張思遠(yuǎn)， 蔡 昕， 盧曉樺， 鐵子慧， 葉芷钘， 劉丹瓊， 都 昇， 雷水生， 朱曉琴△

1廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣州 5114362廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院皮膚美容科，廣州 510700

癲癇是常見的慢性、反復(fù)發(fā)作性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，影響全世界約1%的人口[1]。我國癲癇患者約為900萬，每年新發(fā)病例約為50～60萬，其發(fā)病率高，治愈率低，已成為我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此，尋找癲癇防治新靶點(diǎn)是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前常用抗癲癇藥物多具有局限性和生物毒性[2-3]，探究新的癲癇治療靶點(diǎn)，尋找一種新的、療效確切、不良反應(yīng)小的抗癲癇藥物，是本研究的初衷。硫化氫(H2S)是經(jīng)由PI3K/Akt信號(hào)通路傳導(dǎo)的一種內(nèi)源性氣體介質(zhì)，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。研究表明，外源性給予硫化氫可保護(hù)實(shí)驗(yàn)性癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的海馬神經(jīng)元[4]。新型H2S供體(novel carbazole-based H2S)作為新興神經(jīng)元保護(hù)性氣體信號(hào)分子的最佳給藥形式，具有可緩釋H2S的特性，可使作用部位藥物濃度長(zhǎng)期維持在較適宜的水平，對(duì)抗癲癇治療藥物的研究具有重要應(yīng)用前景。PI3K/Akt通路是癲癇發(fā)病的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其下游的Bcl-2、Bax分別屬于抗凋亡、促凋亡蛋白，在線粒體凋亡途徑中起重要作用。Li[5]、Uzum[6]、張慧[7]等的研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路參與了改善記憶、抗癲癇的神經(jīng)保護(hù)作用。該通路已被證實(shí)在凋亡、免疫、炎癥等領(lǐng)域與癲癇的發(fā)生相關(guān)[8]。既往研究表明，H2S對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的作用位點(diǎn)包括影響Akt的磷酸化[9]、PI3K的磷酸化[10]。據(jù)此，H2S可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路，在癲癇發(fā)作中起保護(hù)作用。但除此兩個(gè)作用位點(diǎn)以外，H2S對(duì)該通路下游Bcl-2、Bax蛋白及對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究建立癲癇大鼠模型，檢測(cè)不同處理組大鼠癲癇發(fā)作后凋亡指標(biāo)和蛋白表達(dá)的變化，為論證H2S治療癲癇的作用效果及其可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)購自Sigma公司；LY294002購自MedChemExpress(MCE)公司(美國)；兔抗大鼠PI3K、Bax、Bcl-2多克隆抗體，鼠抗Akt多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TUNEL染色試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。新型H2S供體合成方法：取N-乙基-3-咔唑羧基甲醛(200 mg，0.89 mmol)，HONH2·HCl(61.9 mg，0.89 mmol)，AcONa(72.9 mg，0.89 mmol)，加入磷酸二硫代二乙酯(165.5 mg，0.89 mmol)及60 mL二惡烷，將反應(yīng)混合物回流5 h，在真空中蒸發(fā)溶劑，以柱層析法對(duì)其殘?jiān)M(jìn)行純化(乙醚∶乙酸乙酯=20∶1)，得率為86%。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

成年健康SD(Sprague-Dawley)大鼠30只，雄性，體重(200±50)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，其中1組作為正常對(duì)照(Control組)；4組復(fù)制癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)模型，再根據(jù)處理不同分為PTZ致癇組(SE組)、H2S預(yù)處理組(H2S+SE組)、DMSO預(yù)處理組(DMSO+SE組)、抑制劑預(yù)處理組(LY294002+SE組)。每組6只大鼠。

