白 華，曹宏哲，劉鵬飛，周 帆，藏金萍，董金皋，張 康，邢繼紅

（河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

在植物中，MYB 轉(zhuǎn)錄因子超家族數(shù)量龐大且功能多樣，它們在不同組織和不同生理階段特異性表達(dá)，是植物發(fā)育、代謝和抗逆反應(yīng)體系中的關(guān)鍵因子［1-2］。R2R3-MYB 型轉(zhuǎn)錄因子是MYB 轉(zhuǎn)錄因子超家族中數(shù)量最多的成員，其包含2 個(gè)保守MYB結(jié)構(gòu)域，在植物初生和次生代謝、細(xì)胞形態(tài)建成、生長發(fā)育、抵抗生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［2-4］。R2R3-MYB 型轉(zhuǎn)錄因子中的一些蛋白能夠通過與TPL/TPRs（TOPLESS/TOPLESS-related proteins）蛋白互作，參與植物抗蟲、防御非生物脅迫和種子發(fā)育等多種過程［5］。

TPL/TPRs 蛋白是一類保守的植物轉(zhuǎn)錄輔抑制因子家族蛋白，包括TPL、TPR1、TPR2、TPR3 和TPR4。在植物中，TPL/TPRs 蛋白家族通過與乙烯反應(yīng)因子相關(guān)的反應(yīng)抑制基序（EAR motif）相互作用，參與調(diào)控植物生長發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)以及信號通路調(diào)節(jié)等一系列生理生化過程［6］。研究發(fā)現(xiàn)，TPL/TPR 轉(zhuǎn)錄輔抑制因子蛋白家族在茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、植物生長激素信號通路和獨(dú)角金內(nèi)酯信號通路中起非常重要的作用［7］。MYB44 轉(zhuǎn)錄因子在R2R3-MYB 型轉(zhuǎn)錄因子中研究最為深入，并含有EAR 基序。研究已明確MYB44 轉(zhuǎn)錄因子通過EAR 基序與TPL/TPRs 蛋白直接互作，從而抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步調(diào)控植物的發(fā)育、脅迫反應(yīng)和激素信號等［8］。研究發(fā)現(xiàn)，MYB44 與TPRs 形成復(fù)合物，并招募組蛋白去乙?；敢孕盘柗且蕾囆苑绞揭种频鞍琢姿崦?C（PP2Cs）基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)植株對干旱和鹽脅迫的耐受性［8-9］。此外，MYB44 參與調(diào)控多種植物抗逆信號通路，包括脫落酸介導(dǎo)的對非生物脅迫的耐受性、通過調(diào)控乙烯信號通路參與抵抗害蟲的作用以及通過水楊酸信號通路增強(qiáng)擬南芥對丁香假單胞菌番茄致病變種（PstDC3000）的抗性［10-11］。Causier 等人通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)，證實(shí)了EAR 基序在MYB44 與TPRs蛋白互作中具有重要作用，EAR 基序突變能阻斷AtMYB44 與TPRs 蛋白之間的互作［12-13］。目前，玉米中R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過對玉米R2R3-MYB 基因家族進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ZmMYB153 與MYB44 序列一致性最高，為63.54%（NCBI-blastp），且同樣含有EAR 基序。但是，ZmMYB153 與TPL/TPRs 的互作關(guān)系以及EAR 基序在其互作中的功能尚未明確。本研究擬利用酵母雙雜交技術(shù)對ZmMYB153與TPL/TPRs 的互作關(guān)系進(jìn)行分析驗(yàn)證，為闡明ZmMYB153 在玉米生長、發(fā)育和抵抗生物、非生物脅迫中的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

酵母雙雜交載體PGBKT7（BD）和PGADT7（AD）、酵母菌株AH109、玉米自交系B73 和擬南芥野生型Col-0，由河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存和提供。

1.2 ZmMYB153、ZmMYB153-mEAR 的酵母雙雜交載體的構(gòu)建

利用SDS 法，提取玉米自交系B73 的總RNA；利用TaKaRa cDNA 合成試劑盒，進(jìn)行其cDNA 的合成。使用ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR 的特異性上下游引物（表1），以玉米自交系B73 的cDNA 為模板，擴(kuò)增ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR。將ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR 分別與入門載體pBM27 連接，轉(zhuǎn)化Trans 5α，抗性篩選獲得的陽性克隆進(jìn)行菌落PCR 和測序鑒定后，與終載體BD、AD 進(jìn)行LR 重組反應(yīng)，經(jīng)PCR 和測序鑒定后獲得BD-ZmMYB153、AD-ZmMYB153、BD-ZmMYB153-mEAR、AD-ZmMYB153-mEAR。

