段晉偉 ， 白燕雨 ， 劉家祺 ， 高曉莎 ， 張慧琴 ， 韓郭皓 ， 霍乃蕊 ， 古少鵬

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山西 太谷 030801)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)是威脅人和動物健康的主要病原菌之一，可通過多種媒介進(jìn)行傳播，極易感染，致病性極強(qiáng)，也是引起奶牛等反芻動物乳腺炎的主要病原[1-2]。隨著養(yǎng)殖業(yè)趨于規(guī)模化發(fā)展和抗菌藥物的過度使用，使牛場中S.aureus的耐藥菌數(shù)不斷增加，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的大量出現(xiàn)，給奶牛疾病的防治帶來極大困難[3]。研究表明，S.aureus可形成微生物氣溶膠廣泛散布于奶牛養(yǎng)殖場內(nèi)外環(huán)境中，進(jìn)而污染鮮乳及乳制品[4-5]；蔣奇君等[6]研究顯示，牛乳和環(huán)境中S.aureus的耐藥性嚴(yán)重；王登峰等[7]測定結(jié)果顯示，牛乳中MRSA分離率較高且多重耐藥性較嚴(yán)重，且牛乳中MRSA的一部分源于環(huán)境，很難從牛群中根除。有關(guān)MRSA的報道很多，但在鮮乳生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的分布、耐藥情況和它們的親緣關(guān)系尚未見報道。本試驗從山西部分奶牛養(yǎng)殖場的內(nèi)外環(huán)境、擠奶間環(huán)境及乳等各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)中分離鑒定S.aureus，與MRSA及耐藥性分析，通過mecA基因的高通量測序和ERIC-PCR分析技術(shù)，研究鮮牛乳生產(chǎn)中MRSA的親緣關(guān)系，以期為預(yù)防和控制MRSA的散播和該菌引起的食源性疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 奶牛場基本情況 采集地為山西晉中某奶牛養(yǎng)殖合作社，其中有8個奶牛場，每場約100頭奶牛，共用1個擠奶間。

1.2 質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，購自南京便診公司；白色葡萄球菌(26101-19)，山西省職工醫(yī)學(xué)院惠贈；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(ATCC43300)，購自上海滬崢生物科技公司。

1.3 主要試劑與儀器 頭孢西丁、苯唑西林、青霉素G、慶大霉素、鏈霉素、頭孢噻肟、紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、萬古霉素、氯霉素、甲氧吡啶/磺胺甲惡唑、呋喃妥因、克林霉素、利福平共16種藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；所有引物由北京擎科生物公司合成；PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及培養(yǎng) 棉拭子樣本：用PBS浸潤的無菌棉棒采集牛鼻腔、牛肛門、牛乳頭、圍欄、擠奶器，在無菌操作下將棉拭子樣本直接涂布于5%綿羊血瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。

空氣樣本:使用自然沉降法采集牛舍、牛運(yùn)動場、擠奶間、居民區(qū)，采樣基質(zhì)為5%綿羊血瓊脂平板，采樣隨機(jī)各選取3個點，采樣時間為20 min。

牛乳樣本:選擇采集牛體樣本對應(yīng)奶牛，采集前3把乳，在無菌操作下將乳在7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯中選擇性增菌，用無菌棉棒蘸取培養(yǎng)液均勻涂布于5%綿羊血瓊脂平板。

糞便、飼料樣本：用無菌勺隨機(jī)采取奶牛運(yùn)動場混合糞便和飼料槽中飼料，在無菌操作下將飼料和糞便碾碎后置于生理鹽水中震蕩搖勻，用無菌棉棒蘸取震蕩液均勻涂布于5%綿羊血瓊脂平板。

1.3.2S.aureus的分離純化 挑取血平板上與S.aureus菌落形態(tài)相符的疑似菌株進(jìn)行革蘭染色，將革蘭陽性球菌接種于BP培養(yǎng)基進(jìn)行選擇純化培養(yǎng)，挑取黑色周圍有灰白色圈的單菌落于營養(yǎng)肉湯中增菌培養(yǎng)[8]。

