吳 雷，席 輝，趙 龍，孫世豪*，宗永立，李河霖，張逸寒，馬濤濤，柴國璧，張啟東

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2. 吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，吉林省延吉市河南街天池路795 號 133001

3. 陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，陜西省寶雞市高新大道100 號 721000

長鏈酯是植物蠟質(zhì)的重要成分，廣泛存在于植物的花、葉、果實和種子等器官中［1-3］。很多煙用天然香料中含有多種長鏈酯，且相對含量較高。長鏈酯主要是棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和亞麻酸的酯類物質(zhì)，該類物質(zhì)沒有顯著的氣味特征，揮發(fā)性低，一般屬于非香氣成分。在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)天然香料中的長鏈酯會影響香料中香氣成分的釋放，從而影響其香氣，但目前相關(guān)文獻(xiàn)報道較少。食品中也含有長鏈酯，它們會影響食品中香氣成分的頂空濃度，從而影響食品的風(fēng)味，目前已有較多文獻(xiàn)報道［4-5］。Brauss 等［6］發(fā)現(xiàn)餅干中揮發(fā)性物質(zhì)的釋放與其脂肪含量有關(guān)，與高脂肪餅干相比，低脂肪餅干釋放的茴香腦顯著增加；Chung等［7］發(fā)現(xiàn)隨著脂肪含量的增加，冰淇淋中苯甲醛和己醛的釋放量減少，而香蘭素的釋放量增加；這些研究結(jié)果對食品工業(yè)有重要的指導(dǎo)作用。因此，研究香精香料中的長鏈酯對其香氣成分釋放的影響具有重要意義。

桂花浸膏是用石油醚［8-9］或超臨界二氧化碳流體［10-11］萃取桂花，制得的天然香料香氣濃郁優(yōu)雅，是食品和煙草業(yè)常用的天然香料，近年來已有較多文獻(xiàn)對其香氣成分進(jìn)行報道［12-14］。桂花浸膏中長鏈酯種類多、含量高［15-17］，但桂花浸膏相關(guān)研究文獻(xiàn)中較少關(guān)注長鏈酯，且未涉及長鏈酯對桂花浸膏香氣成分釋放的影響。

本研究中，在前期對桂花浸膏的全成分進(jìn)行定性分析和對桂花浸膏的主要香氣成分進(jìn)行定量分析［18］的基礎(chǔ)上，采用GC-MS 對桂花浸膏中的長鏈酯進(jìn)行定量分析，并采用大氣壓化學(xué)電離源質(zhì)譜（Atmospheric pressure chemical ionization-Mass spectrometry，APCI-MS）和靜態(tài)頂空－氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（Static headspace-Gas chromatography-Mass spectrometry，SHS-GC-MS）考察長鏈酯對桂花浸膏香氣成分釋放的影響，旨在為桂花浸膏產(chǎn)品的開發(fā)、香精調(diào)配及其在煙草制品和食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

市售桂花浸膏樣品分別購自廣州日化化工有限公司（1#）、江西華寶天然香料油有限公司（2#）、中山聯(lián)久生物科技有限公司（3#）、桂林拓普香料有限公司（5#）和無錫市賽力威生物科技有限公司（6#）。本實驗室自制金桂桂花浸膏（4#）。5#和6#樣品為銀桂桂花浸膏，其余樣品為金桂桂花浸膏。

肉豆蔻酸乙酯（＞98%）、十五酸乙酯（＞97%）、棕櫚酸甲酯（≥99.5%）、亞油酸甲酯（＞95%）、亞麻酸甲酯（＞98%）、硬脂酸甲酯（＞97%）、硬脂酸乙酯（＞99%）、亞油酸乙酯（＞97%）（日本TCI 公司）；亞麻酸乙酯（≥98%）、棕櫚油酸乙酯（＞95%）［阿拉丁試劑（上海）有限公司］；棕櫚酸乙酯（＞97%，美國Alfa Aesar 公司）；苯甲酸芳樟酯（＞98%，美國Sigma-Aldrich 公司）。

CP224S 型電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 公司）；KQ-800DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；大氣壓化學(xué)電離源串聯(lián)質(zhì)譜儀（XevoTMTQ-MS，美國Waters 公司）；7890A/5975C 氣相色譜—質(zhì)譜連用儀（GC-MS）、7694E 靜態(tài)頂空進(jìn)樣器（美國Agilent 公司）。

