陳 貝，張 鴿，喬 琨，許 旻，蔡水淋，廖登遠(yuǎn)，劉智禹*

1福建省水產(chǎn)研究所 國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)分中心(廈門)福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361013；2集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，廈門 361021

河豚魚肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，尤其在亞洲國家被視為美味。雙斑東方鲀是福建省養(yǎng)殖河豚的主要品種之一。養(yǎng)殖雙斑東方鲀品質(zhì)優(yōu)良、毒性較低，其中魚皮與魚肉均為無毒級(jí)別，可安全食用。目前雙斑東方鲀的加工尚處于起步摸索階段，加工制品種類少且加工深度不足。魚皮作為雙斑東方鲀的無毒部分，其深度加工利用和高附加值產(chǎn)品的研發(fā)，對(duì)于充分利用河豚魚資源，提高加工技術(shù)含量，調(diào)整河豚魚產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)都具有重要的意義。

水解膠原多肽能為人體膠原蛋白的合成提供優(yōu)質(zhì)的氨基酸原料，促進(jìn)皮膚膠原蛋白合成，提高皮膚保水能力，減少皺紋形成，延緩皮膚衰老，是一種優(yōu)質(zhì)的化妝品添加劑。河豚魚皮中蛋白質(zhì)含量占干重的80%以上，其中膠原蛋白占總蛋白質(zhì)的90%左右，是一種優(yōu)質(zhì)的膠原蛋白及膠原多肽原料。本研究以雙斑東方鲀魚皮為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用堿性蛋白酶酶解獲得雙斑東方鲀魚皮膠原多肽(Fugubimaculatuscollagen peptide，F(xiàn)BCP)，明確最佳酶解工藝，分析不同分子量FBCP的保濕和抗氧化性能，并對(duì)FBCP皮膚刺激性和眼刺激性進(jìn)行評(píng)估，為FBCP在化妝品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

堿性蛋白酶(B8360)購于北京索萊寶科技有限公司；豬膠原多肽粉(ARTHREDTMP Standardized)和牛膠原多肽粉(ARTHREDTMStandardized)購于嘉吉生化有限公司；鄰苯三酚、水楊酸、H2O2及其他常規(guī)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雙斑東方鲀(Fugubimaculatus)，購于漳州市漳浦縣福建鴻鲀水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：閩(浦漁2018)海漁苗種許字01號(hào)；成年新西蘭白兔，體重2.0～2.5 kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采購及刺激性評(píng)價(jià)均委托國家化妝品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.3 儀器

絞肉機(jī)(MM12，廣東韶關(guān)市食品機(jī)械廠)，真空冷凍干燥機(jī)(SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技股份有限公司)，酶標(biāo)儀(M200 Pro，Tecan)，凱氏定氮儀(KjeltecTM400，F(xiàn)OSS)，pH計(jì)(MID5X，METTLER TOLEDO)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技股份有限公司)，分析天平(BSA224S，SRTORIUS)，多探頭皮膚測(cè)試系統(tǒng)(MPA4，CK公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9146A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 雙斑東方鲀魚皮基本組分分析

分別按照GB5009.5-2010、IS03496：1994(E)、GB/T5009.3-2010、GB5009.6-2003和GB5009.4-2010，測(cè)定樣品的粗蛋白含量、羥脯氨酸含量、水分含量、脂肪含量和灰分含量。

2.2 FBCP提取工藝

雙斑東方鲀經(jīng)皮肉分離后，去除魚鰭，之后將干凈的魚皮切成(約0.5×0.5 cm2)碎片，冷凍干燥，備用。凍干處理后的魚皮浸泡濃度為9% NaCl溶液(1∶30)[1]，連續(xù)攪拌24 h，每12 h換一次NaCl溶液，浸泡后用蒸餾水水洗魚并用尼龍紗過濾，重復(fù)3次，除去非膠原蛋白。

魚皮經(jīng)過預(yù)處理后，按一定的料液比加入純水，調(diào)節(jié)pH和酶解溫度，加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解。酶解完成后，100 ℃將酶滅活10 min，待酶解液冷卻至室溫，調(diào)節(jié)酶解液的pH至中性，離心取上清，經(jīng)超濾膜分離得到4種不同分子量的雙斑東方鲀魚皮膠原多肽組分。冷凍干燥獲得膠原多肽粉末。

