae的T6SS確實能夠殺死共生菌，并且這種抗菌活性有利于V.cholerae在小鼠體內(nèi)的定植[38]。還有研究表明鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)在腸道中的成功定植需要沙門氏菌致病島-6(SPI-6)編碼的T6SS。在體外環(huán)境中，膽汁鹽可增加S.TyphimuriumSPI-6的抗菌活性，使其以T6SS依賴的方式殺死共生細菌。Hcp1是在體外殺死產(chǎn)氧克雷伯菌的必要條件，且該活性是由Hcp1與抗菌酰胺酶Tae4的特異性相互作用介導(dǎo)的[39]。Hsieh PF等[40]的體外實驗也證實了肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)胞內(nèi)增殖蛋白F1-2(Intracellular multiplication protein F，IcmF1-2)和Hcp在細菌種內(nèi)和種間殺傷作用中是必需的。

3.3T6SS影響細菌對真核細胞的致病力 細菌感染宿主的過程中需要克服宿主的免疫防御機制，T6SS在此過程中發(fā)揮著重要的作用。迄今為止發(fā)現(xiàn)的T6SS抗真核效應(yīng)因子可分為兩類：第一類為VgrG蛋白的亞類。如V.choleraeVgrG1中的C末端肌動蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)域[41]和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)VgrG1中的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域?qū)φ婧怂拗骷毎哂屑毎拘宰饔肹42]。第二類是獨立靶向宿主細胞的毒素。V.choleraVasX的N-末端PH同源結(jié)構(gòu)域(Pleckstrin homology domain)可能涉及結(jié)合宿主膜脂質(zhì)，從而干擾宿主磷酸肌醇代謝和信號傳導(dǎo)[43]。另外效應(yīng)蛋白Tle5A和Tle5B結(jié)合絲蘇氨酸激酶Akt也可促進P.aeruginosa內(nèi)化作用[44]。

3.3.1對上皮細胞的作用 多數(shù)細菌雖然被認(rèn)為是細胞外病原體，但能夠侵入非吞噬細胞，如粘膜上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞。免疫逃逸的機制之一是細菌逃避到無吞噬作用的宿主細胞中，以躲避宿主的免疫系統(tǒng)，成功感染并在宿主體內(nèi)持續(xù)存在，通過緊密的上皮細胞屏障侵入更深的組織[45]。

首先細菌黏附于內(nèi)皮細胞，近期關(guān)于K.pneumoniae的研究表明在icmF1和icmF2缺陷時顯示出1型菌毛的表達降低，對結(jié)腸直腸上皮細胞的粘附和侵襲降低，并且在體內(nèi)競爭力減弱[40]。其次細菌侵襲進入內(nèi)皮細胞，最常見的內(nèi)化作用為改變肌動蛋白重塑機制以操縱細胞骨架生成富含肌動蛋白的細胞表面突起，促進粘附細菌的內(nèi)化。此外微管也參與了細菌的內(nèi)化。據(jù)報道秋水仙堿或諾考達唑抑制微管形成后，H2-T6SS分泌的VgrG2b蛋白促進P.aeruginosa內(nèi)化進入上皮細胞的作用被抑制[46]。研究表明將E.coliK1的Hcp1蛋白純化后干預(yù)人腦微血管內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)Hcp1蛋白不需要易位到細胞內(nèi)部也可誘導(dǎo)肌動蛋白細胞骨架重排和細胞凋亡[47]。

3.3.2對巨噬細胞的作用 細菌T6SS與宿主巨噬細胞之間的作用，可歸為4類：1)操控宿主細胞骨架重排抑制吞噬。多種細菌中證實T6SS可通過改變巨噬細胞骨架結(jié)構(gòu)從而抵抗吞噬作用。新洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)T6SS效應(yīng)物TecA使Rho GTP酶脫去酰胺基，破壞巨噬細胞肌動蛋白細胞骨架并激活Pyrin炎癥小體引發(fā)炎癥反應(yīng)[48]。2)抵抗巨噬細胞內(nèi)活性氧(ROS)的殺傷進行免疫逃逸。據(jù)Wan B等人的報道腸出血型大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli, EHEC)以T6SS依賴的方式分泌效應(yīng)物KatN(含錳的過氧化氫酶)。RNA聚合酶σ因子RpoS和調(diào)控因子OxyR可以促進katN的表達，而H-NS可抑制其表達。EHEC被巨噬細胞吞噬后，KatN可分泌到宿主細胞胞漿中，導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平降低，促進EHEC在巨噬細胞內(nèi)存活[49]。此外，Y.pseudotuberculosisT6SS4分泌的Zn+結(jié)合蛋白底物YezP以結(jié)合鋅離子等方式逃避巨噬細胞的殺傷[50]。3)引起宿主細胞死亡。P.aeruginosaH2-T6SS的分泌蛋白磷脂酶TplE具有一個類似于真核PGAP1蛋白的結(jié)構(gòu)域，可定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并通過激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)，從而促進自噬[51]。在鼠巨噬細胞中，遲鈍愛德華菌(E.tarda)上調(diào)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)/T6SS基因從而增強細菌毒力，使其可在巨噬細胞內(nèi)復(fù)制并誘導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)依賴的細胞凋亡[52]。4)引發(fā)炎癥應(yīng)答。Chen H等[53]發(fā)現(xiàn)E.tardaT6SS效應(yīng)物EvpP可抑制細胞質(zhì)Ca2+的增加，在MAPK-JNK的上游調(diào)節(jié)NLRP3炎性體，進一步影響對caspase-1的激活。A.hydrophila中也證實Hcp能夠與巨噬細胞結(jié)合并誘導(dǎo)IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β的產(chǎn)生，從而影響巨噬細胞的活化，并招募其他細胞免疫成分[54]。

4 展 望

近年來，對于T6SS基因、結(jié)構(gòu)、調(diào)控、功能等各個方面的研究越來越深入。由于電子顯微鏡的應(yīng)用，不僅可確認(rèn)T6SS各結(jié)構(gòu)組成，對于其運動方式也可進行更加直觀的觀察[10,55]。然而T6SS在不同的細菌中的功能表型有著很大的差異。細菌內(nèi)部對于T6SS功能的調(diào)控，以及T6SS到底涉及細菌哪些生理功能還需要進一步的探究。最重要的是雖然在多種細菌中均有報道T6SS在細菌對宿主的致病力中起著重要的作用[49]，然而細菌T6SS是通過怎樣的機制對宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，宿主又是通過怎樣的免疫機制應(yīng)對的，這些問題依然值得關(guān)注，致病機理和防控措施問題的探討對于感染性疾病的防治具有重要的意義。

利益沖突：無