1.2 方法

1.2.1 4#桂花浸膏制備

除去新鮮桂花中的雜物，按桂花和石油醚比例為1∶2（質(zhì)量∶體積，kg∶L）攪拌浸提2 h，將浸提液與殘渣分離；再用石油醚浸提殘渣兩次，浸提時間為0.5 h，所用石油醚體積為首次浸提時的0.25 倍，合并石油醚提取液，40 ℃減壓濃縮得黃色浸膏。

1.2.2 長鏈酯定量分析

按照各成分的相對含量準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶，用乙醇定容到10 mL，配成混標(biāo)母液，分別移取一定體積的母液（1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05 mL）于 10 mL 容量瓶，分別加入 1 mL質(zhì)量濃度為101.2 μg·mL-1的苯甲酸芳樟酯溶液作內(nèi)標(biāo)，用乙醇定容到10 mL，配制成7 個濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.5 mL 進(jìn)行GC-MS 分析。

準(zhǔn)確稱取一定量的桂花浸膏于10 mL 容量瓶，加入 1 mL 濃度為 101.2 μg·mL-1的苯甲酸芳樟酯溶液作內(nèi)標(biāo)，加入乙醇，在320 W 超聲功率和40 ℃溫度條件下超聲20 min，使桂花浸膏充分溶解分散，用乙醇定容到10 mL，靜置0.5 h，取1.5 mL 進(jìn)行 GC-MS 分析。GC-MS 條件為：

色譜柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：He（99.999%）；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣模式：分流進(jìn)樣，分流比10∶1；升溫程序：起始溫度100 ℃，以5 ℃·min-1升溫至 265 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；EI 離子源溫度：230 ℃；電離能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：選擇離子監(jiān)測；掃描范圍：30～550 amu；溶劑延遲：5 min。各目標(biāo)物選擇離子參數(shù)見表1。

表1 11 種目標(biāo)物的選擇離子參數(shù)Tab.1 Selected ion parameters of 11 target components

1.2.3 桂花浸膏香氣成分釋放分析

以桂花浸膏中長鏈酯的定量分析結(jié)果和作者前期的研究［18］中對桂花浸膏的14 種主要香氣成分定量分析的結(jié)果為基礎(chǔ)，這14 種香氣成分分別是順式－氧化芳樟醇（呋喃型）、反式－氧化芳樟醇（呋喃型）、芳樟醇、苯乙醇、對乙基苯酚、反式－氧化芳樟醇（吡喃型）、順式-氧化芳樟醇（吡喃型）、順式－茶香螺烷、反式－茶香螺烷、對甲氧基苯乙醇、α－紫羅蘭酮、二氫－β－紫羅蘭酮、γ－癸內(nèi)酯、β－紫羅蘭酮。依據(jù)香氣成分和長鏈酯在桂花浸膏中的含量，以乙醇為溶劑等比例復(fù)配2 個香精樣品，其中香精樣品1 只含有香氣成分，香精樣品2 含有香氣成分和長鏈酯。

分別取1 mL 1#和2#香精樣品于2 個10 mL 樣品瓶中，擰緊瓶蓋，在水浴溫度30 ℃條件下平衡0.5 h，用APCI-MS分析其頂空成分。APCI-MS條件為：

離子化模式：正離子模式；離子源溫度：50 ℃；電暈放電電流：5 μA；APCI 噴針溫度：100 ℃；去溶劑氣：N2（99.999%），流速為250 L·h-1；掃描模式：全掃描，掃描范圍m/z100～400；碰撞氣：Ar，流速為0.25 mL·min-1。

1.2.4 長鏈酯含量與香氣成分釋放量關(guān)系分析

利用桂花浸膏的14 種主要香氣成分配制香氣成分混合溶液（每種香氣成分的質(zhì)量濃度均為2 mg·mL-1）。根據(jù)1#桂花浸膏樣品中長鏈酯定量分析結(jié)果，等比例配制長鏈酯混合溶液，其中亞麻酸乙酯濃度為2 mg·mL-1，并配制1 種濃度為2 mg·mL-1的亞麻酸乙酯溶液。上述溶液均以乙醇為溶劑進(jìn)行配制。在10 個10 mL 的頂空分析樣品瓶中分別加入表2 所示的溶液，靜置1 h，用SHS-GC-MS 進(jìn)行分析。SHS-GC-MS 條件為：

