代亞坤 王小星 袁琳 高炳淼

摘要?[目的]了解不同姜科植物蛋白水平遺傳多樣性。[方法]分別采用TCA/丙酮法、Tris-HCl法和試劑盒法提取益智葉片蛋白并進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）分析，獲得最佳蛋白提取方法。采用最佳蛋白提取方法提取7種姜科植物的蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE分析和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用軟件NTSYS對(duì)姜科植物進(jìn)行聚類分析。[結(jié)果]試劑盒法為最佳蛋白提取方法，SDS-PAGE結(jié)果表明，7種姜科植物中共檢出蛋白條帶52個(gè)，其中共有條帶14個(gè)和多態(tài)性條帶38個(gè)，平均多態(tài)性比率為73.1%。聚類分析結(jié)果表明，7種姜科植物可分為4類，聚類結(jié)果與姜科植物的種屬相關(guān)但并非嚴(yán)格一致。[結(jié)論]該研究建立了姜科植物的蛋白遺傳多樣性研究方法，表明姜科植物具有豐富的蛋白遺傳多樣性，為今后姜科植物的遺傳多樣性研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞?姜科植物;蛋白;聚丙烯酰胺電泳;聚類分析

中圖分類號(hào)?Q943?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）14-0195-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.055

Abstract?[Objective]To understand the protein diversity of different Zingiberaceae plants.[Method]The protein of?Alpinia oxyphylla?Miq.was extracted by TCA/acetone method，Tris-HCl method and kit method and analyzed by polyacrylamide electrophoresis （SDS-PAGE） to obtain the best protein extraction method.The proteins of seven species of Zingiberaceae plants were extracted by the best protein extraction method and analyzed by SDS-PAGE and statistical data.The clusters of Zingiberaceae plants were analyzed by software NTSYS.[Result]The kit method was the best protein extraction method.The results of SDS-PAGE showed that 52 protein bands were detected in seven species of Zingiberaceae plants，including 14 bands and 38 polymorphic bands.The average polymorphism ratio was 73.1%.The results of cluster analysis indicated that the seven species of Zingiberaceae plants could be divided into four categories，and the clustering results were related to the species of Zingiberaceae but were not strictly consistent.[Conclusion]This study established a method for studying the genetic diversity of Zingiberaceae plants，indicating that the Zingiberaceae plants have rich genetic diversity，which provides a theoretical basis for the future study of the genetic diversity of Zingiberaceae plants.

Key words?Zingiberaceae;Protein;SDS-PAGE;Cluster analysis

姜科（Zingiberaceae）是單子葉植物中的一個(gè)大科，分為2個(gè)亞科4族52 屬，約1 500種，主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]。在我國(guó)，姜科植物主要分布在西南部和東南部的一些省份，有20屬、216種[2-3]。姜科植物擁有較長(zhǎng)的藥用歷史，它的藥效通常是解表散寒、理氣健胃[4]。其中，包含很多常用藥材如益智和砂仁，并以“四大南藥”而著稱[5]。姜科植物的化學(xué)成分中均含有揮發(fā)油成分，因此有比較芳香的氣味，除此之外還含有黃酮類、甾體皂苷類和雙苯庚烷類等[6-8]。

姜科植物資源豐富，已有基于PCR擴(kuò)增技術(shù)的分子標(biāo)記如AFLP、ISSR、SRAP、ITS等研究姜科植物資源的遺傳多樣性[9-12]。目前關(guān)于姜科植物蛋白的遺傳多樣性研究尚未見(jiàn)報(bào)道，蛋白作為基因表達(dá)的直接穩(wěn)定產(chǎn)物且受相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控，同樣能在生化水平上反映遺傳物質(zhì)組成上的差異[13]。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）具有變性蛋白質(zhì)可溶解、泳動(dòng)速度只與分子量大小相關(guān)、與蛋白所帶電荷和形態(tài)無(wú)關(guān)等特點(diǎn)[14]，成為一種有效工具已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于解決植物分類、進(jìn)化問(wèn)題及品種和變種的鑒定等方面[15-16]。

筆者通過(guò)優(yōu)化蛋白提取方法，利用SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)7種姜科植物的蛋白進(jìn)行研究分析，獲得蛋白的電泳指紋圖譜，擬從蛋白水平探討姜科植物的遺傳多樣性，旨在為姜科植物資源的分類、進(jìn)化問(wèn)題研究及品種鑒定等提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試樣品。姜科植物樣品均采集于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所（海南分所），由鄭希龍副研究員負(fù)責(zé)鑒定（表1）。采集后的葉片加液氮研磨，置于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2?試驗(yàn)試劑。

