朱 盼，謝娟平,*

(1.陜西科技大學化學化工學院，陜西 西安 710021；2.安康學院醫(yī)學院 秦巴中藥資源研發(fā)中心，陜西 安康 725000)

粉葛為豆科植物甘葛藤的干燥根，是秦巴山區(qū)一種資源豐富、藥食兼用的綠色食品，具有解肌退熱、生津止渴、通經活絡、解酒毒等功效，臨床主要用于治療頭痛發(fā)熱、項背強痛、口渴等癥[1]。粉葛的主要成分是淀粉和黃酮，其與葛根的最大區(qū)別是淀粉含量高，粉葛淀粉在食品領域具有廣闊的開發(fā)前景[2-3]。粉葛淀粉的提取常采用堿法和普通水提法[4-5]，其中常規(guī)堿法有利于淀粉浸出，且淀粉中黃酮保留量較高，但濃度掌握不當易發(fā)生糊化，不利于后續(xù)處理；水提法提取率較低，黃酮保留量少。超聲波輔助提取有助于有效成分溶出。隨著退耕還林和生態(tài)保護的發(fā)展，秦巴山區(qū)粉葛種植大面積推廣，其加工利用日益重要，目前未見超聲波輔助提取秦巴山區(qū)粉葛淀粉的研究報道。鑒于此，作者以淀粉提取率為評價指標，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化秦巴山區(qū)粉葛淀粉的超聲波輔助堿法提取工藝，并比較超聲波輔助堿法、常規(guī)堿法及超聲波輔助水法提取對粉葛淀粉性質的影響，以期為秦巴山區(qū)粉葛淀粉開發(fā)利用提供參考依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

粉葛：一年生，10月和12月采自安康平利縣，含水量分別為60.33%、65.45%。

石灰水溶液(氧化鈣與水反應，過濾制備)、濃鹽酸、濃硫酸、高氯酸、蒽酮、碘、碘化鉀等。

KYKY-EM3200型掃描電子顯微鏡，北京中科科儀股份有限公司；FTIR200型傅立葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；L5S型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；料理機，中山歐美特電器有限公司；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DK-2000-ⅢL型電熱恒溫水浴鍋、800型離心機，天津泰斯特儀器有限公司；KH-250DE型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；PHS-2F型 pH計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 秦巴山區(qū)粉葛淀粉的提取工藝流程(圖1)

圖1 粉葛淀粉的提取工藝流程Fig.1 Extraction process flow of starch from Pueraria thomsonii

1.2.2 秦巴山區(qū)粉葛淀粉含量的測定

采用蒽酮-硫酸比色法測定粉葛淀粉含量[6]，采用碘顯色法測定粉葛淀粉的純度[7]，按下式計算淀粉提取率：

1.2.3 單因素實驗

稱取秦巴山區(qū)新鮮粉葛約20 g，加入石灰水，打漿5 min，于100 W下超聲提取，水浴鍋中浸泡，考察石灰水pH值(7、8、9、10、11)、料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，g∶mL，下同)、超聲溫度(20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、超聲時間(0 min、10 min、20 min、30 min、40 min)、浸泡時間(0 h、1 h、2 h、3 h、4 h)對粉葛淀粉提取率的影響。

1.2.4 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，選擇石灰水pH值(A)、料液比(B)、超聲時間(C)、浸泡時間(D)4個因素為自變量，以粉葛淀粉提取率為評價指標，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析和統(tǒng)計，優(yōu)化秦巴山區(qū)粉葛淀粉提取工藝。響應面實驗的因素與水平見表1。

1.3 粉葛淀粉理化性質的測定

1.3.1 透明度、溶解度、膨脹度、凝沉性及凍融穩(wěn)定性的測定

參照文獻[8]采用紫外分光光度法在620 nm波長下測定粉葛淀粉糊的透光率T(%)。參照文獻[9-10]測定粉葛淀粉的溶解度、膨脹度、凝沉性及凍融穩(wěn)定性。

