趙雅芝，潘 巧，王顯兵，郝文君，劉 桐，王秀梅*，辛九慶*

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/動物支原體病創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069）

牛支原體（Mycoplasma bovis，M. bovis）是現(xiàn)有的最小的原核微生物，無細胞壁，可以通過0.22 μm濾器[1]，是一種宿主特異性粘膜常在菌，感染能夠引起犢牛的肺炎、關節(jié)炎及奶牛乳房炎等疾病[2]，且常常與其它病原體混合感染導致病情復雜持久不愈，是危害我國養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。支原體表面有豐富的脂質(zhì)相關膜蛋白（Lipid-associated mem?brane proteins，LAMPs），其能夠介導支原體黏附感染宿主，調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)[3]，其通過與TLRs 相互作用在炎癥反應的起始中起重要作用[4]。本研究從前期獲得的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中[5]，分析了M.bovis LAMPs 刺激前后EBL 細胞差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)M. bovis LAMPs 刺激后EBL 細胞上調(diào)表達TRIM9 基因。TRIM9 基因?qū)儆谌Y構域蛋白（Tripartitemotif，TRIM）家族，該家族蛋白存在于所有多細胞動物體內(nèi)，目前包含70 多個成員。越來越多的證據(jù)表明，許多TRIM 家族蛋白與抗感染免疫相關[6]。最近有文獻報道TRIM9 與NF-κB 信號通路的調(diào)控相關[7-8]。而以前的文獻報道表明M.bovis LAMPs 能夠通過NF-κB信號通路誘導EBL 細胞釋放IL-1β[9]。為探究TRIM9基因在M.bovis LAMPs 刺激EBL 細胞釋放IL-1β中的作用，本研究構建TRIM9 基因過表達和敲低的EBL細胞模型，采用qPCR，ELISA 和western blot 等試驗方法，解析了TRIM9 基因在M.bovis LAMPs 誘導EBL細胞釋放IL-1β中積極調(diào)控的作用，為宿主基因調(diào)控M.bovis LAMPs 誘導的天然免疫應答機制提供理論依據(jù)，同時也為后期疫苗研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料M.bovis 牛2c 株、EBL 細胞、M.bovis LAMPs、NP-40、pEGFP-C1 質(zhì)粒均由本實驗室保存；pCMV-C-HA 質(zhì)粒購自碧云天公司。BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司；限制性內(nèi)切酶BamH I 與Sal I 購 自NEB 公 司；Prime STAR Max Pre?mix（2×）購自TaKaRa 公司；DMEM/HIGH GLUCOSE購自HyClone；Plasmid Mini Kit I、Gel Extraction Kit購自OMEGA 公司；Simply P 總RNA 提取試劑盒購自博日公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR?Green Master（ROX）購自Roche 公 司；TransIT-X2?System 購 自Mirus 公 司；Bovine Interleukin 1 Beta ELISE Kit 購自MYBioSource公司。

1.2 引物設計和合成參考GenBank 中GAPDH（AC_000162），IL-1β（NM_174093）和 牛 源TRIM9（NM_001076537）基因mRNA 序列，采用Primer Pre?mier 5.0 軟件和CE DesignV1.03 軟件設計qPCR 及PCR引物，TRIM9 基因序列特異性引物兩端分別加入BamH I 和Sal I 酶切位點，引物信息見表1，以上引物均由華大基因科技有限公司合成。委托SIGMA 公司設計合成TRIM9 基因干擾引物si-TRIM9。

1.3 TRIM9 和IL-1β基因表達的檢測將生長至對數(shù)期的EBL 細胞以1×109個/cm2的密度接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長至80%～90%時，依據(jù)實驗室前期摸索M. bovis LAMPs 刺激EBL 細胞的最佳條件[9]，加入終濃度2 μg/mL 的M.bovis LAMPs，設置空白對照，5%CO237 ℃誘導培養(yǎng)12 h 后收集細胞，利用Simply P總RNA提取試劑盒提取RNA，經(jīng)Transcrip?tor First Strand cDNA Synthesis Kit 將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cD?NA，并以cDNA 為模板采用1L-1β-F/R 和TRIM9-RTF/R引物，利用qPCR方法分別檢測M.bovis LAMPs刺激后EBL 細胞中TRIM9 和IL-1β的相對表達量，實驗設GAPDH（AC_000162）為內(nèi)參基因，qPCR 反應條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s、60 ℃1 min，40個循環(huán)；95 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃1 s。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.4 TRIM9 亞細胞定位檢測以1.3 中方法制備EBL 細胞基因組cDNA 作為為模板，采用TRIM9-GFP-F/R 引物，利用PCR 方法擴增TRIM9（擴增條件為：95 ℃5 min；95 ℃30 s、61 ℃30 s、72 ℃30 s，40 個循環(huán)；72 ℃10 min），并回收目的片段，連接于BamH I 與Sal I 雙酶切處理純化的pEGFP-C1 載體，構建綠色熒光融合質(zhì)粒pEGFP-C1-TRIM9，雙酶切和測序鑒定陽性質(zhì)粒（終濃度2 μg/mL）轉(zhuǎn)染EBL細胞，對照組轉(zhuǎn)染pEGFP-C1 質(zhì)粒，每組設置3 個樣品，重復3 次實驗，24 h 后用1 mL PBS 洗3 次，10 min/次，然后加入1 mL 的4%多聚甲醛，室溫固定15 min，PBS 洗3 次，加入0.5%Triton-X-100 室溫穿 孔15 min，PBS 洗3 次，加入DAPI 染色15 min，利用高分辨率活細胞共聚焦顯微鏡觀察TRIM9 在EBL 細胞中的定位。