2.3 FBCP提取單因素實(shí)驗(yàn)

以肽得率為指標(biāo)，研究酶用量、溫度、時(shí)間、pH四個(gè)因素對(duì)雙斑東方鲀魚皮酶解效果的影響，以確定各因素的最佳酶解條件。酶解的基本條件為加酶量4 000 U/g，溫度50 ℃，時(shí)間4 h，pH 9.0，料液比1∶10。選擇固料比1∶10為固定參數(shù)，改變其他任意一個(gè)條件，分別考察酶添加量(4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g)、酶解溫度(45、50、55、60、65 ℃)、酶解時(shí)間(1、2、3、4、5 h)和pH(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)對(duì)酶解效果的影響。

2.4 FBCP提取正交試驗(yàn)

本研究根據(jù)以上的單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，選擇固料比1∶10為固定參數(shù)，以肽得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值、加酶量的四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)L9(34)(表1)。

表1 正交因素水平

2.5 肽得率的測(cè)定

采用三氯乙酸(TCA)沉淀法結(jié)合甲醛滴定法測(cè)得肽得率[2]。主要原理是利用TCA沉淀酶解液中的大分子蛋白質(zhì)，繼而以凱氏定氮法測(cè)定上清液中可溶性氮的含量，隨后減去上清中氨態(tài)氮(游離氨基酸)的含量，再與酶解樣品中的總氮量相比，從而確定其多肽得率。計(jì)算公如下：

蛋白肽得率=

具體方法為取酶滅活后的膠原多肽提取液10 mL，加入等量30% TCA溶液，充分混勻，靜置10 min，4 000 rpm離心10 min。取2 mL離心后的上清液，凱氏定氮測(cè)其蛋白質(zhì)含量，再取2 mL上清液定容至10 mL，以酚酞作指示劑取5 mL稀釋液加入中性甲醛溶液2 mL混勻，于0.05 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定至紫紅色(pH值8.7～9.0)。記錄消耗氫氧化鈉體積。氨態(tài)氮含量計(jì)算公式如下：

其中，V1：待測(cè)液消耗氫氧化鈉體積，單位為毫升(mL)；V2：滴定空白對(duì)照消耗氫氧化鈉體積，單位為毫升(mL)；c：標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的摩爾濃度；0.014：與1.00mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[(NAOH)=1.00 mol/L]相當(dāng)于氮的質(zhì)量(g)；m：稱取式樣的質(zhì)量(g)；V3：式樣稀釋液的取用量(mL)；V4：式樣稀釋液的定容體積(mL)。

2.6 FBCP化妝品功效性研究

依次通過截留分子量為10、5、1 kDa的超濾膜，分離得到四種不同分子量的河鲀魚膠原多肽組分FBCP1(Mw<1 kDa)、FBCP2(1 kDa10 kDa)。經(jīng)凍干得到四種組分河豚魚膠原多肽粉末。同時(shí)購買市售豬皮和牛皮來源的膠原多肽，同雙斑東方鲀魚皮膠原多肽進(jìn)行對(duì)比。

2.6.1 吸濕保濕功效研究

將不同膠原多肽粉末置于105 ℃的烘箱中充分干燥至衡重。選用兩個(gè)相同大小的干燥器，分別在底部加入飽和硫酸銨和飽和碳酸鉀溶液，使之分別維持70%的相對(duì)濕度(RH)及40%的相對(duì)濕度(RH)，其中RH=70%模擬夏天空調(diào)房最佳濕度，RH=40%模擬冬天空調(diào)房最佳濕度。膠原多肽各取1 g分別置于兩個(gè)干燥器內(nèi)，在保持環(huán)境溫度為25 ℃左右的條件下放置2、4、6、8、10 h，取出后精確稱量并計(jì)算得出吸濕率[1,3]。計(jì)算公式為：

其中：W0：放置前樣品質(zhì)量(g)；Wn：放置后樣品質(zhì)量(g)。

膠原多肽各取1 g分別加入2 mL蒸餾水充分溶解后置于干燥器內(nèi)，放置2、4、6、8、10 h，稱量并計(jì)算出保濕率[1,3]。計(jì)算公式為：