樣品瓶加熱溫度：60 ℃，加熱時間30 min；定量環(huán)溫度：80 ℃；傳輸線溫度90 ℃；樣品瓶加壓時間：0.2 min；定量環(huán)平衡時間：0.2 min；進(jìn)樣時間：1 min。進(jìn)樣模式：分流進(jìn)樣，分流比3∶1；升溫程序：起始溫度50 ℃，以5 ℃·min-1升溫至210 ℃；掃描模式：全掃描；溶劑延遲：7 min；其他條件同1.2.2 節(jié)。

表2 不同長鏈酯含量溶液的配制表Tab.2 Formula of long-chain ester solution at different contents

2 結(jié)果與討論

2.1 桂花浸膏中長鏈酯的定量分析

根據(jù)前期的研究結(jié)果［18］，長鏈酯在桂花浸膏中種類多，且含量高，其中11 種長鏈酯為桂花浸膏的共有成分，含量較高，是桂花浸膏中主要的長鏈酯，有較強(qiáng)的代表性。因此，選擇這11 種長鏈酯為目標(biāo)物，用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對其進(jìn)行定量分析。對定量分析GC-MS 條件進(jìn)行優(yōu)化，在節(jié)省時間的同時使色譜峰能較好地分離，桂花浸膏的GC-MS分析總離子流圖見圖1A，11 種長鏈酯標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS 分析總離子流圖見圖1B。

圖1 1#桂花浸膏樣品（A）和長鏈酯標(biāo)準(zhǔn)品（B）GC-MS 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of sweet osmanthus concrete of sample No. 1（A）and long-chain esters standard solutions（B）analyzed by GC-MS

2.1.1 方法驗證

利用1#桂花浸膏樣品進(jìn)行定量分析方法的驗證，定量分析方法驗證的結(jié)果見表3。各目標(biāo)物的決定系數(shù)（R2）均≥0.998，線性關(guān)系良好，能滿足檢測要求。將最低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)GC-MS 分析 10 次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），以 3 倍和10 倍SD 作為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果顯示，LOD小于0.46 μg·mL-1，LOQ小于1.53 μg·mL-1，能滿足檢測要求。取桂花浸膏樣品進(jìn)行6 次平行處理和測定，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），各目標(biāo)物的RSD≤6.71%，這說明方法的精密度較好。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定回收率，根據(jù)樣品的實測含量設(shè)置3 個添加水平，添加量分別為樣品中各目標(biāo)物含量的0.5 倍、1 倍和2 倍，各目標(biāo)物回收率為85.4%～117.9%，這說明方法定量準(zhǔn)確度高，適合于樣品定量分析。

2.1.2 定量分析結(jié)果

6 個桂花浸膏樣品中長鏈酯的定量分析結(jié)果如表4 所示。可以看出，在所選擇的11 種長鏈酯中，金桂和銀桂中含量最高的均為亞麻酸乙酯（23%～62%），其次為棕櫚酸乙酯（12%～17%）、亞油酸乙酯（11%～20%）和亞麻酸甲酯（4%～16%），但金桂中這4 種長鏈酯的含量顯著高于銀桂，而其余長鏈酯在金桂和銀桂中的含量差異較小，且金桂桂花浸膏中長鏈酯總含量（15.1～24.4 mg·g-1）顯著高于銀桂桂花浸膏中長鏈酯總含量（2.6～7.5 mg·g-1）。可見，金桂和銀桂中長鏈酯含量具有較大的差異，這可能是導(dǎo)致兩者香氣差異的因素之一。對于同一種酸，桂花浸膏中乙基酯的含量一般高于甲基酯的含量，可能是由于桂花中香氣成分的自然代謝所致。本實驗室自制桂花浸膏（4#樣品）中長鏈酯總含量偏高，可能是因為減壓濃縮時間較長，溶劑殘留少，導(dǎo)致浸膏中化學(xué)成分含量偏高。

