朱 沛，李占鴻，謝佳芮，牛保生，姚萍芬，朱建波，肖 雷*，李華春*

（1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 云南省師宗縣動物疫病控制中心，云南 師宗 655700）

藍舌?。˙T）是由呼腸孤類病毒科環(huán)狀病毒屬的藍舌病病毒（BTV）引起的非接觸性蟲媒病毒病[1-2]，BTV 為雙鏈RNA 病毒，基因組大小約為20 kb，由Segment1（Seg-1）～Segment10（Seg-10）10 個 節(jié) 段 組成，可編碼7 種結構蛋白（VP1～VP7）和5 種非結構蛋白（NS1～NS3、NS3a、NS4）[3]，其中VP7 是BTV 內衣殼的結構蛋白[4]，決定了BTV 的群特異性，不同血清型BTV 的VP7 蛋白氨基酸序列的相似度可達94%以上[5]；而VP2 由L2 基因編碼，在不同血清型的病毒之間保守性最低，其氨基酸序列在不同血清型病毒株間的差異在22.7%（BTV-4 與BTV-20）至72.9%（BTV-6與BTV-22）[6]，VP2 是誘導BTV 產生特異性中和抗體的主要蛋白，決定了BTV 的血清型，迄今全球已確認的血清型共有27 個（BTV1～BTV27）[7-9]。

動物感染BT 后表現為發(fā)熱、黏膜水腫、鼻腔及胃腸黏膜嚴重卡他性炎癥，伴隨舌頭發(fā)紺，以綿羊和牛最易感，動物感染BTV 的平均死亡率為30%，綿羊高達80%[10]，該病對牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成的經濟損失嚴重，據估計全球每年僅因BT 而導致的經濟損失高達30 億美元[11]，BTV 血清型眾多，不同血清型之間交叉保護弱，給BT 的防控帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)，該病目前沒有很好的預防辦法，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將BT 列為法定報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。自1979 年張念祖等人首次從云南分離到BTV 后，全國范圍內陸續(xù)分離到7 個血清型的BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16），此外2012年肖雷等從云南省師宗縣牛血液中分離到一株BTV-5[12]，2013 年李占鴻等從云南省芒市分離到一株BTV-9，2014年呂敏娜等從廣東省牛血液中分離一株BTV-7[13]，雖然前期血清學調查顯示中國部分地區(qū)存在BTV-2 的流行，但甚少有BTV-2的分離報道，本實驗室從2017 年6 月師宗縣牛的抗凝血中分離到一株BTV-2，并對分離株的Seg-2及Seg-7序列的遺傳特性進行分析，為開展BTV-2 在中國的流行趨勢、遺傳特性以及致病性的深入研究奠定了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 監(jiān)控點及樣品采集從氣候條件、海拔高度等因素綜合考量，選擇云南省師宗縣、江城縣及芒市鎮(zhèn)作為監(jiān)控點，采取競爭ELISA 方法檢測牛羊BTV 抗體情況，篩選BTV 抗體陰性的10 頭牛和5 只羊作為哨兵動物，每年5 月至10 月每周采血一次，11 月至次年4 月每月采血一次。每次采集一份無抗凝劑全血和一份肝素鈉抗凝血，并及時送至實驗室開展病毒檢測及分離工作。

1.2 主要試劑BTV 競爭ELISA（C-ELISA）抗體檢測試劑盒、倉鼠腎細胞（BHK-21）、蚊子細胞（C6/36）、BTV 標準株及其標準血清均由云南省畜牧獸醫(yī)科學院熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室提供；E.coli DH5α感受態(tài)細胞、DNA 膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；病毒RNA 提取試劑盒、PrimeScript One Step RT-PCR 試劑盒、pMD18-T載體、DNA Marker 均購自TaKaRa 公司。

1.3 哨兵動物血清BTV 抗體檢測參照BTV C-ELISA 抗體檢測試劑盒說明書檢測2017 年監(jiān)控動物血清樣品共1350 份。

1.4 哨兵動物血液BTV 的檢測取哨兵動物BTV抗體轉陽時間點前后兩周的抗凝血200 μL，用1 mL滅菌PBS 洗滌3 次后，離心棄上清，1 mL 超純水使紅細胞裂解，按病毒RNA 提取試劑盒說明書提取病毒總RNA，RNA 經95 ℃變性5min 后，以其作為PCR 檢測的模板。針對BTV 最保守的VP7 設計引物，BTV-S7-F：5'-GTAAGTGTAATCTAAGAGA-3'；BTV-S7-R：5'-GTAAGTTTAAATCGCAAGACG-3'，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。RT-PCR 反應條件為：45 ℃40 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃60 s，40 個循環(huán)，PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；并以本實驗室建立的BTV 高通量Real-Time qRT-PCR 方法進行BTV 核酸檢測。