其中：H0：放置前樣品質(zhì)量(g)；Hn：放置后樣品質(zhì)量(g)。

2.6.2 抗氧化功效研究

其中：A0：鄰苯三酚的自氧化速率；A1：第1 min的OD值；A4：第4 min的OD值。

膠原多肽抑制鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：分別依次加入50 mmol/L、pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.7 mL以及不同濃度的膠原多肽溶液4 mL，于25 ℃水浴鍋中保溫10 min，取出后加入0.3 mL已預(yù)熱的鄰苯三酚立即混勻并同上測(cè)定OD值并計(jì)算自氧化速率ΔA。膠原多肽對(duì)超氧離子的清除率計(jì)算公式如下：

其中：ΔA0：鄰苯三酚的自氧化速率；ΔA：加入待膠原多肽后鄰苯三酚的自氧化速率。

2.6.2.2 羥基自由基(·OH)清除能力測(cè)定

測(cè)定方法參考Zhang和Ding等方法[4-6]，具體如下，取10 mL試管依次加入FeSO4(9 mmol/L)l mL、水楊酸-乙醇(9 mmol/L)l mL、不同濃度膠原多肽溶液l mL，混勻后加入8.8 mmol/L H2O2l mL啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴加熱反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參照，在510 nm下測(cè)量吸光值。以不添加H2O2的溶液為待測(cè)溶液的本底吸收值。清除率計(jì)算公式如下：

其中：A0：空白對(duì)照液的吸光度；Ax：加入膠原多肽后的吸光度；Ax0：不加顯色劑H2O2的待測(cè)溶液本底的吸光度。

2.6.2.3 二苯代苦味酰自由基(DPPH)清除能力測(cè)定

具體方法[5,7]為，取5 mL離心管加入不同濃度膠原多肽溶液2 mL，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液，混勻避光反應(yīng)20 min，在517 mn測(cè)得吸光值。以乙醇與不同濃度膠原多肽溶液等量混合液為對(duì)照管，DPPH溶液與去離子水等量混合后為空白管，清除率計(jì)算公式如下所示：

其中：Ax：加入待測(cè)樣品后的吸光度；Ax0：待測(cè)樣品與乙醇混合液的本底吸光值；A0：DPPH溶液與去離子水等量混合液的吸光值。

2.7 FBCP的皮膚刺激及眼刺激評(píng)價(jià)

2.7.1 多次皮膚刺激實(shí)驗(yàn)

采用自體對(duì)照方式，選擇健康、成年、皮膚無損的白色家兔4只，試驗(yàn)前24 h用8%硫化鈉將試驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)背毛去除，去除面積左右各約3 cm×3 cm，將0.5 mL 50%(W/V)雙斑東方鲀魚皮膠原多肽溶液涂抹于一側(cè)，另一側(cè)作為空白對(duì)照，每天涂抹一次，涂抹后清洗觀察皮膚狀態(tài)，連續(xù)涂抹觀察14天。第二天開始，每次涂抹前剪毛，用水清除殘留受試物。涂抹1 h后觀察結(jié)果，根據(jù)2015年版《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》[8]中皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算給藥動(dòng)物積分均值，并對(duì)照皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)分表判定皮膚刺激強(qiáng)度。

2.7.2 急性眼刺激試驗(yàn)

按照《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》2015版所示方法[8]進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)開始前24 h對(duì)受試動(dòng)物眼睛進(jìn)行檢查，選用眼睛健康的受試動(dòng)物，將50%(W/V)雙斑東方鲀魚皮膠原多肽溶液滴入受試動(dòng)物一只眼睛結(jié)膜囊中，使上、下眼瞼被動(dòng)閉合1 s，另一側(cè)眼睛作空白對(duì)照對(duì)照，30 s后用水安全流速?zèng)_洗30 s。滴入受試物后分別l、24、48、72 h以及第4天、第7天對(duì)受試動(dòng)物眼睛進(jìn)行檢查，根據(jù)眼損害的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表記錄受試動(dòng)物眼刺激反應(yīng)進(jìn)行積分，若觀察72 h未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，即可終止試驗(yàn)。若發(fā)現(xiàn)眼刺激作用且7天內(nèi)不可恢復(fù)，則為確定該損害的可逆性或不可逆性，需延長觀察時(shí)間。根據(jù)受試動(dòng)物角膜、虹膜或結(jié)膜分別在24、48或72 h觀察點(diǎn)的刺激反應(yīng)的最高積分和恢復(fù)時(shí)間，根據(jù)眼刺激反應(yīng)分級(jí)表確定受試物對(duì)眼的刺激強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 雙斑東方鲀魚皮基本組分分析