1.3 模型制備

SE模型制備采用首劑1% PTZ(40 mg/kg)腹腔注射，注射后觀察大鼠行為學(xué)變化，若10 min后無SE典型表現(xiàn)，以原始劑量的半量(20 mg/kg)注射，評(píng)估方法同前，之后每隔10 min補(bǔ)加小劑量PTZ(10 mg/kg)，直至誘導(dǎo)SE模型成功即停止給藥。根據(jù)Racine癲癇發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)做行為學(xué)評(píng)估，模型成功標(biāo)志為在30 min內(nèi)≥3次Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作。正常對(duì)照組大鼠給予腹腔注射等劑量生理鹽水。H2S預(yù)處理組在造模前4 h側(cè)腦室注射新型H2S 10 μL(500 μmol/L)，DMSO預(yù)處理組在造模前4 h側(cè)腦室注射10 μL DMSO，抑制劑預(yù)處理組在造模前4 h側(cè)腦室注射PI3K抑制劑LY294002 10 μL(1 μg/μL)，SE組和Control組于同一時(shí)間側(cè)腦室注射等量生理鹽水(10μL)。

1.4 行為學(xué)觀察

根據(jù)Racine癲癇發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估大鼠急性SE模型是否造模成功并記錄發(fā)作級(jí)別與發(fā)作潛伏期。

1.5 腦電檢測(cè)

定位海馬位置(大腦左側(cè)前囟后3.8 mm，矢狀縫旁2.5 mm)，鉆開顱骨并穿過硬腦膜，將不銹鋼雙極銅芯電極插入硬膜下3.0 mm。術(shù)后縫合部分皮膚，以活力碘消毒皮膚預(yù)防感染，將大鼠置于空籠內(nèi)，30 min后待大鼠清醒，分組誘導(dǎo)SE模型，將引導(dǎo)電極信號(hào)通過BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄海馬腦電信號(hào)。

1.6 TUNEL法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡情況

于模型制備成功后4 h每組各取2只大鼠，麻醉處死后取全腦組織，OCT包埋，冰凍切片，厚度約40 μm。切片以多聚甲醛固定，蛋白酶K通透處理，滴加PBS孵育，以TdT孵育緩沖液37℃恒溫孵育1 h，PBS沖洗3次，吸棄殘余PBS液，以抗熒光淬滅封片液和封片油封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元CA1區(qū)域。凋亡細(xì)胞核被染成綠色，于高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.7 Western blot法檢測(cè)各組大鼠腦組織中PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

于模型制備成功后4 h每組各取3只大鼠，麻醉處死后各取50 mg海馬組織，研磨后加入含蛋白酶抑制劑的裂解液，于4℃下13000 r/min離心15 min，取上清，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。所提取蛋白經(jīng)99℃煮5 min變性，再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分離的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4℃下以5%牛血清蛋白封閉2 h，將一抗兔抗大鼠PI3K、Bax、Bcl-2多克隆抗體及鼠抗Akt多克隆抗體加入(稀釋度均為1∶1000)，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入二抗(稀釋度1∶1000)，室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，避光反應(yīng)并拍照，利用Image J圖像分析軟件以GAPDH蛋白為參考獲得PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察

復(fù)制SE模型的大鼠在注射PTZ后，依次表現(xiàn)為Ⅰ到Ⅴ級(jí)發(fā)作，部分嚴(yán)重發(fā)作的大鼠可以觀察到四肢角弓反張，尾強(qiáng)直，甚至抽搐死亡。共24只大鼠造模，5只因劇烈抽搐死亡，2只未點(diǎn)燃成功，其余17只大鼠均達(dá)到Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作狀態(tài)，且在30 min內(nèi)均有>3次發(fā)作，造模成功率為70.8%。

正常對(duì)照組無發(fā)作；SE組與DMSO+SE組的發(fā)作潛伏期及發(fā)作級(jí)別無明顯差異；與SE組比較，H2S+SE組癲癇發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01)，而抑制劑預(yù)處理組(LY294002+SE組)癲癇發(fā)作潛伏期縮短(P<0.05)，見表1。

表1 癲癇發(fā)作至Ⅳ級(jí)及以上的潛伏期及持續(xù)時(shí)間Table 1 Incubation period of the rats with epileptic seizure

2.2 腦電圖波形

腦電結(jié)果顯示(圖1)，正常對(duì)照組為正常腦電圖波，SE組記錄到棘波、尖波等癇樣波。SE組癇樣波波幅[(69.5±10.4)mV]與DMSO+SE組[(71.4±7.4)mV]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.756)；H2S+SE組癇樣波波幅[(27.1±1.8)mV]較SE組降低(P=0.001)，LY294002+SE組癇樣波波幅[(100.2±20.7)mV]較SE組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)。

