李有芳，靖建國，張靜悟，李衛(wèi)華

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆石河子 832000)

土壤鹽漬化是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一[1]。鹽脅迫誘導(dǎo)植物細胞膜產(chǎn)生滲透脅迫，導(dǎo)致活性氧大量積累，影響植物生長過程中的正常代謝，最終抑制植物生長[2]。DNA甲基化是植物中普遍存在的一種表觀遺傳方式，利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷-甲硫氨酸(S-daomet，SAM)的甲基基團轉(zhuǎn)移到胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)上[3]，在DNA序列不改變的情況下調(diào)控植物基因表達，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育。在生物脅迫和非生物脅迫下，植物通過甲基化狀態(tài)的改變來調(diào)節(jié)抗逆有關(guān)基因的表達，進而影響表型和適應(yīng)性的改變[4]。

5-氮雜胞苷(5-azaC)是一種DNA甲基化抑制劑，能夠與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相結(jié)合，降低DNA甲基化水平[5-7]。5-azaC處理使未春化的擬南芥植株相比對照提前開花，而對春化作用不敏感的晚開花突變體植株無影響[8]。干旱脅迫下水稻通過降低葉和根甲基化水平，激活相關(guān)基因表達，進而提高水稻耐旱性[9]。在鹽脅迫條件下棉花通過誘導(dǎo)抗逆相關(guān)基因編碼區(qū)去甲基化，調(diào)控基因的表達，從而有利于植株耐鹽[10]。高溫條件下，5-azaC可以降低白菜幼苗MDA含量，提高POD活性和蛋白質(zhì)含量[11]。上述研究結(jié)果說明，在脅迫條件下，DNA甲基化具有調(diào)節(jié)植物脅迫響應(yīng)基因的表達和生長發(fā)育的作用[12]。目前的研究多集中于鹽脅迫對小麥生理特性及相關(guān)基因表達的影響，而有關(guān)DNA甲基化水平的降低對鹽脅迫下小麥耐鹽性影響的探討還鮮有報道。本試驗選用耐鹽性不同的春小麥品種新春6號和新春11號為材料，研究鹽脅迫條件下DNA甲基化抑制劑處理對小麥部分生理和農(nóng)藝性狀的影響，以了解DNA甲基化的改變與小麥抵抗鹽脅迫能力的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用耐鹽性不同的春小麥(TriticumaestivumL.)品種新春11號(高耐鹽)、新春6號(鹽敏感)為供試材料[13]，種子由新疆石河子大學(xué)麥類作物研究所提供。

1.2 小麥幼苗培養(yǎng)及處理

選取飽滿的小麥種子，在自來水下沖洗干凈，經(jīng)75%酒精消毒2 min，用5%次氯酸鈉消毒15 min，再用無菌水沖洗干凈。將消毒后的小麥種子在蒸餾水中浸泡數(shù)小時，待其有白色小芽露頭時移入鋪有兩層濾紙的發(fā)芽盒中(發(fā)芽盒已消毒)，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度 25 ℃，濕度50%，光暗比16 h/8 h。試驗共設(shè)5個處理(CK：清水對照；T0：0 μmol·L-15-azaC +200 mmol·L-1NaCl；T1：50 μmol·L-15-azaC +200 mmol·L-1NaCl；T2：150 μmol·L-15-azaC +200 mmol·L-1NaCl；T3：300 μmol·L-15-azaC +200 mmol·L-1NaCl)，每個處理3次重復(fù)。

DNA甲基化抑制劑添加：處理期間，每次向發(fā)芽盒中滴加相應(yīng)濃度的5-azaC溶液15 mL，對照組滴加相應(yīng)的清水，每隔1 d處理1次，處理 7 d后結(jié)束。

鹽脅迫：選取DNA甲基化抑制劑處理后長勢一致的幼苗移栽至花盆(30 cm×20 cm)中，營養(yǎng)土與蛭石3∶1混合，每盆15株，每個處理3次重復(fù)。待幼苗長至三葉一心時，用200 mmol·L-1NaCl進行鹽脅迫，用清水做對照(CK)，處理7 d后進行各項生理指標的測定。

1.3 小麥農(nóng)藝性狀測定

成熟時，不同處理隨機選取15株小麥，測定株高及主莖穗長、穗粒數(shù)和穗粒重。

1.4 小麥氣體交換參數(shù)測定

鹽脅迫處理7 d后，選取小麥倒二葉即第5片葉，采用Li-6400型便攜式光合儀測定各處理小麥葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr) 和胞間CO2濃度(Ci)。便攜式光合測定系統(tǒng)葉室光照強度設(shè)定為1 000 μmol·m-2·s-1，CO2參比濃度為400 μmol·mol-1，溫度為25 ℃。每個處理設(shè)三次重復(fù)，每個重復(fù)測定三 片葉。