雙斑東方鲀魚皮中，膠原蛋白含量占魚皮的23.80%，占粗蛋白的88.08%(表2)?？梢娔z原蛋白是雙斑東方鲀魚皮的主要蛋白質(zhì)，具有極高的利用價(jià)值，這為提取膠原多肽及研究河鲀魚皮膠原多肽活性提供了研究基礎(chǔ)。Zhang等[9]測(cè)定了暗紋東方鲀魚皮基本成分：水分含量75.65%、粗蛋白含量96.53%(干重)、膠原蛋白含量88.50%(干重)，膠原蛋白占總蛋白含量的91.68%。任俊風(fēng)測(cè)定紅鰭東方鲀魚皮基本成分，總蛋白含量97.3%，膠原蛋白含量87.6%，膠原蛋白占總蛋白含量的90%[10]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道其他品種河鲀魚皮基本成分結(jié)果相似，這間接表明了本研究結(jié)果的真實(shí)可靠性，亦表明雙斑東方鲀魚皮是膠原蛋白的良好來源，也為后續(xù)膠原多肽的提取實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

表2 雙斑東方鲀魚皮基本成分

3.2 FBCP提取單因素分析

結(jié)果如圖1所示，伴隨溫度的升高，肽得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。在45～50 ℃的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度的升高促使酶促反應(yīng)速度加快，能高效酶解河鲀魚皮，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)膠原多肽得率顯著降低。隨著酶解時(shí)間的延長，肽得率逐漸上升，當(dāng)酶解時(shí)間大于4 h時(shí)，肽得率無明顯差異。因此初步確定4 h為適宜酶解時(shí)間。在pH值為9.0時(shí)肽得率達(dá)到最高，低于9.0或高于9.0肽得率均有所下降。隨著加酶量增加，肽得率呈現(xiàn)一種先上升后下降的趨勢(shì)。酶添加量為8 000 U/g時(shí)，肽得率達(dá)到最大值，由此選擇8 000 U/g為酶解反應(yīng)的適宜加酶量。因此，最終選擇溫度50 ℃，酶解4 h，pH9.0，8 000 U/g的加酶量作為正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

圖1 酶解條件對(duì)肽得率的影響

3.3 FBCP正交試驗(yàn)分析

通過正交試驗(yàn)分析，可知該實(shí)驗(yàn)中對(duì)肽得率的影響主次順序?yàn)闇囟?加酶量>酶解pH值>時(shí)間(表3)。對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析可知(表4)，溫度、加酶量、酶解pH三因素均達(dá)到極顯著水平，酶解時(shí)間對(duì)肽得率無顯著影響，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和時(shí)間成本雙重方面考慮，選擇酶解時(shí)間為4 h，因此通過極差分析得出的河鲀魚皮膠原多肽的最佳提取工藝為A2B3D2C2，即料液比1∶10、酶解溫度50 ℃、加酶量8 000 U/g、酶解pH值9.0、酶解時(shí)間4 h。采用上述工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，三次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得的雙斑東方鲀魚皮膠原多肽的提取率分別為39.93%、39.65%、39.37%。

表3 正交實(shí)驗(yàn)分析表

表4 方差分析表

3.4 雙斑東方鲀魚皮膠原多肽在化妝品中的功效性研究

3.4.1 吸濕保濕功效測(cè)定

在高濕度環(huán)境(RH=70%)和低濕度環(huán)境(RH=40%)中，不同試樣的吸濕率都隨時(shí)間的推移而逐漸增大(圖2)，說明各試樣均具有良好的吸濕性。吸濕10 h后，甘油的吸濕率最高，其次為FBCP1，分別為4.54%±0.12%(RH=40%)和4.13%±0.08%(RH=70%)，F(xiàn)BCP1的吸濕率均高于其余膠原多肽，且FBCP1的吸濕率在不同濕度環(huán)境下變化不顯著。由各試樣的保濕率測(cè)定結(jié)果可知，在RH為40%和70%環(huán)境下，各試樣具有一定的保濕能力。甘油保濕率最高，F(xiàn)BCP各組分中FBCP1較其余膠原多肽同樣具有較好的保濕效率。