2.2 長鏈酯對桂花浸膏香氣成分釋放的影響

用APCI-MS 對2 種復(fù)配香精樣品的頂空成分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2 所示。圖中的m/z153 為對甲氧基苯乙醇的［M+H］+峰，m/z171 和m/z341 分別為氧化芳樟醇（呋喃型）、氧化芳樟醇（吡喃型）、γ－癸內(nèi)酯的［M+H］+和［2M+H］+峰，m/z193 為α－紫羅蘭酮和β－紫羅蘭酮的［M+H］+峰，m/z195為茶香螺烷和二氫－β－紫羅蘭酮的［M+H］+峰。

表3 11 種目標(biāo)物的回歸方程、檢出限、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率Tab.3 Linear equations, LODs, RSDs and spike recoveries of 11 target components

表4 桂花浸膏樣品中長鏈酯的含量Tab.4 Contents of long-chain esters in sweet osmanthus concrete

比較香精1 頂空成分的質(zhì)譜圖（圖2A）和香精2 頂空成分的質(zhì)譜圖（圖2B）可發(fā)現(xiàn)，圖2B 中m/z171 和m/z341 的質(zhì)譜峰強(qiáng)度高于圖2A 中相應(yīng)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度，說明長鏈酯的存在會使復(fù)配香精中氧化芳樟醇（呋喃型）、氧化芳樟醇（吡喃型）和γ－癸內(nèi)酯的頂空濃度增大。圖2B 中m/z193 的質(zhì)譜峰強(qiáng)度小于圖2A 中相應(yīng)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度，說明在復(fù)配香精中加入長鏈酯后，α－紫羅蘭酮和β－紫羅蘭酮的頂空濃度減小。圖2B 中m/z195 的質(zhì)譜峰強(qiáng)度減小，說明在復(fù)配香精加入長鏈酯后，茶香螺烷和二氫－β－紫羅蘭酮的頂空濃度減小。圖2A與圖2B 的質(zhì)譜峰強(qiáng)度差異說明長鏈酯的加入會改變香氣物質(zhì)的頂空濃度，對桂花浸膏的香氣成分釋放有顯著影響。

將香精1 和香精2 的香氣與天然桂花浸膏的香氣進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)香精1 化學(xué)氣息重，刺激性較大，與天然桂花浸膏的香氣差異較大。添加長鏈酯的2#香精與1#香精相比，化學(xué)氣息和刺激性減弱，香氣較為柔和，不同香韻之間更加協(xié)調(diào)，與天然桂花浸膏的香氣接近。這說明長鏈酯能改善調(diào)配香精的香氣，對桂花浸膏的香氣有顯著影響，是桂花浸膏的重要成分。

圖2 1#香精樣品（A）和2#香精樣品（B）的APCI-MS 質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of flavor samples No. 1（A）and No. 2（B）by APCI-MS

2.3 長鏈酯含量與香氣成分釋放量的關(guān)系

為了進(jìn)一步明確隨著長鏈酯含量的變化，桂花浸膏香氣成分頂空濃度的變化趨勢，將亞麻酸乙酯溶液和長鏈酯混合溶液分別加入桂花浸膏主要香氣成分混合溶液中，用SHS-GC-MS 分析其頂空成分，以各香氣成分在總離子流圖中的峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，加入的長鏈酯混合溶液或亞麻酸乙酯溶液的體積為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖3 所示。加入長鏈酯后，各香氣成分頂空濃度的相對變化值如表5 所示。其中氧化芳樟醇（呋喃型）和對乙基苯酚未檢出，可能是因為這兩種香氣成分在此體系中的揮發(fā)性較低。

圖3 長鏈酯對桂花浸膏香氣成分釋放的影響Fig.3 Effects of long-chain esters on releases of aroma components in sweet osmanthus concrete

圖3 顯示，在香氣成分混合溶液中加入50 μL亞麻酸乙酯溶液后，苯乙醇、對甲氧基苯乙醇、α－紫羅蘭酮、二氫－β－紫羅蘭酮、γ－癸內(nèi)酯、β－紫羅蘭酮、芳樟醇和氧化芳樟醇（吡喃型）的頂空濃度急劇下降，繼續(xù)加入亞麻酸乙酯溶液，其下降趨勢變緩，當(dāng)加入200 μL 亞麻酸乙酯溶液時，頂空濃度趨于穩(wěn)定。茶香螺烷的頂空濃度隨亞麻酸乙酯含量的增加逐漸下降，且下降趨勢近似為直線。表5 顯示，亞麻酸乙酯含量對α－紫羅蘭酮、苯乙醇、對甲氧基苯乙醇、二氫－β－紫羅蘭酮和β－紫羅蘭酮頂空濃度的影響較大，當(dāng)加入400 μL 亞麻酸乙酯溶液時，其頂空濃度分別下降了85.2%、84.4%、78.2%、76.5%和71.6%，這可能是由于苯乙醇和對甲氧基苯乙醇的羥基以及紫羅蘭酮類物質(zhì)酮-烯醇互變后的羥基與亞麻酸乙酯形成氫鍵所致。