1.3.3 DNA的提取和PCR鑒定 采用SDS法提取細(xì)菌組DNA，測定DNA濃度，根據(jù)S.aureus16S rRNA基因設(shè)計特異性引物。引物序列[9]為：P1:5′-GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3′；P2:5′-TCCCGGTCCTCTCGTACTA-3′，經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳拍照并分析結(jié)果。

1.3.4 MRSA的鑒定 參照美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，用苯唑西林和頭孢西丁藥敏紙片對S.aureus進(jìn)行MRSA表型鑒定，金黃色葡萄球菌(ATCC25923)為質(zhì)控菌。

按文獻(xiàn)[10]設(shè)計檢測耐藥菌株mecA基因的引物，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(ATCC43300)作為陽性對照菌株，金黃色葡萄球菌(ATCC25923)作為陰性對照。引物序列為：M1:5′-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA-3′；M2:5′-CCAATTCCACATTGTT TCGGTCTAA-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳及拍照分析。

1.3.5 MRSA藥物敏感性檢測 按照國標(biāo)SN/T1944-2016進(jìn)行。

1.3.6mecA基因親緣性分析 將MRSA按不同來源進(jìn)行分組，通過SPSS 19.0軟件隨機(jī)抽取20個樣本，其中包括牛乳5株、居民區(qū)空氣1株、擠奶間2株(擠奶間空氣1株、擠奶器1株)、牛場12株(牛體8株：牛鼻腔3株、牛乳頭3株、牛肛門2株；牛場環(huán)境4株：圍欄1株、牛運(yùn)動場1株、飼料1株、糞便1株)。將抽取樣本的mecA基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序。將測序結(jié)果與GenBank中mecA基因序列進(jìn)行比對，用DNAMAN軟件對測序序列進(jìn)行同源性比對。

1.3.7 ERIC-PCR指紋圖譜分析 按文獻(xiàn)[11]設(shè)計引物，對MRSA進(jìn)行ERIC-PCR同源性分析。引物序列為：ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳拍照，使用UPGAMA和NTSYS-pc2.10軟件對分離株的指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，建立遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1S.aureus的分離鑒定 各環(huán)節(jié)樣本經(jīng)分離、鑒定、染色鏡檢及16S rRNA 序列擴(kuò)增，721份樣本中有184份檢測出S.aureu，共得到184株S.aureu。其中，檢出牛乳73株(123份)、牛乳頭17株(68份)、牛鼻腔9株(75份)、牛肛門21株(100份)、圍欄19株(107份)、擠奶器8株(41份)、牛運(yùn)動場6株(46份)、牛舍6株(35份)、擠奶間空氣5株(17份)、居民區(qū)空氣7株(22份)、糞便3株(30份)、飼料10株(30份)。

2.2 MRSA的鑒定 參照美國CLSI標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行MRSA表型鑒定，共鑒定出94株表型耐藥，通過對mecA基因檢測，檢測出90株MRSA，見表1。

表1 MRSA表型鑒定和mecA基因檢測結(jié)果

2.3 MRSA藥敏試驗 MRSA分離株對青霉素G、利福平、克林霉素、呋喃妥因、紅霉素的耐藥率較高，耐藥率分別為95.6%、89%、86.8%、84.6%、80.2%，其次是四環(huán)素72.5%、多西環(huán)素67%、復(fù)合磺胺44%、鏈霉素17.6%、頭孢噻肟6.6%、慶大霉素4.4%、氯霉素4.4%、環(huán)丙沙星2.2%，未檢出萬古霉素耐藥菌株，見表2。對90株MRSA進(jìn)行多重耐藥性分析，多重耐藥率為98.9%(89/90)，多重耐藥數(shù)主要集中在6～8耐，見圖1。

圖1 MRSA多重耐藥結(jié)果

表2 MRSA藥敏結(jié)果

2.4mecA基因序列分析 測序結(jié)果與GenBank中mecA基因進(jìn)行比對，序列相似性為96.44%～99.64%，表明檢測基因均為mecA基因。測序序列同源性比對結(jié)果顯示，檢測mecA基因序列相似性在95.22%以上。同源進(jìn)化樹顯示，mecA基因按同源性在99%以上可分為5大分支，其中牛體MRSA的mecA基因與牛場空氣、圍欄、飼料、糞便的同源性在99%以上；居民區(qū)空氣中MRSA的mecA基因與圍欄、乳頭同源性為99%；R1與RT4、R20與NB7、R5與JNQ3mecA基因同源性在99%以上，見圖2。