圖2 不同濕度條件下吸濕率與保濕率測(cè)定

從上述吸濕保濕活性測(cè)定結(jié)果看出，四種組分中FBCP1具有更優(yōu)越的吸濕性和保濕性。吸濕性是物質(zhì)吸附或攝取水分的能力，保濕性是物質(zhì)保持水分的能力，多肽可通過氨基酸側(cè)鏈和蛋白質(zhì)的肽鍵與水分子間的相互作用，防止水分蒸發(fā)，是良好的吸濕和保濕劑[11]。不同多肽分子對(duì)水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不同[12]。FBCP1分子量小，可能結(jié)構(gòu)上相較于其他三種組分暴露出更多的親水基團(tuán)(氨基、羧基和羥基等)，對(duì)水分子結(jié)合力強(qiáng)，吸收水分和保持水分的能力也較大。

3.4.2 抗氧化功效測(cè)定

表5 不同膠原多肽及谷胱甘肽自由基清除IC50比較

圖3 FBCP對(duì)自由基的清除作用

3.5 雙斑東方鲀魚皮膠原多肽多次皮膚刺激及眼刺激測(cè)定

3.5.1 多次皮膚刺激實(shí)驗(yàn)

多次皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果如下表所示，涂抹FBCP溶液14天后，4只受試兔皮膚均未見紅斑和水腫，計(jì)算獲得每天每只動(dòng)物的積分均值為0，因此涂抹50%雙斑東方鲀膠原多肽溶液對(duì)皮膚無刺激性。

表6 FBCP皮膚刺激性測(cè)定

3.5.2 急性眼刺激實(shí)驗(yàn)

急性眼刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示，滴入50%(W/V)FBCP溶液后，3只受試兔眼睛的結(jié)膜未見充血，角膜未見渾濁異常，虹膜正常，觀察點(diǎn)的刺激反應(yīng)的最高積分均為0，因此滴入50%雙斑東方鲀膠原多肽溶液對(duì)眼無刺激性。

表7 FBCP急性眼刺激測(cè)定

本研究通過多次皮膚刺激實(shí)驗(yàn)和急性眼刺激實(shí)驗(yàn)等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定FBCP的刺激性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明FBCP無刺激性。大量研究已證實(shí)了魚源水解膠原多肽的無刺激性，Li等[16]開展了羅非魚魚皮膠原多肽復(fù)配潤膚霜的安全性研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明添加羅非魚魚皮膠原多肽的潤膚霜無任何刺激作用，Zhou等[17]研究了口服小分子魚膠原蛋白粉對(duì)改善女性面部膚質(zhì)的有效性和安全性，受試組面部皮膚的細(xì)紋、毛孔、紋理、紫質(zhì)、水份、油脂改善明顯，且無明顯不良反應(yīng)，具有較好的安全性和有效性。上述實(shí)驗(yàn)均表明魚皮膠原多肽作為護(hù)膚品原料的可行性，這為后續(xù)研制開發(fā)雙斑東方鲀魚皮膠原多肽化妝品奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用現(xiàn)代酶學(xué)技術(shù)，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，確定了制備具有較高肽得率的FBCP的最佳酶解工藝條件：堿性蛋白酶為水解酶，料液比1∶10、酶解溫度50 °C、加酶量8 000 U/g、酶解pH值9.0、酶解時(shí)間4 h。本研究提取的FBCP在抗氧化、體內(nèi)外保濕方面均有顯著效果。研究表明，F(xiàn)BCP1(<1kD)具有最佳的自由基清除能力和保濕吸濕能力。同時(shí)，F(xiàn)BCP不具有皮膚刺激性和眼刺激性，作用溫和，這為將來用于化妝品的添加劑提供理論基礎(chǔ)。