圖1 各組大鼠海馬腦電記錄圖Fig.1 Hippocampal electroencephalogram of rats in each group

2.3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡

大鼠海馬切片TUNEL染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組5個(gè)高倍鏡視野下的平均凋亡細(xì)胞數(shù)最少(10.2±1.3)，SE組(56.0±7.0)和DMSO+SE組(58.8±6.1)的凋亡細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組顯著增加(均P<0.01)。與SE組比較，H2S+SE組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(34.6±5.9，P=0.01)，LY294002+SE組凋亡情況最為嚴(yán)重(111.8±17.2)。見圖2。

箭頭所示為被TUNEL試劑染成綠色熒光的凋亡海馬神經(jīng)元細(xì)胞核圖2 TUNEL染色熒光切片F(xiàn)ig.2 Fluorescence section with TUNEL staining

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3)，SE組與DMSO+SE組各蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，PI3K、Akt、Bcl-2、Bax表達(dá)量從高到低均依次為H2S+SE組、DMSO+SE組及SE組、LY294002+SE組、Control組。與SE組比較，Bcl-2/Bax比值在H2S+SE組顯著升高(P<0.05，圖4)。

1：Control組；2：H2S+SE組；3：LY294002+SE組；4：DMSO+SE組；5：SE組圖3 Western blot檢測(cè)各蛋白在大鼠海馬組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of proteins in hippocampal tissues of rats detected by Western blotting

1：Control組；2：H2S+SE組；3：LY294002+SE組；4：DMSO+SE組；5：SE組；與SE組比較，*P<0.05；與Control組比較，△P<0.05圖4 各組Bcl-2/Bax比值比較Fig.4 Relative expression ratio of Bcl-2/Bax

3 討論

已有研究顯示，癲癇發(fā)作后神經(jīng)元凋亡是非常重要的損傷形式，而海馬特別容易受到癲癇引起的損傷[11]。當(dāng)前研究表明，癲癇后伴有神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和缺失，Sloviter等[12]和Cavazos 等[13]分別在在顳葉癲癇患者大腦和各種不同的癲癇動(dòng)物模型中，觀察到長(zhǎng)期的癲癇發(fā)作造成海馬錐體細(xì)胞大量減少、膠質(zhì)細(xì)胞增生，形成海馬硬化。另一方面，癲癇引起海馬神經(jīng)元凋亡丟失，將進(jìn)一步引起癲癇反復(fù)發(fā)作，故患有癲癇誘發(fā)海馬損傷的動(dòng)物會(huì)經(jīng)歷更頻繁且嚴(yán)重的癲癇發(fā)作[14]。本實(shí)驗(yàn)中，行為學(xué)和腦電圖證實(shí)癲癇發(fā)作的SE組與正常對(duì)照組相比較，神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)增多，提示癲癇促進(jìn)凋亡；而LY294002+SE組的抗凋亡通路被抑制，與SE組比較，其海馬組織凋亡加重，其腦電圖波幅升高、癲癇發(fā)作潛伏期縮短，直接提示神經(jīng)元凋亡在癲癇發(fā)作中的正向效應(yīng)。橫向比較，5組海馬神經(jīng)元凋亡情況均與行為學(xué)觀測(cè)結(jié)果和腦電圖波幅變化正相關(guān)，再次說明凋亡極有可能是影響癲癇發(fā)作程度的重要因素。基于此，我們可以認(rèn)為癲癇引起的海馬神經(jīng)元凋亡和丟失與癲癇的進(jìn)一步加重和反復(fù)發(fā)作是互為因果而相互促進(jìn)的。