在香氣成分混合溶液中加入50 μL 混合長鏈酯溶液后，反式－氧化芳樟醇（吡喃型）、順式-氧化芳樟醇（吡喃型）、γ－癸內(nèi)酯和芳樟醇的頂空濃度升高，分別增加了20.8%、15.7%、9.0%和2.5%；當(dāng)加入100 μL 混合長鏈酯溶液后，γ－癸內(nèi)酯和芳樟醇的頂空濃度下降，而反式－氧化芳樟醇（吡喃型）和順式－氧化芳樟醇（吡喃型）的頂空濃度繼續(xù)升高，與不加長鏈酯相比，分別增加了33.2%和21.8%；繼續(xù)加入混合長鏈酯溶液，上述4 種香氣成分的頂空濃度均下降。順式－茶香螺烷和反式－茶香螺烷的頂空濃度隨混合長鏈酯含量的增加趨于直線下降，且頂空濃度變化最小，當(dāng)加入400 μL 混合長鏈酯溶液后，其頂空濃度僅降低2.1%和3.7%，這可能是因為茶香螺烷與長鏈酯之間的分子間作用力較小，且不易形成氫鍵。

綜上可知，桂花浸膏中長鏈酯的含量對桂花浸膏香氣成分的釋放量有顯著影響，且同一種長鏈酯對不同香氣成分的影響存在較大差異。加入亞麻酸乙酯與加入混合長鏈酯相比，同一種香氣成分頂空濃度的變化呈現(xiàn)較大差異，這說明不同的長鏈酯對同一種香氣成分釋放量的影響存在較大的差異，一些長鏈酯會使某些香氣成分的釋放增強(qiáng)，一些長鏈酯則使其減弱。這與長鏈酯和香氣分子的分子量、分子結(jié)構(gòu)、極性、官能團(tuán)、碳鏈長度、揮發(fā)性、熔點、沸點等理化性質(zhì)有密切的關(guān)系［19-21］，有待于進(jìn)一步研究。長鏈酯與香氣成分釋放量的關(guān)系表明，在開發(fā)新的香精香料產(chǎn)品和調(diào)香的過程中，可以在配方中加入適量長鏈酯，以增強(qiáng)或降低某些香氣成分的釋放量。

表5 加入長鏈酯后香氣成分頂空濃度的相對變化Tab.5 Relative variation of headspace concentration of aroma components after adding long-chain esters

3 結(jié)論

①建立了用于桂花浸膏中長鏈酯定量分析的GC-MS 方法，本方法精密度較好（RSD≤6.71%），檢出限低（LOD＜0.46 μg·mL-1），各目標(biāo)物線性良好（R2≥0.998）。②對于6 個桂花浸膏樣品而言，金桂和銀桂桂花浸膏中含量最高的長鏈酯均為亞麻酸乙酯，其次是棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和亞麻酸甲酯，但金桂桂花浸膏中長鏈酯總含量（15.1～24.4 mg·g-1）顯著高于銀桂桂花浸膏中長鏈酯總含量（2.6～7.5 mg·g-1）。③桂花浸膏中長鏈酯的存在會改變浸膏中香氣成分的頂空濃度，且能顯著改善桂花香精的香氣，是桂花浸膏的重要成分。隨著亞麻酸乙酯含量的增加，各香氣成分的釋放量均降低；隨著混合長鏈酯含量的增加，反式－氧化芳樟醇（吡喃型）、順式－氧化芳樟醇（吡喃型）、γ－癸內(nèi)酯和芳樟醇的釋放量先分別增加33.2%、21.8%、9.0%和2.5%，然后降低。④長鏈酯含量對桂花浸膏香氣成分的釋放量有顯著影響，且對不同香氣成分的影響存在較大差異。