1.5 小麥生理指標測定

取處理后的小麥葉片，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量[14]?？扇苄蕴呛繙y定采用蒽酮比色法；脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮法，利用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。SOD活性測定采用羥胺法；CAT和POD活性測定采用可見光法，三種抗氧化酶活性具體參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行測定。各項生理指標均測定三次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用LSD法進行處理間差異顯著性分析，用Excel 2010進行圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥農(nóng)藝性狀的影響

與CK相比，鹽脅迫(T0)導(dǎo)致新春6號的株高顯著降低，對新春11號影響不顯著(表1)，說明鹽脅迫對鹽敏感品種新春6號植株有明顯的致矮作用。與T0處理相比，新春6號株高在T1、T2、T3處理下均顯著下降，降幅分別為8.01%、10.66%、11.93%；新春11號株高在T2、T3處理下顯著下降，降幅分別為10.27%、7.38%，說明鹽脅迫下DNA去甲基化對小麥株高表現(xiàn)出一定的抑制作用。與CK相比，鹽脅迫后兩個品種的穗長、穗粒數(shù)、穗粒重均顯著降低；DNA甲基化抑制劑和鹽脅迫共同處理與單獨鹽脅迫相比差異較小，基本上均不顯著。這表明鹽脅迫會抑制鹽敏感小麥品種生長，降低穗長、穗粒數(shù)和穗粒重。DNA去甲基化也會造成小麥植株矮化，但對產(chǎn)量性狀影響不大。

表1 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥農(nóng)藝性狀的影響Table 1 Effect of 5-azaC on wheat agronomic traits of two wheat varieties

2.2 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥葉片氣體交換參數(shù)的影響

與CK相比，鹽脅迫對兩個品種的Tr均產(chǎn)生明顯的抑制作用，對Pn、Gs和Ci影響均不顯著(表2)。鹽脅迫下，新春11號的Pn值隨著DNA甲基化抑制劑濃度的升高呈降低趨勢，其中T2、T3處理與T0處理均差異顯著，降幅分別為22.12%、27.88%，而DNA甲基化抑制劑對新春6號的Pn影響不顯著。鹽脅迫下DNA甲基化抑制劑處理與T0處理相比顯著降低了新春6號的Tr，但提高了新春11號的Tr，其中T2和T3處理與T0處理差異達到顯著水平；新春6號T2和T3處理的Gs和Ci較T0處理均顯著提高，而DNA甲基化抑制劑處理對新春11號的Gs和Ci影響均不顯著。以上結(jié)果說明，鹽脅迫下DNA去甲基化會對小麥光合能力產(chǎn)生抑制作用，減弱鹽敏感品種新春6號氣孔的氣體交換，但對耐鹽品種新春11號氣孔的氣體交換影響不大。

表2 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥葉片氣體交換參數(shù)的影響Table 2 Effect of DNA methylation inhibitor on gas exchange parameters of wheat leaves under salt stress

2.3 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥葉片MDA含量的影響

與CK相比,鹽脅迫后新春6號、新春11號葉片MDA含量分別上升37.02%、30.67%，差異均顯著(表3)，說明鹽脅迫對小麥產(chǎn)生過氧化傷害，且對新春6號損傷程度較大。鹽脅迫下新春6號葉片T1處理的MDA含量較T0處理顯著降低，降幅31.06%，與正常水平(CK)相當，但T2和T3處理與T0處理差異不顯著；新春11號則表現(xiàn)相反，T2、T3處理與T0處理相比顯著降低，降幅分別為29.59%、48.47%，T1處理變化不顯著。由此可見，DNA去甲基化減弱鹽脅迫對小麥膜脂過氧化傷害的效果因DNA甲基化抑制劑濃度和小麥耐鹽性而不同，低濃度DNA甲基化抑制劑對鹽敏感品種有利，高濃度DNA甲基化抑制劑對耐鹽品種有利。

表3 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥葉片MDA含量的影響

2.4 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥葉片脯氨酸含量和可溶性糖含量的影響

與CK相比，鹽脅迫后小麥葉片脯氨酸和可溶性糖含量變化均不顯著(表4)。鹽脅迫下DNA甲基化抑制劑處理的新春6號脯氨酸含量有所上升，其中T2、T3處理與T0處理差異顯著；DNA甲基化抑制劑處理的新春11號脯氨酸含量及兩品種可溶性糖含量均與T0處理差異不明顯。這說明鹽脅迫條件下，DNA去甲基化可促進鹽敏感品種新春6號脯氨酸積累，對可溶性糖影響不大，而對耐鹽品種新春11號脯氨酸和可溶性糖含量影響較小。

表4 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥葉片脯氨酸和可溶性糖含量的影響Table 4 Effect of DNA methylation inhibitor on proline and soluble sugar content in wheat leaves under salt stress

