黃亞光，歐炳金，馮家騰，楊 彤，馮知濤，梅志剛

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443002）

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康的神經(jīng)性疾病，最新的研究顯示，全球25 歲以上人群的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為25%，而在我國(guó)最高，達(dá)39%［1］。缺血性腦卒中作為腦卒中最主要的類型，占60%～80%［2］，并且其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)約是出血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的2 倍［1］。目前，其有效的治療手段是溶栓，但血液再次灌注很可能給受損組織帶來(lái)更嚴(yán)重的損傷，即腦缺血再灌注（cerebral ischemia-reperfusion，CIR） 損傷。研究證實(shí)，CIR 損傷與炎癥、氧化應(yīng)激、自噬、凋亡、鈣超載等有關(guān)［3-5］，其中自噬的作用日益成為研究熱點(diǎn)［6-7］，有望成為缺血性腦卒中治療的新策略。竹節(jié)參是五加科人參屬植物竹節(jié)參的干燥根莖，具有抗炎、改善學(xué)習(xí)記憶、抗腫瘤等功效［8-9］，總皂苷（tRPJSs） 是其有效活性成分，主要包括竹節(jié)人參皂苷Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，人參皂苷Re、Rgl、Rg2，三七皂苷R1、R2［9］，可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡［10］、降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性［11］、抗氧化［12］、抑制興奮性氨基酸［13］等作用來(lái)減輕CIR 損傷，然而它是否能調(diào)控自噬尚不清楚。因此，本研究建立大鼠局灶性CIR 損傷模型，探討竹節(jié)參總皂苷對(duì)自噬的調(diào)節(jié)，從而揭示該成分防治缺血性腦卒中的潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性成年SD 大鼠40 只，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （鄂） 2011-0012。

1.2 藥物 竹節(jié)參購(gòu)自湖北恩施椿木營(yíng)竹節(jié)參種植基地，經(jīng)三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院何毓敏博士鑒定為五加科植物竹節(jié)參Panax japonicusC.A.Mey 的干燥根莖。取藥材粗粉，加入60%乙醇回流提取3 次，合并濾液后濃縮干燥，得到總提物粉末。使用前，用生理鹽水將其稀釋至所需濃度。

1.3 試劑 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）試劑 （批號(hào)T8877-5G） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔、β-actin 抗體購(gòu)自武漢塞維爾生物有限公司；微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B（LC3B） 兔多抗（批號(hào)18725-1-AP）、p62 兔多抗（批號(hào)18420-1-AP） 購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；水合氯醛（批號(hào)20150629） 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器 TS-1 水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；LD25-2 型低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；H-7500 透射電子顯微鏡（日本日立公司）；DYY-7C 電泳儀及DYCZ-40 電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 分組及給藥 40 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、竹節(jié)參總皂苷低劑量組（50 mg／kg）、竹節(jié)參總皂苷高劑量組（100 mg／kg），每組各10 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，竹節(jié)參總皂苷組大鼠按50、100 mg／kg 的劑量灌胃給藥，每天1 次，共7 d，末次給藥為術(shù)前30 min；假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃給予生理鹽水（5 mL／kg），灌胃時(shí)間與竹節(jié)參總皂苷組相同。

2.2 局灶性CIR 損傷模型的建立 參照Longa等［14］的方法構(gòu)建大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷缺血（MCAO） 模型。大鼠末次給藥30 min 后，10%水合氯醛（3.5 mL／kg） 腹腔注射麻醉，仰臥固定，剃去頸部毛發(fā)，酒精消毒，沿頸正中線切口，依次暴露右側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉下方約5 mm處剪一 “V”型切口，將線栓 （長(zhǎng)4 cm，直徑0.25 mm） 從開(kāi)口處插入，置于頸內(nèi)動(dòng)脈17～18 mm，到有輕微阻力感為止，結(jié)扎頸內(nèi)和頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端以固定線栓，逐層縫合皮膚。大鼠缺血1.5 h 后，撥出線栓再灌注24 h。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分支，不閉塞大腦中動(dòng)脈，其他操作相同。術(shù)中、術(shù)后室溫嚴(yán)格控制在24～25 ℃，大鼠體溫維持在36.5～37.5 ℃。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 再灌注24 h 后，評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能損傷，參照Longa 等［14］報(bào)道的方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0 分，神經(jīng)功能無(wú)障礙；1 分，提尾時(shí)向?qū)?cè)前肢屈曲；2 分，不能直行，大鼠向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3 分，行走困難，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4 分，嚴(yán)重意識(shí)障礙，無(wú)自發(fā)活動(dòng)或意識(shí)不清。神經(jīng)功能評(píng)分在0～3 分的大鼠表明造模成功，納入實(shí)驗(yàn)，評(píng)分為4 分的剔除。