1.3 TPL/TPRs 的酵母雙雜交載體的構(gòu)建

利用OMEGA 植物RNA 提取試劑盒，提取擬南芥Col-0 的總RNA；利用TaKaRa cDNA 合成試劑盒，進(jìn)行其cDNA 的合成。使用TPL/TPRs 特異性上下游引物（表1），擴(kuò)增TPL/TPRs 基因序列，并將其分別與入門載體pBM27 連接，進(jìn)行克隆、測序后獲TPL/TPRs 的入門載體TPL-pBM27、TPR1-pBM27、TPR2-pBM27、TPR3-pBM27 和TPR4-pBM27。利用LR 重組試劑盒，將TPL/TPRs 的入門載體分別與終載體BD、AD 進(jìn)行重組反應(yīng)，經(jīng)PCR 和測序鑒定后獲得TPL/TPRs 的酵母雙雜交載體。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 ZmMYB153、TPL/TPR 的自激活活性檢測

將5 μL 預(yù)冷的BD-ZmMYB153、BD-TPL、BD-TPR1、BD-TPR2、BD-TPR3、BD-TPR4 和空載體BD 分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)AH-109，涂布于-Trp 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 ～96 h。挑取BDZmMYB153、BD-TPL、BD-TPR1、BD-TPR2、BD-TPR3、BD-TPR4 和BD 的酵母菌落， 接種于5 mL 的-Trp 液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h，定量點(diǎn)于-Trp 和-Trp/-His 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 ～3 d。依據(jù)菌落生長情況，判定ZmMYB153、TPL/TPRs 的自激活活性。

1.5 ZmMYB153 與TPL/TPRs 的酵母雙雜交

將4 μL AD-ZmMYB153 質(zhì)粒分別與4 μL 的BD-TPL、BD-TPR1、BD-TPR2、BD-TPR3 和BDTPR4 質(zhì)粒組合，以及4 μL BD-ZmMYB153 質(zhì)粒分別與4 μL AD-TPL、AD-TPR1、AD-TPR2、ADTPR3 和AD-TPR4 質(zhì)粒組合，同時(shí)設(shè)對照組合ADZmMYB153+BD、AD+BD-TPL、AD+BD-TPR1、AD+BD-TPR2、AD+BD-TPR3、AD+BD-TPR4、BD-ZmMYB153+AD、BD+AD-TPL、BD+ADTPR1、BD+AD-TPR2、BD+AD-TPR3、BD+ADTPR4 和BD+AD，將各個(gè)組合分別轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。將酵母細(xì)胞涂布在-Leu/-Trp 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 ～3 d 直至長出酵母克隆。挑取雙缺培養(yǎng)基上生長較好的酵母單克隆震蕩培養(yǎng)至OD600為0.2，然后將原菌液稀釋10 倍和100 倍，各吸取5 μL 置于-Leu/-Trp、-Leu/-Trp/-His 和-Leu/-Trp/-His+3-AT培養(yǎng)基上，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 ～3 d 觀察酵母生長情況。

1.6 EAR 突變對ZmMYB153 與TPL/TPRs 互作的影響

利用同樣的方法，將ZmMYB153-mEAR 與上述發(fā)生互作的TPR2 質(zhì)粒組合，轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)設(shè)ZmMYB153 與其互作的TPR2 組合為陽性對照設(shè)置以及相對應(yīng)的陰性對照組合，觀察各組合的酵母菌落在-Leu/-Trp、-Leu/-Trp/-His 和-Leu/-Trp/-His+3-AT 培養(yǎng)基上的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR 酵母雙雜交載體的構(gòu)建