1.5 病毒分離與電鏡觀察取核酸檢測為BTV 陽性的抗凝血紅細胞200 μL，靜脈接種于10 日齡健康雞胚中，每枚雞胚接種0.1 mL，37 ℃孵化箱培養(yǎng)，廢棄24 h 內死亡的雞胚，收集24 h～120 h 死亡的雞胚肝臟，加入1 mL 滅菌MEM 研磨，取200 μL 接種于25 cm2的C6/36 細胞培養(yǎng)瓶里，37 ℃培養(yǎng)6 d 后，取1 mL 培養(yǎng)液上清在BHK-21 上繼續(xù)盲傳3 代，當出現細胞病變（CPE）時，收獲細胞上清，超速離心后取沉淀，用PBS 溶解過夜后滴加于銅網上，使用磷鎢酸進行負染，在電鏡下觀察病毒粒子的形態(tài)，并參照文獻方法對分離到的病毒進行TCID50的測定[14]。

1.6 病毒的群特異性鑒定按照1.4 中的方法特異性擴增1.5 中BTV 分離株的Seg-7 序列，對BTV 的群特異性進行鑒定。

1.7 病毒的血清型鑒定VP2決定BTV的血清型，擴增1.5 中分離病毒的Seg-2 序列，50 ℃30 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃90 s，40 個循環(huán)，PCR產物經膠回收后，連接pMD18-T載體，并轉化于E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，重組菌株經PCR 鑒定后，由昆明碩擎生物科技有限公司測序，通過MEGA 6 軟件對分離病毒株的Seg-2 序列與GenBank 部分病毒株Seg-2 標準序列進行比對并構建進化樹。

1.8 微量中和試驗由于Seg-2 編碼的VP2 在同一血清型中仍存在較大差異[6]，因此根據血清型設計的引物往往無法對同一型的所有BTV 進行有效擴增，而BTV 血清型之間缺乏交叉保護，所以中和試驗一直作為經典的型鑒定方法在使用。為進一步明確分離病毒株的血清型，本研究分別進行了分離株與BTV 標準血清的微量中和試驗和分離株對應血清與BTV 標準病毒的微量中和試驗，通過血清學試驗進一步鑒定分離株的血清型。

2 結 果

2.1 哨兵動物血清BTV 抗體檢測通過C-ELISA方法檢測2017 年全年的監(jiān)控群血清，結果顯示6 月27 日師宗縣哨兵動物2 號牛BTV 抗體轉陽。

2.2 哨兵動物血液BTV 的檢測提取哨兵動物紅細胞RNA，經RT-PCR 檢測結果顯示，2 號牛轉陽當周及前后一周的核酸均為陽性，提示其中可能含有BTV，傳代后取上清，qRT-PCR 結果顯示轉陽前一周抗凝血的Ct 值最小，提示其中病毒含量最高，分離到BTV 的可能性最大（表1）。

表1 監(jiān)控動物BTV ELISA 及qRT-PCR 結果Table 1 BTV ELISA and quantitative real-time PCR results of the Monitoring animals

2.3 病毒分離與電鏡觀察核酸檢測為BTV 陽性的抗凝血樣品經靜脈接種雞胚后，雞胚出現死亡，剖解后發(fā)現雞胚全身出血，收集死亡雞胚肝臟，研磨后接種C6/36 細胞，培養(yǎng)6 d 后取上清1 mL 接種于BHK-21 細胞，盲傳到第3 代時，細胞出現明顯CPE，出現皺縮，崩解，脫落，qRT-PCR 檢測結果為BTV 陽性（Ct 值19.2）。表明分離到的病毒株為BTV，命名為YN/SZ/22457，在電鏡下觀察病毒呈球形無囊膜，直徑約為70 nm，病毒粒子表面分布有大量的纖維狀突起（圖1），參照文獻方法[14]，測定該病毒的效價為10-4.88TCID50/50 μL。

2.4 Seg-2 與Seg-7 基因擴增及序列分析分別擴增分離株YN/SZ/22457 的Seg-2 及Seg-7 序列，結果顯示，分別在2 237 bp和1 093 bp處有目的條帶（圖2），片段大小符合預期，進一步表明該分離株為BTV。分離株Seg-2 及Seg-7 序列測序后進行比對并構建進化樹，結果顯示分離株YN/SZ/22457 的Seg-2 序列和日本病毒株BTV-2（AB686224）以及臺灣病毒株BTV-2（AY493687）的Seg-2 序列相似度較高，且位于同一分支上（圖3），表明分離株為BTV-2 型；分離株YN/SZ/22457 的Seg-7 序列與與臺灣病毒株BTV-2（AY493692）以及日本病毒株BTV-21（AB473807）親緣關系最近，同為Eastern 2 型（圖4）。