2.4 TTC 染色計(jì)算腦梗死體積 神經(jīng)功能評(píng)分后，每組隨機(jī)選取3 只大鼠，麻醉后斷頭取腦，去嗅球、小腦和低位腦干，-20 ℃冷凍20 min 后沿冠狀面切成厚度基本相同的5 片，置于2% TTC 染色液中，37 ℃避光孵育30 min，置于4%多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜，取出切片拍照。采用Image J 圖像分析軟件測(cè)量大鼠腦梗死體積。腦梗死范圍百分比＝ ［5 片大腦總梗死區(qū)體積（白色區(qū)域） ／5 片大腦總體積（整個(gè)大腦體積）］×100%。

2.5 透射電鏡檢測(cè)自噬小體 再灌注24 h 后，每組隨機(jī)選取3 只大鼠，麻醉后生理鹽水灌注至肝臟及四肢發(fā)白，后繼續(xù)灌注4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定至肝臟及四肢變硬，冰上斷頭取腦，分離腦組織，于缺血側(cè)海馬靠近CA1 區(qū)取一體積約1 mm3的腦組織塊，置于2.5% 戊二醛溶液固定24 h。PBS 漂洗3 次，1%鋨酸溶液4 ℃固定1 h，然后梯度乙醇溶液脫水，丙酮置換、浸透，環(huán)氧樹(shù)脂包埋。-80 ℃下聚合24 h 后，將組織塊制成60～70 nm厚的超薄切片，3%檸檬酸鉛-醋酸雙氧鈾雙染色，透射電子顯微鏡觀察海馬組織細(xì)胞中自噬小體的形成情況。

2.6 Western blot 檢測(cè)LC3、p62 蛋白表達(dá) 再灌注24 h 后，各組隨機(jī)選取3 只大鼠，麻醉后迅速斷頭取腦，稱取約0.3 g 海馬組織制備蛋白樣本，BCA 法檢測(cè)各樣本蛋白濃度。取30 μg 樣本上樣，以12%分離膠電泳分離，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗LC3 B （1∶1 000）、p62 （1∶2 000） 后4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST 洗膜3 次 （10 min／次），將PVDF 膜封入HRP 標(biāo)記的二抗（山羊抗兔） 稀釋液（1∶2 000）中，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST 洗膜3 次 （每次10 min）。按照A 液、B 液1∶1 的比例配置ECL顯影液，將PVDF 膜充分浸入顯影液后放入凝膠成像儀器內(nèi)顯影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以β-actin 作為內(nèi)參，Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件處理，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVE），兩兩比較采用LSD 法（方差齊性時(shí)） 或Dunnett’s T3 法（方差不齊時(shí)）。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)神經(jīng)功能損傷的影響 模型組大鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷情況，與假手術(shù)組大鼠相比其神經(jīng)功能評(píng)分升高（P＜0.01）；與模型組相比，竹節(jié)參總皂苷組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷的影響（，n＝10）Tab.1 Effects of tRPJSs on neurological deficit of rats（，n＝10）

表1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷的影響（，n＝10）Tab.1 Effects of tRPJSs on neurological deficit of rats（，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)腦梗死的影響 白色部分表示腦梗死區(qū)域，紅色部分表示非梗死區(qū)域。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死增加（P＜0.01）；與模型組相比，竹節(jié)參總皂苷組大鼠腦梗死均減小（P＜0.01），高劑量組更明顯。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠腦梗死的影響Fig.1 Effects of tRPJSs on cerebral infarct of rats

表2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠腦梗死的影響（， n＝3）Tab.2 Effects of tRPJSs on cerebral infarct of rats （，n＝3）

表2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠腦梗死的影響（， n＝3）Tab.2 Effects of tRPJSs on cerebral infarct of rats （，n＝3）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)缺血側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及自噬小體形成的影響 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元可見(jiàn)結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而模型組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞器損傷，線粒體腫脹變形，部分線粒體內(nèi)峭溶解消失，透明成空泡，可見(jiàn)包含內(nèi)融物的自噬體及自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。竹節(jié)參總皂苷組與模型組相比，可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞核膜超微結(jié)構(gòu)較完整、清晰，周圍可見(jiàn)內(nèi)含胞漿成分的自噬體，也可見(jiàn)到少量單層膜，胞漿成分已降解的自噬溶酶體，且竹節(jié)參總皂苷高劑量組細(xì)胞損傷程度低于低劑量組。見(jiàn)圖2。

圖2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬CA1 區(qū)自噬小體形成的影響（×5 000）Fig.2 Effects of tRPJSs on neuronal cell morphology and the formation of autophagosomes in CA1 area of ischemic hippocampus of rats （×5 000）

