任 杰,武果桃,衛(wèi)順生,孟冬霞,閆益波,趙 娟

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,山西太原030032)

骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種帶負(fù)電荷的多功能非膠原性磷酸化糖蛋白,作為一種可溶性蛋白質(zhì)存在于大多數(shù)體液和組織中，其相對(duì)分子質(zhì)量約為44 kDa[1]。近年來關(guān)于OPN的已知功能研究結(jié)果如下：(1)通過精氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸組成的序列(RGD)結(jié)合于細(xì)胞表面,介導(dǎo)細(xì)胞、基質(zhì)之間的相互作用；(2)刺激β細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白[2]；(3)促進(jìn)免疫細(xì)胞、骨細(xì)胞和瘤細(xì)胞遷移[3-5]；(4)刺激骨的鈣化,改變細(xì)胞內(nèi)鈣水平[4]；(5)促進(jìn)骨組織內(nèi)磷酸鈣的吸收。其中OPN 在骨組織中主要是成骨細(xì)胞分泌, 在骨礦化中發(fā)揮重要作用,能增強(qiáng)細(xì)胞粘附的蛋白質(zhì)對(duì)羥基磷灰石結(jié)合能力。而尿結(jié)石的形成與骨礦化有許多相似之處，OPN含有與細(xì)胞外基質(zhì)的礦物質(zhì)表面相互作用的酸性結(jié)構(gòu)域，能抑制培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞的鈣化作用，在體外可抑制草酸鈣晶體的成核、生長和聚集[6-7], 但在體內(nèi)能促進(jìn)草酸鈣結(jié)石形成。而舍飼綿羊在育肥中后期大量高蛋白飼料的代謝產(chǎn)物極易蓄積。最終造成尿液離子過飽和與pH值升高，形成磷酸鹽結(jié)石[8]。本試驗(yàn)觀察骨橋蛋白在綿羊磷酸鹽尿結(jié)石發(fā)病情況下在泌尿系統(tǒng)表達(dá)量的變化，以及在腎臟和膀胱的定位。從蛋白水平驗(yàn)證骨橋蛋白與綿羊磷酸鹽尿結(jié)石發(fā)生的關(guān)系。

圖1 腎臟免疫組化(40×)
Fig.1 Immunohistochemistry of kidney(40×)
A:患病綿羊； B:健康綿羊 A: Sicken sheep; B: Healthy sheep

圖2 膀胱免疫組化(40×)
Fig.2 Immunohistochemistry of bladder(40×)
A:患病綿羊； B:健康綿羊 A: Sicken sheep; B:Healthy sheep

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蛋白提取試劑盒(C510003-0050)；蛋白濃度測定BCA試劑盒(SK3021)；β-acin抗體 (AB10001)； 兔抗OPN多克隆抗體(bs-0019R)；HRP conjugated Goat-anti-Rabbit IgG(AB10058)；發(fā)光試劑盒(SK6668)；免疫染色封閉液/一抗稀釋液(E674004-0100)；DAB免疫組織化學(xué)顯色試劑盒(E670033-1000)；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(E673001-0250)；免疫染色洗滌液(20×，E674003-0500)；蘇木素染色液(E607317-0100)；中性樹膠封片劑(E675007-0100)。以上試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 組織材料 山西晉中健源養(yǎng)殖場患病綿羊和健康綿羊各4只,取腎臟、膀胱組織快速置于液氮冷凍保存,用于總蛋白的提取,1塊置于Bouin′s固定液中固定,用于免疫組織化學(xué)分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白提取 按試劑盒說明書步驟提取蛋白。

1.3.2 蛋白濃度測定 按照每個(gè)樣本200 μL BCA工作液配制。標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度為：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 μg/μL和0.5 μg/μL。酶標(biāo)儀中震動(dòng)5 s。60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30 min。冷卻至室溫后，測定各孔A492值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本的蛋白濃度。