表1 響應面實驗的因素與水平

1.3.2 淀粉中黃酮含量的測定

以葛根素為對照品，參照文獻[11]采用紫外分光光度法測定粉葛淀粉中黃酮含量。

1.3.3 淀粉顆粒形貌觀察及紅外光譜分析

用無水乙醇將粉葛淀粉分散處理，用毛細管將樣品涂抹于硅片上，干燥后進行鍍金處理，用掃描電鏡觀察粉葛淀粉的顆粒形貌。電壓為25 kV，放大倍數2 000倍。

取少量粉葛淀粉與溴化鉀混合、研磨后壓片，采用傅立葉紅外光譜儀在4 000～500 cm-1范圍掃描，分辨率4 cm-1，掃描32次。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 石灰水pH值對粉葛淀粉提取率的影響(圖2)

圖2 石灰水pH值對粉葛淀粉提取率的影響Fig.2 Effect of whitewash pH value on extraction rate of starch from Pueraria thomsonii

由圖2可知，當石灰水pH值在7～9范圍內時，粉葛淀粉提取率隨著石灰水pH值的增大逐漸升高；當pH>9時，繼續(xù)增大石灰水pH值,粉葛淀粉提取率反而降低。這可能是由于，一方面石灰水溶液可以降低體系黏度，促進淀粉的沉淀，提高淀粉提取率；另一方面，堿液可以有效地抑制酶的活性，使淀粉的品質更優(yōu)，但高pH值的堿液會破壞淀粉的結構。故最佳石灰水pH值為 9。

2.1.2 料液比對粉葛淀粉提取率的影響(圖3)

圖3 料液比對粉葛淀粉提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of starch from Pueraria thomsonii

由圖3可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，粉葛淀粉提取率先升高后降低，當料液比為1∶3時，粉葛淀粉提取率最高；繼續(xù)增加提取溶劑用量，粉葛淀粉提取率反而降低。這可能是由于，合適的料液比使粉葛完全浸泡，在超聲作用下，淀粉能更好地釋放；而加大提取溶劑用量，體系內分子間的碰撞減少，超聲波氣流削弱，淀粉與蛋白質間的氫鍵作用就會減弱，使得淀粉與蛋白質很難分離，淀粉提取率降低[12]。故最佳料液比為1∶3。

2.1.3 超聲溫度對粉葛淀粉提取率的影響(圖4)

圖4 超聲溫度對粉葛淀粉提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of starch from Pueraria thomsonii

由圖4可知，超聲溫度對粉葛淀粉提取率的影響不大，當超聲溫度為30 ℃時，粉葛淀粉提取率最高；繼續(xù)升高超聲溫度，提取率略有降低。這可能是由于，過高的超聲溫度使部分淀粉糊化。故最佳超聲溫度為30 ℃。

2.1.4 超聲時間對粉葛淀粉提取率的影響(圖5)

圖5 超聲時間對粉葛淀粉提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on extraction rate of starch from Pueraria thomsonii

由圖5可知，當超聲時間為0～30 min時，粉葛淀粉提取率隨超聲時間的延長逐漸升高；當超聲時間超過30 min時，繼續(xù)延長超聲時間，提取率降低。這可能是因為，超聲波的振動擊碎了內部細胞壁，使淀粉更多地釋放；但時間過長，超聲波的機械性斷鍵作用加劇了淀粉分子之間的摩擦、碰撞，使得淀粉降解，提取率降低[13]。故最佳超聲時間為30 min。

2.1.5 浸泡時間對粉葛淀粉提取率的影響(圖6)

圖6 浸泡時間對粉葛淀粉提取率的影響Fig.6 Effect of soaking time on extraction rate of starch from Pueraria thomsonii

由圖6可知，當浸泡時間為1 h時，粉葛淀粉提取率最高；而延長浸泡時間，粉葛淀粉提取率反而降低。這可能是因為，長時間浸泡使淀粉顆粒結構變得疏松、分散，不利于沉淀；同時微生物活動加劇，淀粉褐變現象愈加嚴重，影響淀粉白度。故最佳浸泡時間為1 h。

