黃明靜

河南省息縣人民醫(yī)院，河南 信陽 464300

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）屬于慢性結(jié)腸炎性疾病，目前普遍認(rèn)為其病因、發(fā)病機(jī)制與免疫功能異常、遺傳易感因素、環(huán)境因素等多種因素間相互作用有關(guān)［1］。免疫應(yīng)答紊亂、慢性炎性反應(yīng)是導(dǎo)致UC關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，而導(dǎo)致炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答改變重要因素為腸道內(nèi)菌群紊亂［2］。目前，針對(duì)UC患者腸道內(nèi)菌群研究因選取疾病病程和分期不同、治療與否所致分析方法不同，加之腸道內(nèi)菌群復(fù)雜性，其完整結(jié)構(gòu)、功能并未被完全了解，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)腸道內(nèi)需氧菌、常見厭氧菌變化認(rèn)知不統(tǒng)一，也未能完全闡明其在疾病發(fā)生中具體作用［3］。本研究利用涂片鏡檢、免疫組化、細(xì)菌培養(yǎng)、real-time PCR等對(duì)UC活動(dòng)患者、健康體檢者的菌群進(jìn)行分析，并將IL-23、IL-17與目標(biāo)菌群相關(guān)性進(jìn)行分析?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河南省息縣人民醫(yī)院于2018年3月—2019年9月間UC活動(dòng)期患者56例為研究組，選同期健康體檢者63例作為對(duì)照組。研究組，男性27例，女性29例，年齡25～71歲，平均年齡（48.03±11.46）歲，病程1～15年，平均病程（8.01±3.47）年；對(duì)照組，男性30例，女性33例，年齡25～72歲，平均年齡（48.47±11.73）歲，均已簽署知情同意書。兩組一般資料（年齡、性別）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均符合《潰瘍性結(jié)腸炎中西醫(yī)結(jié)

合診療共識(shí)意見（2017年）》［4］中關(guān)于活動(dòng)期UC診斷標(biāo)準(zhǔn)者；臨床資料完整者。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肺、腎、肝等嚴(yán)重疾病者；伴有糖尿病嚴(yán)重者；伴有嚴(yán)重感染者；伴有UC并發(fā)癥者；哺乳期、妊娠期女性；伴有腸外表現(xiàn)者；伴有其他自身免疫疾病者。

1.3 方法

1.3.1 涂片鏡檢：取新鮮糞便標(biāo)本，2 h常規(guī)涂片，干燥固定后予以革蘭染色，于油鏡下對(duì)10個(gè)視野進(jìn)行觀察，依據(jù)油鏡視野內(nèi)細(xì)菌綜合素質(zhì)、細(xì)菌比例，確認(rèn)是否發(fā)生菌群失調(diào)和失調(diào)程度。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定：采用10μl接種環(huán)對(duì)新鮮糞便進(jìn)行挑取，利用4區(qū)劃線法接種。（1）厭氧培養(yǎng)：于厭氧血平板上進(jìn)行接種，于37℃的無氧環(huán)境中孵育48 h，取優(yōu)勢(shì)菌行耐氧實(shí)驗(yàn)，利用API20A厭氧菌鑒定卡對(duì)專性厭氧菌鑒定；（2）需氧培養(yǎng)：于血平板、中國藍(lán)平板上進(jìn)行接種，在濃度為5%CO2、37℃的有氧環(huán)境中進(jìn)行24 h孵育，采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的菌種進(jìn)行鑒定；（3）選擇性培養(yǎng)基：接種擬桿菌、大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.3 real-time PCR熒光定量分析：將涂片、培養(yǎng)剩余標(biāo)本置于-80℃保存，利用糞便DNA組提取試劑盒抽提糞便總DNA，測(cè)定其DNA濃度后，保存至-20℃；利用real-time PCR試劑盒擴(kuò)增糞便DNA，將每個(gè)標(biāo)本行復(fù)孔檢測(cè)。

1.3.4 免疫組化法對(duì)結(jié)腸組織中的IL-23、IL-17表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)：切片脫蠟直至水化，采用3%H2O2將內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行阻斷，采用微波將抗原修復(fù)，分別和IL-17、IL-23Ⅰ抗在4℃下孵育過夜，將辣根過氧化物酶、Ⅱ抗對(duì)鏈霉卵白素工作液進(jìn)行標(biāo)記，DAB進(jìn)行顯色，其中棕褐色的反應(yīng)產(chǎn)物為抗原定位。

1.3.5 Baron分級(jí)、結(jié)腸組織病理學(xué)分析：（1）Mayo評(píng)分：評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)度，癥狀減輕為＜2分，輕度活動(dòng)期3～5分，中度活動(dòng)期為6～10分，中度活動(dòng)期為11～12分；（2）內(nèi)鏡下活動(dòng)度分級(jí)：依據(jù)改良Baron分級(jí)；（3）結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分：對(duì)腸黏膜組織行常規(guī)石蠟切片，并予以HE染色，與光鏡下對(duì)腸黏膜潰瘍形成、炎性細(xì)胞浸潤、水腫、充血等狀況進(jìn)行觀察，依據(jù)Siegmund等評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分。每個(gè)標(biāo)本取5張切片，每個(gè)切片隨機(jī)選4個(gè)視野。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)鑒定、real-time PCR的熒光定量分析。（2）IL-17、IL-23表達(dá)和Baron分級(jí)、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分相關(guān)性分析。（3）IL-17、IL-23表達(dá)和菌群熒光定量相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，并行Spearman相關(guān)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、real-time PCR的熒光定量結(jié)果