1.3.3 Western Blot 取液氮冷凍的腎臟和膀胱組織,用總蛋白提取試劑盒提取腎臟組織總蛋白。上樣量20 μg。電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉。加入兔抗OPN多克隆抗體(TBST 1∶500稀釋),37 ℃ 1 h,4 ℃過夜。次日洗膜加入HRP conjugated Goat-anti-Rabbit IgG，1∶8 000稀釋，37 ℃孵育1 h。ECL曝光。DAB室溫顯色2～3 min,待出現(xiàn)棕黃色條帶時(shí),終止顯色。

1.3.4 免疫組織化學(xué) Bouin′s固定液固定的腎、膀胱組織通過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片,做成5 μm厚的組織切片。將切片置于60 ℃恒溫箱中烘烤60 min，清洗，封閉液室溫封閉45 min。一抗(Anti-OPN antibody, Bioss, bs-0019R)4 ℃冰箱孵育過夜。次日室溫放置60 min，洗滌。滴加二抗(HRP conjugated Goat-anti-Rabbit IgG)，室溫孵育60 min，洗滌、顯色。洗滌加蓋玻片中性樹膠封片。顯微鏡拍片。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件對(duì)OPN蛋白在腎、膀胱組織中的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行光密度測定,每個(gè)組織取4張切片,每張切片取5個(gè)視野,得到陽性細(xì)胞的光密度值。所得數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 forwindows軟件,應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所測數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。不同樣本細(xì)胞中光密度(Optical density, OD)用單因子方差分析。應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件對(duì)綿羊OPN免疫印跡結(jié)果進(jìn)行分析,測定目的條帶面積和灰度值。分析結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 蛋白濃度測定 在綿羊腎臟蛋白濃度，患病綿羊?yàn)?11.82±0.44) μg/μL，健康綿羊?yàn)?8.68±0.56) μg/μL，差異極顯著(P<0.01)。膀胱蛋白濃度，患病綿羊?yàn)?14.32±0.82) μg/μL，健康綿羊?yàn)?12.43±0.75) μg/μL，差異顯著(P<0.05),見表1。

表1 不同部位蛋白濃度測定結(jié)果Table 1 Results of different parts protein concentration determination (μg/μL)

2.2 Western Blot結(jié)果 綿羊腎臟總蛋白中存在能與兔抗OPN多克隆抗體發(fā)生免疫陽性反應(yīng)的蛋白條帶。OPN蛋白在患病與健康綿羊腎臟組織中的平均蛋白濃度為(2.873 2±0.035 6) μg/μL和(2.358 9±0.047 1) μg/μL，差異極顯著(P<0.01)。綿羊膀胱總蛋白中同樣存在能與兔抗OPN多克隆抗體發(fā)生免疫陽性反應(yīng)的蛋白條帶。OPN蛋白在患病與健康綿羊膀胱組織中的平均蛋白濃度為(3.493 2±0.053 7) μg/μL和(3.055 9±0.067 4) μg/μL，差異顯著(P<0.05)。

2.3 免疫組化 腎臟OPN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示, 光鏡下可見腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)OPN，主要定位于胞質(zhì)，呈棕褐色?；疾【d羊表達(dá)明顯增多，色較深，平均吸光度為0.028 51±0.008 0；健康綿羊腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)較少，色較淺，平均吸光度為0.013 89±0.004 5?；疾【d羊與健康綿羊差異極顯著(P<0.01)。見中插彩版圖1。膀胱OPN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示, 光鏡下可見膀胱移行上皮細(xì)胞表達(dá)OPN，以及平滑肌少量表達(dá)，主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕褐色?；疾【d羊表達(dá)明顯增多，色較深，平均吸光度為0.038 4±0.023 0；健康綿羊表達(dá)較少，色較淺，平均吸光度為0.029 76±0.012 9?；疾【d羊與健康綿羊差異顯著(P<0.05)。見中插彩版圖2。