2.5 微量中和試驗本研究在BHK 細胞進行YN/SZ/22457 對應血清與27 個型BTV 標準病毒的微量中和試驗，結果顯示經1:10 稀釋后，YN/SZ/22457 對應血清對BTV-2、BTV-22、BTV-23 的100 TCID50存在保護，進一步稀釋結果顯示，當1:40 稀釋時，YN/SZ/22457 對 應 血 清 對BTV-22、BTV-23 不 再 保護，而當1:160 稀釋時，仍對BTV-2 型標準毒有保護作用；同時，本研究用100 TCID50的YN/SZ/22457與BTV-2、BTV-22、BTV-23 標準血清進行微量中和試驗，結果顯示YN/SZ/22457 僅對BTV-2 型標準血清存在中和作用，中和效價為1:80，進一步從血清學上驗證了分離株YN/SZ/22457 為BTV-2 型。

圖1 BTV 分離株YN/SZ/22457 的電鏡觀察Fig.1 Electron microscopic observation of isolated BTV strain YN/SZ/22457

圖2 YN/SZ/22457 的RT-PCR 鑒定Fig.2 Identification of YN/SZ/22457 by RT-PCR

圖3 YN/SZ/22457 株Seg-2 基因序列系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on the Seg-2 sequences of the YN/SZ/22457 strain

圖4 YN/SZ/22457 株Seg-7 基因序列系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on the Seg-7 sequences of the YN/SZ/22457 strain

3 討 論

BTV 是一種蟲媒病毒，它的傳播需要病原、媒介以及宿主，由于BTV 初次分離株在細胞培養(yǎng)上不敏感，因此選擇雞胚靜脈接種的方式接種哨兵動物抗凝血，在前期研究發(fā)現BTV 在蚊子細胞（C6/36）中能快速增殖但不產生明顯病變，因此本研究采用“雞胚-C6/36 細胞-BHK-21 細胞”接種方式，以高效分離病毒，最終從2017 年師宗縣BTV 抗體陽性的?？鼓蟹蛛x到一株BTV-2，此外本實驗室通過建立監(jiān)控點，并對哨兵動物定期采血的方式在云南省多個地區(qū)成功分離到多株蟲媒病毒，該方法對其他病毒的分離具有指導意義。

自1979 年，張念祖等首次從云南省師宗縣分離到BTV，2012 年肖雷等又從師宗縣分離到67 株BTV[15-16]，表明師宗縣為BTV 高發(fā)地區(qū)，在該地設立監(jiān)控點能夠提高BT 的自然感染幾率；從分離到的病毒株來看，當地BTV-1 和BTV-16 為主流血清型，本研究于2017 年從師宗縣哨兵動物血液中分離到BTV-2，新血清型的出現提示了BT 的風險，這可能和當地媒介的變化和動物的流通有關；此前，BTV-2 曾在美國、澳大利亞及以色列分離到，2000年曾在北非流行，而我國甚少有BTV-2 型的報道。

BTV 基因組由Segment1～Segment10 這10 個節(jié)段組成[3]，本研究選擇Seg-2 編碼的VP2 以及Seg-7 編碼的VP7 進行測序分析。VP2 決定了BTV 的血清型，對不同地域分離的同一血清型BTV 株的Seg-2序列分析表明，Seg-2 序列的變異在一定程度上體現著病毒的地域特征，并可據此將同一血清型病毒株分為Eastern 型與Western 型[17]。通過對分離株YN/SZ/22457 的Seg-2 序列做系統(tǒng)發(fā)生分析，分離株的Seg-2 序列和日本以及臺灣BTV-2 株的Seg-2 序列相似度最高，親緣關系最近，表明分離株為BTV-2型，也意味著流行于中國、日本、臺灣的BTV-2 株有著相同的起源，同為Eastern 型，但新出現的血清型來源還有待進一步深入研究。研究對Seg-7 序列的進化分析顯示，分離株YN/SZ/22457 的Seg-7 序列與臺灣株BTV-2（AY493692）以及日本病毒株BTV-21（AB473807）親緣關系最近，同東方型中的Eastern2亞型。

云南省地處中國西南邊陲，與周邊多個國家接壤，跨境動物傳播疫病的風險大，同時覆蓋多種氣候環(huán)境，一些地區(qū)常年溫暖濕潤，給蟲媒病毒的媒介提供了滋養(yǎng)環(huán)境，所以云南省在蟲媒病毒防控及跨境動物疫病風險控制方面面臨巨大挑戰(zhàn)，本研究首次報道了云南地區(qū)BTV-2 的分離鑒定，并分析了分離株Seg-2 和Seg-7 的序列特征，研究結果將為進一步掌握云南省BTV 血清型的流行情況、致病性、遺傳特性奠定基礎，也將為全國范圍內蟲媒病毒的監(jiān)測與防控工作提供重要參考。