根據(jù)圖1 的設(shè)計(jì)， 使用ZmMYB153 及ZmMYB153-mEAR 的特異性上下游引物擴(kuò)增得到ZmMYB153（1 038 bp）和ZmMYB153-mEAR（1 014 bp） 的基因片段，與入門載體pBM27 連接，獲得其入門載體ZmMYB153-pBM27 和ZmMYB153-mEAR-pBM27，并將其分別與目標(biāo)載體PGBKT7 和PGADT7 進(jìn)行重組反應(yīng)，菌落PCR 鑒定均獲得了目的條帶（圖1）。經(jīng)測序鑒定后獲得目的載體ADZmMYB153、BD-ZmMYB153、AD-ZmMYB153-mEAR 和BD-ZmMYB153-mEAR。

圖1 ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR 酵母雙雜交 載體的構(gòu)建Fig.1 Vector construction of ZmMYB153 and ZmMYB153-mEAR

2.2 TPL/TPRs 酵母雙雜交載體的構(gòu)建

利用TPL/TPRs 特異性上下游引物擴(kuò)增得到TPL （1 032 bp）、TPR1（1 029 bp）、TPR2（1 005 bp）、 TPR3（1 005 bp）和TPR4（1 032 bp）的基因片段， 與入門載體pBM27 連接，獲得這些基因的入門載體 TPL-pBM27、TPR1-pBM27、TPR2-pBM27、TPR3-pBM27 和TPR4-pBM27。將這些基因的入門載體分別與目標(biāo)載體PGADT7 和PGBKT7 重組，菌落PCR 鑒定均獲得了目的條帶（圖2）。經(jīng)測序鑒定后獲得目的基因的酵母雙雜交載體AD-TPL、BD-TPL、AD-TPR1、BD-TPR1、AD-TPR2、BDTPR2、AD-TPR3、BD-TPR3、AD-TPR4 和BDTPR4。

圖2 TPL/TPRs 酵母雙雜交載體的構(gòu)建Fig.2 Vector construction of TPL/TPRs

2.3 ZmMYB153 和TPL/TPRs 的自激活活性檢測

對ZmMYB153、TPL/TPRs 的自激活活性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化了BD-ZmMYB153、BD-TPL、BDTPR1、BD-TPR2、BD-TPR3、BD-TPR4 和 空 載體BD 的酵母均能夠在-Trp 培養(yǎng)基上生長良好，轉(zhuǎn)化了BD-TPR2 和BD-TPR4 的酵母均能夠在-Trp/-His 和-Trp/-His+x-α-gal 的培養(yǎng)基上生長良好，且在-Trp/-His+x-α-gal 的培養(yǎng)基上顯藍(lán)色，說明BDTPR2 和BD-TPR4 有自激活活性（見圖3）。

圖3 ZmMYB153、TPL/TPRs 的自激活活性檢測Fig.3 Self-activation activity of ZmMYB153 and TPL/TPRs

2.4 ZmMYB153 與TPL/TPRs 的酵母雙雜交互作鑒定

利用酵母雙雜交技術(shù)，檢測ZmMYB153 與TPL/TPRs 蛋白之間的互作關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共同轉(zhuǎn)化AD-ZmMYB153+BD-TPR2、BD-ZmMYB153+ AD-TPR2 組合的酵母菌落在-Lue/-Trp、-Lue/-Trp/ -His 和-Lue/-Trp/-His+3-AT (10 mmol/L) 培養(yǎng)基上均能正常生長；而共同轉(zhuǎn)化AD-ZmMYB153+BD -AtTPR4 組合的酵母菌落能夠在-Leu/-Trp、-Leu/ -Trp/-His 培養(yǎng)基上均能正常生長，不能在-Lue/ -Trp/-His+3-AT (10 mmol/L)培養(yǎng)基上正常生長；其他組合的酵母菌落以及陰性對照組合的酵母菌落只能在-LT 培養(yǎng)基上正常生長，而不能在-Lue/-Trp/-His和-Lue/-Trp/-His+3-AT (10 mmol/L) 培養(yǎng)基上正常生長（圖4）。表明ZmMYB153 與AtTPR2 在酵母細(xì)胞中能夠直接互作。

圖4 ZmMYB153 與TPL/TPRs 的酵母雙雜交結(jié)果Fig.4 Yeast two-hybrid of ZmMYB153 and TPL/TPR