3.4 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬中LC3、p62蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組LC3-Ⅱ表達(dá)升高，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值增加，p62 表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組相比，竹節(jié)參總皂苷組LC3-Ⅱ表達(dá)均下調(diào)，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值降低，p62表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬中LC3 和p62 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of tRPJSs on the protein expressions of LC3 and p62 in ischemic hippocampus of rats

表3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬中LC3 和p62 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of tRPJSs on the protein expressions of LC3 and p62 in ischemic hippocampus of rats （， n＝3）

表3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬中LC3 和p62 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of tRPJSs on the protein expressions of LC3 and p62 in ischemic hippocampus of rats （， n＝3）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

4 討論

缺血性腦卒中是由于腦缺血或血管堵塞造成大腦血流供應(yīng)不足，引起腦組織損傷的一種疾病。目前，r-tPA 溶栓治療是美國(guó)FDA 唯一批準(zhǔn)的療法，然而溶栓再灌注可能會(huì)進(jìn)一步引起或加重一系列病理改變［15-16］，誘發(fā)CIR 損傷的發(fā)生，繼而導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)損傷。因此，如何有效的防治再灌注損傷的發(fā)生至關(guān)重要。

竹節(jié)參是湖北省特色藥用植物，其主要活性成分是竹節(jié)參總皂苷。研究顯示，竹節(jié)參總皂苷能通過(guò)抑制一氧化氮合酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的過(guò)度表達(dá)改善局灶性CIR 大鼠的腦損傷［11］。另有研究也發(fā)現(xiàn)，50、100 mg／kg 竹節(jié)參總皂苷能顯著提高CIR 大鼠腦組織的超氧化物歧化酶活力，降低乳酸脫氫酶活性和丙二醛含有量，抑制腦組織水腫［12］，提示竹節(jié)參總皂苷可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激和改善毛細(xì)血管通透性減輕CIR 損傷。新近的研究發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參的藥理作用可能與其對(duì)自噬的調(diào)控有關(guān)，鄧麗麗等［17］通過(guò)在SH-SY5Y 細(xì)胞中預(yù)孵育竹節(jié)參總皂苷發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參總皂苷能顯著逆轉(zhuǎn)H2O2處理導(dǎo)致的LC3-Ⅱ和Beclin1 蛋白的下調(diào)，推測(cè)竹節(jié)參總皂苷可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬，減輕細(xì)胞氧化損傷，從而提高細(xì)胞的抗氧化能力。Wang 等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參總皂苷能通過(guò)AMPK／mTOR／Ulk1 通路激活自噬，從而減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化。然而，竹節(jié)參總皂苷對(duì)CIR 損傷的保護(hù)作用是否通過(guò)調(diào)控自噬尚未有報(bào)道。

基于上述理論，本研究試圖探討竹節(jié)參總皂苷預(yù)處理對(duì)CIR 損傷的保護(hù)作用，并驗(yàn)證竹節(jié)參總皂苷通過(guò)調(diào)控自噬發(fā)揮作用。通過(guò)提前7 d 預(yù)給藥處理，MCAO 模型缺血1.5 h 再灌注24 h 后檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)。結(jié)果顯示，與模型組相比，竹節(jié)參總皂苷預(yù)處理能夠顯著改善CIR 24 h 后大鼠的神經(jīng)功能缺損，減輕腦梗死，改善神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提示竹節(jié)參總皂苷預(yù)處理能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

自噬體被認(rèn)為是目前檢測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠直觀的顯示組織細(xì)胞內(nèi)自噬的情況。自噬體是自噬過(guò)程中形成的一種包裹有受損細(xì)胞器或蛋白質(zhì)的囊泡，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，與溶酶體融合后變成單層膜結(jié)構(gòu)［19］。LC3 是自噬過(guò)程中最重要的分子，以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式存在，主要參與自噬體的形成［20］。自噬底物蛋白p62 通過(guò)在C 端與泛素化蛋白結(jié)合以及N 端與LC3-Ⅱ結(jié)合參與自噬的降解［21］，同時(shí)檢測(cè)LC3 和p62 可以反應(yīng)自噬的完整性。本研究中透射電鏡結(jié)果顯示，竹節(jié)參總皂苷預(yù)處理可以顯著改善大鼠缺血側(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，減少自噬體的形成；Western blot 結(jié)果顯示，竹節(jié)參總皂苷預(yù)處理能顯著降低LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值，上調(diào)p62 蛋白表達(dá)，推測(cè)竹節(jié)參總皂苷預(yù)處理發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制大鼠CIR 24 h 后自噬的過(guò)度產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，竹節(jié)參總皂苷預(yù)處理可能通過(guò)抑制大鼠CIR 24 h 后海馬區(qū)的過(guò)度自噬，而發(fā)揮對(duì)CIR損傷的保護(hù)作用。然而竹節(jié)參總皂苷調(diào)控自噬的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探索，明確其在CIR 損傷中的具體作用機(jī)制。