與對(duì)照組對(duì)比，研究組球菌數(shù)量上升，桿菌數(shù)量降低，且菌群失調(diào)度升高，Ⅱ度、Ⅲ度失調(diào)比例由對(duì)照組10%、0升至研究組的30%、25%；厭氧菌、需氧菌均有改變，其中厭氧菌總數(shù)減少，主要表現(xiàn)在擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌減少，需氧菌總數(shù)上升，表現(xiàn)在大腸桿菌減少、腸球菌升高。

2.2 IL-17、IL-23表達(dá)和Baron分級(jí)、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分相關(guān)性

經(jīng)Spearman分析，IL-23、IL-17與Baron分級(jí)（r23=0.850，r17=0.718）、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分（r23=0.676，r17=0.659）呈正相關(guān)（P＜0.05），見表1。

表1 IL-17、IL-23表達(dá)和Baron分級(jí)、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分相關(guān)性

2.3 IL-17、IL-23表達(dá)和菌群熒光定量相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman分析，IL-23與大腸桿菌數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.701）、與腸球菌數(shù)呈正相關(guān)（r=0.873），IL-17與腸球菌數(shù)呈正相關(guān)（r=0.765，P＜0.05），見表2。

表2 IL-17、IL-23表達(dá)和菌群熒光定量相關(guān)性分析

3 討論

腸道菌群可構(gòu)成復(fù)雜的腸道微生態(tài)系統(tǒng)，在機(jī)體腸道免疫系統(tǒng)、抑制致病菌、營養(yǎng)位置吸收合成等方面具有重要作用［5］。研究認(rèn)為，UC發(fā)病原因?yàn)槟c黏膜的屏障功能產(chǎn)生異常，腸道內(nèi)菌群紊亂、異常免疫反應(yīng)介導(dǎo)間互相作用，導(dǎo)致腸黏膜功能出現(xiàn)異常，其參與UC發(fā)病。目前發(fā)現(xiàn)多種類病毒、細(xì)菌等參與炎性腸病發(fā)病［6］。基于分析方法不同，UC活動(dòng)期腸道菌群構(gòu)成研究結(jié)果不同。

本研究對(duì)各組標(biāo)本予以糞便涂片、厭氧和需氧菌培養(yǎng)，結(jié)果顯示，厭氧菌、需氧菌均有改變，其中厭氧菌總數(shù)減少，主要表現(xiàn)在擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌減少，需氧菌總數(shù)上升，表現(xiàn)在大腸桿菌減少、腸球菌升高。這一結(jié)果與王艷等［7］研究結(jié)果類似，大致揭示在UC活動(dòng)期內(nèi)腸道菌群分布狀況。正常狀況下，乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸黏膜細(xì)胞可密切結(jié)合，于腸黏膜表面生成生物學(xué)屏障，進(jìn)而阻止致病菌的入侵，而二者減少可降低腸黏膜防御功能。腸球菌可釋放外毒素，進(jìn)而加重已存在的免疫紊亂和炎性反應(yīng)，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Spearman分析，IL-23、IL-17與Baron分級(jí)、病理學(xué)組織評(píng)分呈正相關(guān)，且IL-23與大腸桿菌數(shù)呈負(fù)相關(guān)、與腸球菌數(shù)呈正相關(guān)，IL-17與腸球菌數(shù)呈正相關(guān)，說明IL-17、IL-23在UC活動(dòng)期發(fā)生、發(fā)展均具有關(guān)鍵性作用。最新研究顯示，以分泌IL-17為特征CD4+T細(xì)胞屬于新型輔助T淋巴細(xì)胞亞群，其具有介導(dǎo)免疫性疾病、炎性反應(yīng)等免疫調(diào)節(jié)重要作用［8］。腸道內(nèi)的致病菌產(chǎn)物和各自Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，可誘導(dǎo)抗原細(xì)胞分泌IL-23，而IL-23和相應(yīng)受體相結(jié)合，繼而誘導(dǎo)IL-17表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎性級(jí)聯(lián)放大，從而介導(dǎo)腸道炎性反應(yīng)、腸黏膜損傷。本研究具有一定局限性，細(xì)菌培養(yǎng)僅能檢測(cè)腸道內(nèi)活菌，無法代表死菌，且腸道內(nèi)菌群種類繁多，無法反映所有菌群，且在分析過程中僅涉及現(xiàn)有條件下具有代表性菌種。

綜上所述，UC活動(dòng)期患者具有明顯菌群失衡，且菌群改變與疾病炎性程度具有密切聯(lián)系，IL-23、IL-17與腸道內(nèi)菌群含量變化具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，在UC發(fā)生中起重要作用，屬于UC關(guān)鍵因子。