1.5 過表達質(zhì)粒pCMV-C-HA-TRIM9 轉(zhuǎn)染EBL 細胞的最佳劑量確定按照1.4 中方法采用TRIM9-CHA-F/R引物，構建過表達質(zhì)粒pCMV-C-HA-TRIM9，將不同濃度的過表達質(zhì)粒pCMV-C-HA-TRIM9（1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL 和8 μg/mL）分別轉(zhuǎn)染EBL 細胞，以pCMV-C-HA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EBL 細胞作為對照，36 h 后利用ELISA 檢測試劑盒檢測培養(yǎng)基中IL-1β的釋放量。同時收集細胞，按1.3中方法提取基因組制備cDNA，并以cDNA為模板，以1L-1β-F/R 為引物，GAPDH（AC000162）為內(nèi)參基因，按照1.3 中qPCR 方法檢測EBL 細胞中IL-1β相對表達量，重復3次實驗，以引起IL-1β最高表達量且對EBL細胞影響輕微的轉(zhuǎn)染劑量作為最佳劑量。

1.6 過表達及敲低TRIM9 對M. bovis LAMPs 刺激EBL 細胞釋放IL-1β的影響將最佳劑量過表達質(zhì)粒pCMV-C-HA-TRIM9 和si-TRIM9 分別轉(zhuǎn)染EBL 細胞，同時分別轉(zhuǎn)染pCMV-C-HA 和對照siRNA 作為對照組，在5%CO237 ℃培養(yǎng)24 h后加入終濃度2 μg/mL的牛支原體LAMPs 繼續(xù)培養(yǎng)12 h，重復3 次實驗，利用qPCR 檢測IL-1β相對表達量，同時利用Bovine Interleukin 1 Beta ELISE Kit 檢測EBL 細胞IL-1β的釋放量。

1.7 NF-κB 信號通路激活水平檢測NF-κB 由p50 亞基和p65 亞基組成，p65 亞基進核和磷酸化是激活NF-κB 信號通路的標志。為分析TRIM9 在NF-κB 信號通路中的作用。本試驗檢測了TRIM9 過表達及敲低時LAMPs 刺激EBL 細胞后的p65 磷酸化水平。以1.5 中確定的pCMV-C-HA-TRIM9 最佳濃度和si-TRIM9 分別轉(zhuǎn)染EBL 細胞，5% CO237 ℃培養(yǎng)24 h 后加入終濃度2 μg/mL 的牛支原體LAMPs 繼續(xù)培養(yǎng)12 h，同時設只加入轉(zhuǎn)染試劑組和LAMPs刺激組為對照組。NP-40 裂解細胞獲取總蛋白，以抗p-p65（1:1 000）抗體為一抗，以山羊抗兔IgG（1:10 000）熒光抗體為二抗，進行western blot 檢測，利用Odys?sey?紅外掃描儀掃描NC 膜，使用Image studio 軟件對結果進行灰度值分析，檢測p65 磷酸化水平，本實驗重復3 次。

2 結 果

2.1 M. bovis LAMPs 刺激對EBL 細胞中TRIM9 和IL-1β基因轉(zhuǎn)錄水平的影響M. bovis LAMPs 刺激EBL 細胞后，采用qPCR 方法對TRIM9 和IL-1β基因的mRNA 表達量進行檢測，結果顯示與對照組相比TRIM9 mRNA 表達量上調(diào)2.9 倍（圖1A），與本實驗室前期獲得的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[5]分析相符；IL-1β mRNA表達量也上調(diào)2.6 倍（圖1B）。表明TRIM9 基因可能與M.bovis LAMPs刺激EBL 細胞釋放IL-1β相關。