植物蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3?試驗(yàn)儀器。PL602-S電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;WD-9405B水平搖床（沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司）;Tanon-4100全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）;DYY-12型電泳儀（北京市六一儀器廠）;HHCP-01型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）。

1.2?方法

1.2.1?三氯乙酸（TCA）/丙酮法。TCA/丙酮法提取蛋白參照文獻(xiàn)[17]。稱取0.5 g姜科植物葉片放入研缽中，迅速加液氮研磨成粉末狀，將粉末轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，加入6 mL預(yù)冷的10% TCA/丙酮溶液，渦旋混勻，-20 ℃沉淀若干小時(shí)。4 ℃ 15 000 r/min離心20 min，取上清液2 mL轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，加入3倍體積的預(yù)冷丙酮，充分混勻。4 ℃ 12 000 r/min 離心25 min，棄掉上清液后，抽真空揮發(fā)丙酮濃縮成干粉，加入100 μL的蛋白裂解液，使用超聲波儀器使其溶解，得到蛋白液。

1.2.2?Tris-HCl法。Tris-HCl法提取蛋白參照文獻(xiàn)[17]。稱取0.5 g姜科植物葉片放入研缽中，加入其鮮重10%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末，加入液氮充分研磨成粉末。將粉末轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入其3倍蛋白提取緩沖液（68 mmol/L Tris-HCl pH 6.7，0.6 % SDS，10%甘油和3% β-巰基乙醇），振蕩器振蕩15 min后4 ℃放置1 h，充分溶解蛋白。4 ℃ 12 000 r/min離心25 min，取上清液2.0 mL轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入6 mL預(yù)冷的丙酮，充分混勻，放入-20 ℃冰箱，沉降蛋白2 h，12 000 r/min離心15 min。取沉淀蛋白，抽真空揮發(fā)丙酮濃縮成干粉，加入300 μL電泳上樣提取緩沖液（12.5% 0.5 mol/L Tris-HCl pH 6.8，10%甘油，5% β-巰基乙醇和72.5% 的蒸餾水），使用超聲波儀器溶解沉淀后，4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。

1.2.3?試劑盒法。

稱取0.5 g的姜科植物葉片，加入其鮮重10%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末，用其3倍蛋白提取緩沖液（45.5 μL 1 mol/L Tris-HCl pH 6.8，5 mL 10% SDS，10 mL甘油，5 mL β-巰基乙醇，84.45 mL 蒸餾水）研磨粉碎后轉(zhuǎn)移到2.5 mL離心管中，加入1 mL的蛋白裂解液后振蕩混勻放置30 min（4 ℃），且每隔5 min左右就振蕩一下，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min，取上清液備用。

1.2.4?聚丙烯酰胺電泳分析方法。

SDS-PAGE采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，點(diǎn)樣量為10 μL。在80 V恒壓下電泳1 h后，調(diào)整電壓120 V，繼續(xù)電泳3～4 h。當(dāng)指示劑到凝膠底部1.5 cm左右停止電泳。電泳結(jié)束后，將膠從玻璃板上剝離下來(lái)加入考馬斯亮藍(lán)染色液染色，再脫色，使膠的藍(lán)色褪去并且有清晰可見(jiàn)的蛋白條帶，用自動(dòng)數(shù)碼凝膠顯像系統(tǒng)將脫色好的膠拍照保存并分析。

1.3?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)電泳譜帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，有帶記為1，無(wú)帶記為0，形成原始數(shù)據(jù)矩陣。計(jì)數(shù)多態(tài)性帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)性帶數(shù)百分率，并使用軟件NTSYS基于遺傳相似系數(shù)對(duì)各種姜科植物進(jìn)行聚類分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?蛋白提取方法分析?分別采用TCA/丙酮法、Tris-HCl法和試劑盒法對(duì)益智的總蛋白進(jìn)行提取，并進(jìn)行電泳以比較這3種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，試劑盒法提取蛋白條帶和蛋白濃度的效果均優(yōu)于TCA/丙酮法和Tris-HCl法;TCA/丙酮法和Tris-HCl法相對(duì)于試劑盒法具有耗時(shí)久、操作麻煩等缺點(diǎn);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定的蛋白濃度依次為：TCA/丙酮法2.7 g/L，Tris-HCl法4.6 g/L，試劑盒法8.2 g/L。綜上所述，選用試劑盒法對(duì)所有姜科植物的蛋白進(jìn)行提取。