2.2 響應面實驗優(yōu)化粉葛淀粉提取工藝

2.2.1 響應面實驗結果(表 2)

2.2.2 回歸模型的建立與顯著性分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行回歸分析，得出石灰水pH值、料液比、超聲時間、浸泡時間4個因素與粉葛淀粉提取率之間的二次回歸方程為：Y=71.41-0.20A-3.82B-0.25C+1.04D-4.26AB-4.06AC+0.91AD+4.47BC+2.23BD+1.43CD-6.69A2-5.83B2-7.67C2-3.90D2?；貧w方程模型的方差分析見表3。

表2 響應面實驗設計與結果

由表3可知，回歸模型的F=42.93、P<0.0001，表明方程模型極顯著；相關系數R2=0.9772，失擬項的F=5.10，P>0.05，表明失擬不顯著，說明回歸模型與實測值能較好地擬合，所以該模型可以預測和分析粉葛淀粉的提取效果。一次項因素中， 料液比(B)對淀粉提取率的影響極顯著(P<0.01)，浸泡時間(D)對其影響顯著(P<0.05)，石灰水pH值(A)和超聲時間(C)對其影響不顯著(P>0.05)；各二次項都達到了極顯著水平；交互項中AB、AC、BC、BD對其影響極顯著(P<0.01)，而AD、CD影響不顯著。由F值的大小可以看出，各因素對粉葛淀粉提取率的影響順序為：料液比>浸泡時間>超聲時間>石灰水pH值。

表3 回歸方程模型的方差分析

2.2.3 因素交互影響顯著性分析

根據實驗結果繪制各因素交互作用對粉葛淀粉提取率影響的響應面三維圖和等高線圖，結果如圖7所示。

由圖7響應面陡峭程度可以看出，相對于石灰水pH值和超聲時間，料液比和浸泡時間對粉葛淀粉提取率的影響更大，這與表3分析結果一致，AB、AC、BC、BD等高線圖接近橢圓，說明各因素的交互作用對提取率的影響顯著。響應面開口朝下，淀粉提取率隨各因素的變化呈先升高后降低的趨勢，說明此模型存在最大值的穩(wěn)定點。對穩(wěn)定點進行分析，結果如表 4所示。

表4 穩(wěn)定點的規(guī)范分析

2.2.4 回歸模型的驗證

為了檢驗響應面法所得各優(yōu)化參數的準確可靠性，對各影響因素的優(yōu)化值進行驗證?？紤]到實際操作情況，將最佳條件修正為：石灰水pH值9、料液比1∶3、超聲時間28 min、浸泡時間1 h，在該條件下進行3次驗證實驗，得粉葛淀粉的平均提取率為71.42%，與預測值的相對誤差為1.25%，表明該模型有較好的預測性能。

2.3 粉葛淀粉理化性質的測定

2.3.1 不同提取方法對粉葛淀粉透明度與凍融穩(wěn)定性的影響(表5)

表5 粉葛淀粉的透明度和凍融穩(wěn)定性

透光率的大小代表透明度的高低，透光率越大，透明度越高。由表5可知，超聲波輔助堿法提取的淀粉透明度略高于常規(guī)堿法。這可能是因為，在超聲波的空穴作用下，淀粉顆粒小部分結晶區(qū)破壞，使得直鏈淀粉更多地溶出，從而使透光率增大[14]。超聲波輔助水法提取的淀粉的析水率較高，說明水提得到的淀粉的凍融穩(wěn)定性不如堿提。

圖7 各因素交互作用對粉葛淀粉提取率影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface map and contour map of effect of interaction between each factor on extraction rate of starch from Pueraria thomsonii

2.3.2 不同提取方法對粉葛淀粉溶解度與膨脹度的影響(圖8)