圖1 qPCR 檢測LAMPS 刺激后EBL 細胞TRIM9(A)和IL-1β(B)的相對表達量Fig.1 The relative expression of TRIM9 and IL-1β in EBL cells stimulated by M.bovis LAMPs was detected by qPCR

2.2 TRIM9 蛋白在EBL 細胞中的定位檢測結果以EBL 細胞基因組cDNA 為模板，PCR 擴增TRIM9基因，構建綠色熒光融合質(zhì)粒pEGFP-C1-TRIM9，酶切鑒定結果顯示得到約2 100 bp 大小的目的片段，大小與預期相符（圖2）；測序結果與NCBI 參考序列（NM_001076537）的同源性100%。表明正確構建了綠色熒光融合質(zhì)粒pEGFP-C1-TRIM9。

圖2 pEGFP-C1-TRIM9 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant plasmid pEGFP-C1-TRIM9

將綠色熒光融合質(zhì)粒pEGFP-C1-TRIM9 轉(zhuǎn)染EBL細胞，利用高分辨率活細胞共聚焦顯微鏡LSM800-ZEISS 觀察可見，對照組細胞中無明顯綠色熒光，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-TRIM9質(zhì)粒的EBL細胞胞漿中呈現(xiàn)綠色熒光，細胞核僅藍色熒光，重復實驗結果一致，表明TRIM9蛋白能夠瞬時表達于EBL細胞的胞漿中。

圖3 高分辨率活細胞共聚焦顯微鏡TRIM9 亞細胞定位Fig.3 The subcellular observation of TRIM9 by LSM800

2.3 過表達質(zhì)粒pCMV-C-HA-TRIM9 轉(zhuǎn)染EBL 細胞的最佳劑量將鑒定陽性的過表達質(zhì)粒pC?MV-C-HA-TRIM9（圖略）以不同濃度梯度轉(zhuǎn)染EBL細胞，利用qPCR 和ELISA 法分別檢測IL-1β的表達量，結果顯示，轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒pCMV-C-HATRIM9 后EBL 細胞中IL-1β表達量高于對照組，且兩者呈劑量依賴性，當轉(zhuǎn)染的pCMV-C-HA-TRIM9質(zhì)粒終濃度為4 μg/mL 時IL-1β表達量最高，由此確定重組質(zhì)粒的最佳轉(zhuǎn)染劑量為4 μg/mL（圖4）。

圖4 qPCR(A)和ELISA(B)方法檢測過表達TRIM9 基因后EBL 細胞IL-1β的相對表達量Fig.4 The relative expression of IL-1β in EBL cells after overexpression of TRIM9 gene was detected by qPCR(A)and ELISA(B)

2.4 敲低以及過表達TRIM9 后EBL 細胞中IL-1β檢測結果為確定TRIM9 對IL-1β表達的影響，分別將si-TRIM9 和過表達質(zhì)粒pCMV-C-HA-TRIM9 轉(zhuǎn)染EBL 細胞，經(jīng)M.bovis LAMPs 刺激，利用qPCR 和ELISA 檢測敲低和過表達TRIM9 時IL-1β的表達量，結果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染si-TRIM9后TRIM9顯著下調(diào)表達（p<0.001），而轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒pCMV-CHA-TRIM9 后TRIM9 顯著上調(diào)表達（p<0.001）（圖5A），表明已將TRIM9 基因在EBL 細胞中敲低及過表達。qPCR 檢測結果顯示，與對照組相比，LAMPs 刺激后正常細胞中IL-1β上調(diào)2.4 倍，敲低TRIM9 后，細胞中IL-1β上調(diào)33 倍，而過表達組中IL-1β上調(diào)2.3 倍（圖5B）；ELISA 檢測結果顯示LAMPs 刺激后正常細胞中IL-1β上調(diào)2.9 倍，敲低組EBL 細胞IL-1β釋放量上調(diào)30倍，而過表達組EBL細胞IL-1β釋放量上調(diào)2.9倍（圖5C），與qPCR 結果趨勢一致。以上結果表明過表達TRIM9 基因?qū)L-1β表達無影響，而敲低TRIM9基因可促進IL-1β表達。

圖5 敲低及過表達TRIM9 基因后EBL 細胞TRIM9(A)和IL-1β(B,C)的相對表達量Fig.5 The relative expression of TRIM9 and IL-1β in EBL cells after knockdown and over-expression of TRIM9 gene