2.2?姜科植物的蛋白電泳分析

7種姜科植物的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，其分子量均分布在66.2～14.4 kDa。7種姜科植物中共檢測(cè)出52個(gè)遷移率不同的蛋白條帶，其中共有條帶為14個(gè)，多態(tài)性條帶38個(gè)，平均多態(tài)性比率為73.1%（表2）。7種姜科植物的蛋白譜帶數(shù)因材料而異。其中，爪哇白豆蔻分離出的蛋白譜帶數(shù)最多，共有11條蛋白條帶，分別為6條明帶和5條暗帶;光葉山姜材料分離出的蛋白譜帶數(shù)最少，只有5條蛋白譜帶且均是暗帶;草豆蔻和高良姜的蛋白譜帶分布非常相似，主要蛋白譜帶均有7條，分別為2條明帶和5條暗帶;益智和砂仁的蛋白譜帶均有8條，其差異是益智在97.4 kDa的附近有1條蛋白暗帶，砂仁在22.0 kDa附近處有1條蛋白暗帶。

2.3?聚類分析

利用軟件NTSYS對(duì)7種姜科植物進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，其遺傳相似系數(shù)變異范圍在0.50～1.00，以遺傳相似系數(shù)0.87時(shí)，可以分為4類：光葉山姜、陽(yáng)荷和爪哇白豆蔻各自為一支，草豆蔻、益智、高良姜和海南砂仁則聚為一支。光葉山姜和其他6種姜科植物的遺傳相似系數(shù)較小，表明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。益智和砂仁聚在一組，遺傳相似系數(shù)較大，約為0.90，表明親緣關(guān)系較近。草豆蔻和高良姜聚為一類，遺傳相似系數(shù)為1.00，表明草豆蔻和高良姜無(wú)法區(qū)分，其兩者蛋白之間差異最小。

3?結(jié)論與討論

海南島姜科資源豐富，探究姜科植物資源的蛋白遺傳多樣性，闡明不同姜科植物種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，可為姜科植物品種鑒定和保護(hù)提供理論依據(jù)，進(jìn)而推動(dòng)姜科資源更深層的開(kāi)發(fā)利用[18]。該研究通過(guò)優(yōu)化蛋白提取方法，采用SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)7種不同的姜科植物蛋白遺傳多樣性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，試劑盒法提取的蛋白效果最佳，姜科植物在蛋白水平上具有豐富的遺傳多樣性，可作為評(píng)價(jià)姜科植物遺傳多樣性的生化標(biāo)記。

蛋白遺傳多樣性研究是以SDS-PAGE電泳的蛋白條帶數(shù)、遷移位置、條帶顏色深淺作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，受到蛋白提取方法的影響比較大[19]。為避免這種誤差的影響，該研究以益智為材料進(jìn)行蛋白提取方法的優(yōu)化。結(jié)果表明，試劑盒法提取的蛋白電泳條帶更多且清晰，而TCA/丙酮法和Tris-HCl法提取的蛋白電泳條帶少且不清晰。BCA蛋白濃度測(cè)定結(jié)果表明，蛋白濃度依次從大到小為試劑盒法>Tris-HCl法>TCA/丙酮法。因此，選用試劑盒法提取姜科植物蛋白是比較切實(shí)可行的方法。

SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，7種姜科植物的蛋白分子量均分布在66.2～14.4 kDa，共檢測(cè)出52個(gè)遷移率不同的蛋白譜帶，其中共有條帶為14個(gè)，多態(tài)性條帶38個(gè)，平均多態(tài)性比率為73.1%。從聚類分析結(jié)果來(lái)看，以遺傳相似系數(shù)0.87時(shí)可將7種姜科植物分為4類：光葉山姜、陽(yáng)荷和爪哇白豆蔻各自為一支，草豆蔻、益智、高良姜和海南砂仁則聚為一支。光葉山姜和其他6種姜科植物的關(guān)系最遠(yuǎn)，益智和砂仁的關(guān)系最相近，而草豆蔻和高良姜?jiǎng)t無(wú)法區(qū)分。草豆蔻、高良姜和益智均屬于山姜屬植物，親緣關(guān)系較近，雖然光葉山姜也同屬山姜屬，但其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與Kress等[20]對(duì)姜科植物的聚類分析結(jié)果一致。白豆蔻和砂仁同屬豆蔻屬，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而海南砂仁與山姜屬益智親緣關(guān)系較近，與目前臨床上常出現(xiàn)砂仁和益智仁混偽品的現(xiàn)象相符合[21]。因此，筆者通過(guò)SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)7種姜科植物的多樣性進(jìn)行研究，建立了姜科植物蛋白遺傳多樣性的研究方法，為其他姜科植物的蛋白遺傳多樣性研究、圖譜鑒定、聚類分析等奠定了基礎(chǔ)。

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