3 討論

作為一種多功能蛋白，OPN在許多系統(tǒng)功能中發(fā)揮作用[9]，其中在骨形成的研究較多，在骨基質(zhì)的礦化和吸收過程中對(duì)鈣介導(dǎo)和鈣依賴的某些過程有參與細(xì)胞遷移，是一個(gè)主動(dòng)的調(diào)控過程[10]。而尿結(jié)石的形成也存在類似鈣化的過程，許多研究表明，骨橋蛋白在草酸鈣晶體的形成過程中存在相關(guān)性。Wesson等[11]用乙二醇分別誘導(dǎo)OPN基因敲除的成年小鼠和正常小鼠，形成高草酸尿模型，到第4周后，OPN基因敲除小鼠的腎小管內(nèi)形成大量草酸鈣晶體，而正常小鼠則無晶體形成。吳敬彰等[12]研究OPN在結(jié)石患者腎組織中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，結(jié)石組患者腎組織中的OPN表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。趙明等[13]在研究骨橋蛋白對(duì)大鼠發(fā)生草酸鈣腎臟結(jié)石的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)， OPN siRNA組OPN蛋白表達(dá)水平和草酸鈣結(jié)石顯著低于空載組，顯著高于對(duì)照組。鄧茂放等[14]在研究烏梅提取物對(duì)腎結(jié)石模型大鼠腎功能的保護(hù)作用及機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組和試驗(yàn)組腎組織中OPN蛋白免疫組化評(píng)分和OPN蛋白表達(dá)量明顯高于正常組。以上研究都表明，OPN在草酸鈣晶體轉(zhuǎn)化為腎結(jié)石過程中起關(guān)鍵作用。另外，膀胱和尿液中OPN通過影響晶體結(jié)晶而影響草酸鈣結(jié)石形成。Thurgood等[15]研究表明，OPN抑制草酸鈣晶體生長，并且抑制作用呈劑量依賴性。王炎等[16]在研究加味健脾益腎方對(duì)腎結(jié)石術(shù)后尿骨橋蛋白的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，治療組尿OPN含量比治療前明顯升高。而Konya等[17]研究草酸鈣晶體聚集和生長的抑制活性過程中發(fā)現(xiàn)，尿液中OPN能增加草酸鈣晶體的粘附和聚集，并且可以増加新形成的晶體的粘附力，OPN被草酸鈣包裹成為結(jié)晶形成的始發(fā)部位，從而促進(jìn)草酸鈣結(jié)石的形成。

本試驗(yàn)對(duì)4只發(fā)生尿結(jié)石綿羊剖檢確定都為磷酸鹽結(jié)石，并隨機(jī)抽取4只健康綿羊進(jìn)行取樣。在腎臟OPN蛋白表達(dá)，發(fā)病組極顯著高于健康組，而膀胱上OPN的表達(dá)，發(fā)病組顯著高于健康組，與吳敬彰等[12]的研究結(jié)果相同。但膀胱上OPN的表達(dá)量均高于腎臟，說明OPN在膀胱上表達(dá)高于腎臟。另外，免疫組化試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

4 小結(jié)

尿結(jié)石是一種由多因素影響、形成過程非常復(fù)雜的疾病，目前其發(fā)病機(jī)制還有待研究。OPN在尿結(jié)石結(jié)晶形成中扮演著重要的角色。雖然已經(jīng)對(duì)OPN與尿結(jié)石的關(guān)系做了許多研究，但目前仍不能明確其在尿結(jié)石形成過程中的具體作用。本試驗(yàn)在確定綿羊磷酸鹽結(jié)石情況下，對(duì)患有尿結(jié)石綿羊和健康綿羊進(jìn)行腎臟與膀胱OPN蛋白的表達(dá)和定位，結(jié)果顯示，骨橋蛋白在尿結(jié)石綿羊和健康綿羊腎、膀胱組織中定位以及表達(dá)存在一定差異，表明骨橋蛋白與綿羊磷酸鹽尿結(jié)石形成有關(guān)。