2.5 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥幼苗抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫導(dǎo)致新春11號POD活性顯著下降，對其SOD和CAT活性及新春6號的三種酶活性影響均不明顯(表5)。鹽脅迫下DNA甲基化抑制劑處理顯著增強了新春11號的POD活性，T1、T2、T3處理較T0處理分別提高7.54%、13.94%、9.73%，與CK水平相當，而對SOD、CAT活性影響較小；DNA甲基化抑制劑處理可顯著增加新春6號的SOD、CAT活性，而降低POD活性。以上結(jié)果說明，DNA去甲基化對鹽脅迫下小麥葉片抗氧化酶活性的影響因品種而異。

表5 DNA甲基化抑制劑對鹽脅迫下小麥葉片抗氧化酶活性的影響Table 5 Effect of DNA methylation inhibitor on antioxidant enzyme activities in wheat leaves under salt stress

3 討 論

植物在遭受鹽脅迫逆境時，產(chǎn)生滲透、氧化等脅迫反應(yīng)，對植物生長產(chǎn)生抑制作用[15]。逆境條件下，DNA甲基化能夠調(diào)節(jié)植物抗逆相關(guān)基因的表達和生長發(fā)育的能力。5-azaC是一種DNA甲基化抑制劑，其誘導(dǎo)DNA甲基化變化，可增強植物對非生物脅迫的抗性。

研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下不同小麥品種的株高、穗長、分蘗數(shù)等都不同程度地降低[16]。King[17]和Sano等[18]用5-azaC處理甘藍幼苗和水稻種子，發(fā)現(xiàn)其生長發(fā)育表現(xiàn)出許多異常，如植株矮化和葉片變小。本研究表明，小麥的生長發(fā)育在鹽脅迫下受到明顯抑制，株高、穗長、穗粒數(shù)和穗粒重均顯著降低。DNA甲基化抑制劑處理后小麥株高相比單獨鹽脅迫處理顯著下降，造成植株矮化，這與前人的研究結(jié)果是一致的。Farquhar等[19]認為，造成小麥光合作用變化的原因主要有兩方面：(1)氣孔導(dǎo)度下降，導(dǎo)致CO2供應(yīng)不足；(2)同化CO2能力下降，胞間CO2濃度升高。本試驗結(jié)果表明，鹽脅迫下小麥凈光合速率下降，同時氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度明顯降低，說明光合速率的降低是因為氣孔因素限制而導(dǎo)致的。鹽脅迫導(dǎo)致膜脂過氧化促使丙二醛(MDA)積累，對小麥造成傷害[20]。本研究中，鹽脅迫下DNA甲基化抑制劑處理后，小麥葉片MDA含量顯著降低，低濃度抑制劑可顯著降低新春6號葉片MDA含量，高濃度抑制劑可顯著降低新春11號葉片MDA含量，可見耐鹽性不同的小麥品種對DNA甲基化抑制劑濃度表現(xiàn)出不同的敏感性。

逆境條件下，脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)顯著積累，以調(diào)節(jié)細胞滲透壓，增強植物適應(yīng)逆境的能力[21]。本研究表明，DNA去甲基化處理可提高鹽脅迫下小麥葉片脯氨酸含量和可溶性糖含量，耐鹽性強的小麥品種新春11號變化幅度較小，耐鹽性弱的小麥品種新春6號變化幅度較大，這與Guzel等[22]的研究結(jié)果是一致的。鹽脅迫下小麥體內(nèi)活性氧積累，導(dǎo)致細胞膜膜脂過氧化，植物通過增強體內(nèi)抗氧化酶活性來減輕逆境脅迫造成的傷害。許會會等[11]研究發(fā)現(xiàn)，5-azaC處理可顯著增強熱脅迫下白菜幼苗POD、SOD活性。本研究中，DNA去甲基化處理提高了鹽脅迫下小麥葉片抗氧化酶的活性。鹽脅迫條件下5-azaC處理對SOD和CAT活性的影響表現(xiàn)為在鹽敏感品種中明顯上升，耐鹽品種中明顯下降，而POD活性則表現(xiàn)為在鹽敏感品種中明顯下降，而在耐鹽品種中明顯上升。這也說明耐鹽性不同的小麥通過提高不同的抗氧化酶活性來提高小麥幼苗的抗鹽性，這與前人研究結(jié)果相似[23]。

綜上所述，DNA去甲基化可對植株造成矮化，增強鹽脅迫條件下小麥的抗氧化能力，降低膜脂過氧化程度，增強其抗逆能力，耐鹽性不同的小麥品種對DNA去甲基化抑制劑敏感性不同。推測DNA甲基化參與調(diào)節(jié)小麥抗鹽性基因表達，從而調(diào)控小麥植株的耐鹽能力。