2.5 EAR 突變對ZmMYB153 與TPR2 互作的影響

利用酵母雙雜交技術(shù)，檢測EAR 突變對ZmMYB153 與TPR2 互作的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陽性對照相比，試驗(yàn)組合AD-ZmMYB153-mEAR+BDTPR2、BD-ZmMYB153-mEAR+AD-TPR2 的酵母菌落在-Lue/-Trp/-His+3-AT(10 mmol/L)的培養(yǎng)基上均未能生長（見圖5）。表明ZmMYB153-mEAR 與AtTPR2 不互作，同時(shí)說明EAR 基序是ZmMYB153與AtTPR2 蛋白在酵母中互作的關(guān)鍵位點(diǎn)。

圖5 EAR 突變對ZmMYB153 與TPR2 互作的影響Fig.5 Effect of EAR motif mutation on interaction between ZmMYB153 and TPR2

3 結(jié)論與討論

R2R3-MYB 蛋白在植物中起到非常重要的作用，MYB44 屬于R2R3-MYB 蛋白家族的第22 亞家族，現(xiàn)已明確AtMYB44 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素和生長素相關(guān)基因的表達(dá)參與N-3-氧代-己酰-高絲氨酸內(nèi)酯介導(dǎo)擬南芥的初級根生長［14］；AtMYB44基因在植株干旱、低溫和高鹽等各種非生物脅迫下被活化表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗逆性［9,15］；AtMYB44與ABA 受體PYR1-LIKE8（PYL8）的相互作用還介導(dǎo)葉片衰老過程并對外界的刺激和傷害作出反 應(yīng)［16］。此外，在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)BnMYB44 可能有助于甘藍(lán)型油菜抵抗干旱和鹽脅迫，StMYB44通過抑制馬鈴薯中PHOSPHATE1 的表達(dá)來負(fù)調(diào)節(jié)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)植物吸收無機(jī)磷酸鹽（Pi）以滿足植物各種結(jié)構(gòu)和生理功能對磷的需求［17-18］。

在擬南芥中，AtMYB44 與TPL/TPRs 蛋白家族中的TPR1 和TPR3 有相互作用的關(guān)系，參與調(diào)控?cái)M南芥種子發(fā)育、抵抗PstDC3000、灰葡萄孢和蚜蟲等生物脅迫過程以及對干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫的多種過程，其主要機(jī)制是LSLSL 型乙烯反應(yīng)元件結(jié)合因子相關(guān)的兩親抑制基序（EAR）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄［19］。在擬南芥中證明了EAR 阻遏物通過招募染色質(zhì)重塑因子的模型（通過募集染色質(zhì)修飾劑實(shí)現(xiàn)EAR 介導(dǎo)的抑制模型），促進(jìn)基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AtMYB44 與ZmMYB153 同源，但其與TPL/TPRs 之間的互作關(guān)系及其在玉米中的調(diào)控機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果為闡明ZmMYB153 在玉米生長、發(fā)育和抵抗生物、非生物脅迫中的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

植物轉(zhuǎn)錄輔抑制因子TPL/TPRs 家族蛋白調(diào)節(jié)多種過程中的基因表達(dá)，在水稻中LxLxL 類型EAR基序以疏水鍵為主要作用結(jié)合OsTPR2 的TPD 單體的CTLH 口袋［20-23］。TPL/TPRs 家族蛋白N 末端含有LisH 和CTLH 結(jié)構(gòu)域，而LisH 和CTLH 結(jié)構(gòu)域已被證明能促進(jìn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，它可能在結(jié)合伴侶蛋白中起共同作用［24］。乙?；D(zhuǎn)移酶PopP2 通過假定的EAR 基序，可與對茄形青枯菌（Pseudomonas solanacearum）具有抗性的免疫受體RRS1 DNA 結(jié)合域結(jié)合并對其進(jìn)行乙?；?，導(dǎo)致RRS1-DNA 結(jié)合減少，從而激活植物的免疫 力［25］。此外，EAR 阻遏物的功能可能與磷酸化和泛素化有關(guān)［20］。本研究初步確定了ZmMYB153 與TPL/TPRs 之間的相互作用，推測ZmMYB153 通過自身的LSLSL 型EAR 基序招募TPL/TPRs 家族中一些蛋白的LisH 或CTLH 結(jié)構(gòu)域，形成復(fù)合體，從而抑制相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步參與玉米生長發(fā)育以及響應(yīng)生物和非生物脅迫過程。本試驗(yàn)將對ZmMYB153 調(diào)控的靶基因及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，為闡明ZmMYB153 在玉米生長、發(fā)育和抵抗生物、非生物脅迫中的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。