2.5 NF-κB 信號通路檢測結果分別檢測了敲低和過表達TRIM9 基因后EBL 細胞中p65 磷酸化水平。結果顯示，與對照組相比，敲低TRIM9 后EBL細胞中p65 磷酸化水平顯著升高（p<0.01），而過表達TRIM9 蛋白后EBL 細胞中p65 磷酸化水平無明顯變化（圖6）。表明過表達TRIM9 后牛支原體LAMPs不誘導NF-κB 信號通路激活；而敲低TRIM9 后牛支原體LAMPs 能夠促進p65 磷酸化水平提高從而激活NF-κB 信號通路。

圖6 Western blot 檢測敲低及過表達TRIM9 基因后EBL 細胞中p65 磷酸化(A)和灰度值分析(B)Fig.6 Detection of p65 phosphorylation(A)and gray value analysis(B)of p65 phosphorylation in EBL cells after knockdown and over expression with TRIM9 gene by western blot

3 討 論

前期研究表明M. bovis LAMPs 通過NF-κB 信號通路誘導EBL 細胞釋放IL-1β[9-10]，引發(fā)EBL 細胞的炎性反應，但EBL 細胞中參與M.bovis LAMPs 引起的炎性反應的相關基因尚不明確。本實驗通過對前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[5]分析，篩選出可能參與調(diào)控NF-κB 信號通路的TRIM9 基因，通過參考GenBank中TRIM9 的序列設計引物，采用qPCR 方法驗證，結果表明M.bovis LAMPs 刺激EBL 細胞增強IL-1β表達的同時，TRIM9 基因也上調(diào)表達。相關文獻報道TRIM 家族基因參與多種細胞功能，包括調(diào)節(jié)先天免疫反應[6]，TRIM9 最初被認為主要存在于胚胎和成人大腦內(nèi)，調(diào)控神經(jīng)元的發(fā)育成熟[11-12]。本研究通過亞細胞定位證明TRIM9基因能夠在EBL細胞內(nèi)表達。為了探究TRIM9 基因是否參與及調(diào)控M. bovis LAMPs 誘導EBL 細胞IL-1β的釋放，采用qPCR 和ELISA 方法檢測過表達和敲低TRIM9 基因后M.bovis LAMPs 刺激EBL 細胞引起IL-1β表達情況，結果顯示當TRIM9 基因過表達時EBL 細胞中IL-1β表達量無明顯變化，而敲低TRIM9 基因后EBL 細胞IL-1β表達量上調(diào)。表明敲低TRIM9 基因促進M. bovis AMPs 誘導EBL 細胞釋放IL-1β。為驗證此過程是否通過NF-κB 信號通路，采用western blot 方法檢測了同樣實驗條件下NF-κB 信號通路激活水平，發(fā)現(xiàn)過表達TRIM9 基因后M. bovis LAMPs 刺激EBL 細胞中p65 磷酸化水平與對照組相比無明顯變化；而敲低TRIM9 后檢測到刺激后的EBL 細胞中p65 磷酸化水平明顯升高，表明敲低TRIM9 基因促進M. bovis AMPs 誘導NF-κB 信號通路激活。由此表明，敲低TRIM9，促進M. bovis LAMPs 誘導EBL 細胞中NF-κB信號通路的激活，從而促進其IL-1β的釋放。Liu Y等發(fā)現(xiàn)牡蠣中TRIM9 同源物參與負調(diào)控NF-κB 活動[7]，Shi M 等的研究也顯示TRIM9 磷酸化殘基與β-TrCP的重復區(qū)WD 40 的相互作用阻止了β-TrCP 與底物結合，穩(wěn)定IκBα和P100，從而阻斷NF-κB 的激活直接影響NF-κB 誘導的炎性細胞因子的產(chǎn)生[8]，文獻資料說明TRIM9 能夠阻斷NF-κB 的激活，本實驗中敲低TRIM9 基因后M.bovis LAMPs 刺激細胞試驗結果，與之前的文獻結果相一致，但是正向的過表達TRIM9 基因后M.bovis LAMPs 刺激細胞試驗，并未驗證該阻斷效應。推測一方面可能與2 μg/mL M.bovis LAMPs 刺激IL-1β的釋放量不高，過表達TRIM9 基因阻斷效應不明顯，另一方面可能可能與TRIM9 基因過表達模型構建不適當相關。今后研究也將繼續(xù)針對該部分實驗進行進一步驗證和探索。綜上所述，本研究對TRIM9 在調(diào)控M.bovis 誘導宿主細胞免疫應答反應中的機制初步探究，解析宿主基因調(diào)控M.bovis 引起宿主細胞免疫應答反應的機制，為開展進一步研究奠定基礎。