Henshall等[15]認(rèn)為阻斷細(xì)胞凋亡是一種神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，但其不良反應(yīng)限制了臨床上用于治療長(zhǎng)期或復(fù)發(fā)性癲癇，否則可能成為一種新的神經(jīng)保護(hù)的替代方法。這也意味著干預(yù)凋亡通路可能是一種具有潛在價(jià)值的輔助神經(jīng)保護(hù)或抗癲癇策略。而新型H2S供體作為一種新型分子干預(yù)形式，結(jié)合了H2S分子的藥理特點(diǎn)和探針形式的優(yōu)點(diǎn)。一方面，H2S可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路而改變Bcl-2/Bax比值，減小神經(jīng)元凋亡指數(shù)，保護(hù)神經(jīng)功能[16]。另一方面，作為親脂性氣體的載體，新型H2S供體給藥方便，可自由通過細(xì)胞膜激活PI3K/Akt通路而不需結(jié)合胞膜受體，決定了它比之其他藥物更靈活。同前所述，研究已證實(shí)PI3K/Akt通路參與了改善記憶、抗癲癇的神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]，而H2S對(duì)該通路有激活作用[4，10]。在本研究中，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示與SE組相比，H2S+SE組PI3K、Akt表達(dá)量，Bcl-2/Bax比值均升高，TUNEL染色示凋亡情況改善，行為學(xué)和腦電圖示癲癇發(fā)作程度減輕，同上述研究所得結(jié)果一致。而PI3K通路抑制后上述蛋白表達(dá)量下降，也從反面論證了這一點(diǎn)。從H2S+SE組、SE組到LY294002+SE組，PI3K通路激活程度從高到低，凋亡和癲癇發(fā)作情況從輕到重，有力支持了H2S可通過改善神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用從而抑制癲癇的觀點(diǎn)。

大多數(shù)硫化氫的相關(guān)研究是以硫化物鹽(NaHS和Na2S)為供體進(jìn)行的，但由于其易被氧化為硫烷硫而并不適用于臨床。與傳統(tǒng)的供體硫氫化鈉相比，新型芳基硫代酰胺類H2S供體更為穩(wěn)定，同時(shí)還具有緩釋的特性，能使H2S相對(duì)穩(wěn)定在生理濃度發(fā)揮效應(yīng)，同時(shí)能避免傳統(tǒng)硫化氫供體快速釋放H2S導(dǎo)致濃度過高，從而引起如血壓下降過快等不利影響。此外，經(jīng)過動(dòng)物和分子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新型H2S供體具有良好的安全性和細(xì)胞成像能力，適用于基礎(chǔ)研究和對(duì)臨床應(yīng)用的探索。

癲癇的凋亡相關(guān)發(fā)病機(jī)制可能是：神經(jīng)元異常同步放電致使癲癇初次發(fā)作，海馬神經(jīng)元受損凋亡，引起丟失；數(shù)量減少的海馬神經(jīng)元同步異常放電的次數(shù)增加，癲癇發(fā)作加重或反復(fù)發(fā)作；癲癇發(fā)作后機(jī)體內(nèi)源性H2S代償性增加，激活PI3K/Akt通路，(此時(shí)外源性補(bǔ)充生理濃度的H2S可增加通路的激活程度)，一方面促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制Ca2+內(nèi)流和Cyt C向胞內(nèi)轉(zhuǎn)移；另一方面可抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)并進(jìn)一步抑制其與線粒體外膜上的離子通道相結(jié)合，進(jìn)而抑制Cyt C、Caspase酶原向胞內(nèi)轉(zhuǎn)移[17]；在這個(gè)過程中，Bcl-2可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制Bax的功能。這兩方面作用的共同結(jié)果將抑制凋亡啟動(dòng)復(fù)合物的產(chǎn)生，從而抑制海馬神經(jīng)元的凋亡[18]，進(jìn)一步抑制癲癇的反復(fù)發(fā)作和程度加重。在此過程中，癲癇發(fā)作可以被部分看作是由凋亡引起的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，凋亡程度越大將更加重癲癇發(fā)作程度，反過來又進(jìn)一步導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的丟失。而外源性補(bǔ)充生理濃度的硫化氫則是阻止這一過程、防止神經(jīng)元進(jìn)一步損傷的保護(hù)因素。綜上所述，H2S可能通過激活PI3K/Akt通路改變其所介導(dǎo)的凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，從而升高Bcl-2和Bax的比值而減少海馬神經(jīng)元的凋亡，進(jìn)而起到對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用和抑制癲癇的治療作用。