圖8 粉葛淀粉的溶解度(a)和膨脹度(b)Fig.8 Solubility(a) and swelling degree(b) of starch from Pueraria thomsonii

由圖8可知，隨著溫度的升高，不同方法提取的粉葛淀粉的溶解度與膨脹度也隨之增大。這是由于，溫度不斷升高，使得淀粉顆粒結構變得松散，破壞程度增大，結晶區(qū)中氫鍵斷裂數目增多，游離水更易于滲入淀粉顆粒內部使得溶解度和膨脹度增大[15-16]。

2.3.3 不同提取方法對粉葛淀粉凝沉性的影響(圖9)

圖9 粉葛淀粉的凝沉性Fig.9 Condensation of starch from Pueraria thomsonii

由圖9可知，隨著時間的延長，粉葛淀粉的凝沉性逐漸增強，靜置33 h后，上清液體積分數基本不變，趨于穩(wěn)定。這可能是因為，糊化后，長時間的靜置使體系的溫度下降，分子運動變緩，從無序排列向平行有序排列趨近、聚集，使得凝沉性漸漸趨于穩(wěn)定。超聲波輔助堿法提取的淀粉的凝沉性略強于常規(guī)堿法。

2.3.4 不同提取方法對粉葛淀粉中黃酮含量的影響(圖10)

由圖10可知，超聲波輔助堿法提取的淀粉中黃酮含量為949.72 mg·(100 g)-1，高于常規(guī)堿法和超聲波輔助水法。這可能是因為，黃酮分子具有弱酸性，可溶于堿性溶液，因此堿液浸泡過篩后調節(jié)pH值至酸性，黃酮可以沉降下來，從而提高了淀粉中黃酮的含量[17]。

2.3.5 不同提取方法對粉葛淀粉顆粒形貌及淀粉結構的影響(圖11)

由圖11a、11b可知，超聲波輔助堿法和常規(guī)堿法提取對淀粉顆粒形貌無顯著影響，粉葛淀粉大多呈不規(guī)則多邊形，少數呈卵圓形，顆粒較小。由圖11c可知，超聲波輔助堿法與常規(guī)堿法提取的粉葛淀粉的紅外特征峰基本一致，無明顯區(qū)別，說明超聲波作用沒有破壞粉葛淀粉的結構。

2.4 討論

張鐘等[5]采用常規(guī)堿法提取葛根淀粉，在料液比為1∶4.5、浸泡時間為2.0 h、浸泡液pH值為10.2的條件下，葛根淀粉提取率為83.66%。在實際工業(yè)生產中浸泡時間長、料液比小、堿性強，后續(xù)處理難度增大及工業(yè)成本較高。本研究將超聲技術與常規(guī)堿法相結合，提取率雖比文獻報道的低，但超聲波輔助堿法提取有效縮短了浸泡時間，料液比大及弱堿性條件有利于后續(xù)處理及降低工業(yè)成本，產品色白且純度高，同時黃酮較大程度地與淀粉一起沉降，所得淀粉中黃酮含量高，使秦巴山區(qū)粉葛淀粉實現了日常食用和日常保健的雙重利用，充分體現了粉葛食品“藥食兼用”的特色和保健作用。

3 結論

以淀粉提取率為評價指標，采用超聲波輔助堿法提取秦巴山區(qū)新鮮粉葛淀粉，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取條件為：石灰水pH值9、料液比1∶3、超聲功率100 W、超聲溫度30 ℃、超聲時間28 min、浸泡時間1 h，在該條件下，秦巴山區(qū)新鮮粉葛淀粉的提取率高達71.42%，淀粉純度達到95%以上。比較了超聲波輔助堿法、常規(guī)堿法、超聲波輔助水法3種提取方法對秦巴山區(qū)粉葛淀粉的理化性質的影響。發(fā)現，超聲波輔助堿法并未改變淀粉顆粒形貌和結構，反而提高了淀粉的透明度和黃酮的保留量，透光率為13.10%，黃酮含量為949.72 mg·(100 g)-1。