圖2 mecA基因序列分析

2.5 ERIC-PCR指紋圖譜分析 ERIC-PCR擴(kuò)增獲得指紋圖譜建立遺傳進(jìn)化樹，以相似性65%為界，可分為4大分支，相似性≥90%可認(rèn)為來源相同，其中乳分離株與牛場(15株)、擠奶間(3株)、居民區(qū)(1株)的同源性在90%以上；糞便分離株與牛鼻腔(2株)同源性在90%以上；飼料分離株與牛體(4株)、牛運(yùn)動場空氣(1株)、乳及擠奶間(4株)的同源性在90%以上；擠奶間空氣6株分離株與牛鼻腔、肛門的同源性在90%以上，見圖3。

圖3 親緣關(guān)系樹狀圖

3 討論

本試驗樣本中S.aureus的檢出率為25.5%(184/721)，其中乳樣本中S.aureus的檢出率為42.9%(73/170)，檢出率較高，但低于王登峰[7]在山西部分地區(qū)乳中S.aureus的檢出率，這與養(yǎng)殖場S.aureus的污染程度有關(guān)，本試驗在生鮮乳生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中和臨近居民區(qū)空氣均檢出大量S.aureus，因此要加強(qiáng)鮮乳生產(chǎn)中各環(huán)節(jié)的檢測和消毒。

表型耐藥的S.aureus，mecA基因檢出率為96.8%，與王登峰[7]結(jié)果相似。Nadarajah J等[12]研究指出，表型耐藥但未攜帶mecA基因的原因可能是條件誘導(dǎo)、質(zhì)粒介導(dǎo)或轉(zhuǎn)氨肽結(jié)構(gòu)域改變等因素造成S.aureus菌株β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)過量。

鮮乳生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中MRSA對青霉素G、利福平、克林霉素、呋喃妥因、紅霉素的耐藥率較高，這與牛場的臨床用藥基本相符，MRSA多重耐藥性嚴(yán)重且耐藥譜與王登峰[7]對山西地區(qū)MRSA的耐藥監(jiān)測一致，表明MRSA分離株可能為山西地區(qū)牛源流行株。擠奶間MRSA的耐藥譜與牛場MRSA基本一致，表明牛場MRSA可能通過牛體、牛場空氣向擠奶環(huán)境散播。

mecA基因同源性比對顯示序列相似性在95.22%以上，但不同序列產(chǎn)生不同程度的堿基位點缺失和突變，這可能與抗生素的過度使用有關(guān)。同源進(jìn)化樹結(jié)果分析顯示，牛體MRSA的mecA基因與牛場環(huán)境的同源性在99%以上，表明牛體MRSA與牛場環(huán)境存在相互散播的可能；居民區(qū)空氣中MRSA的mecA基因與圍欄、乳頭同源性為99%，提示牛場中的MRSA可能向外周環(huán)境中散播；乳中MRSA的mecA基因與乳頭、鼻腔和擠奶器同源性在99%以上，表明乳中MRSA可能來源于乳頭、鼻腔和擠奶器。

ERIC-PCR同源性結(jié)果分析顯示，乳中MRSA與牛場、擠奶間及居民區(qū)的同源性在90%以上，表明鮮乳生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中MRSA均可相互散播污染生鮮乳；糞便中MRSA與牛鼻腔的同源性在90%以上，提示MRSA可能形成微生物氣溶膠經(jīng)呼吸道感染牛；飼料中MRSA與牛體、牛運(yùn)動場空氣、乳及擠奶間的同源性在90%以上，表明在采食過程中?？赏ㄟ^與飼料接觸，污染飼料，飼料中MRSA形成微生物氣溶膠散播于牛場空氣，污染牛體進(jìn)而污染擠奶間；擠奶間空氣中MRSA與牛鼻腔、肛門的同源性在90%以上，提示?？赡芡ㄟ^呼吸和排泄形成微生物氣溶膠污染擠奶間。