阿孜古麗·阿力木江 買買提·依斯熱依力 王婧 艾克拜爾·艾力 陸萍克力木·阿不都熱依木

前 言

胃食管反流病（gastroesophageal reflux diseases，GERD）是一種臨床實(shí)踐中常見的慢性上消化道疾病，其發(fā)病率逐年增高［1］。導(dǎo)致GERD的因素較多，如老齡化、自身免疫、焦慮、抑郁及生活方式等均可引起該疾病，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。據(jù)報(bào)道，焦慮抑郁狀態(tài)及各種心理應(yīng)激均與GERD的發(fā)生密切相關(guān)［2］。研究結(jié)果表明，女性GERD患者異常的酸反流和食管運(yùn)動(dòng)功能障礙均與胃泌素和雌激素水平變化有關(guān)［3］。此外，氧化應(yīng)激和炎癥因子在GERD發(fā)生與發(fā)中的作用逐漸受到重視［4］。本研究通過(guò)建立心理應(yīng)激雌性小鼠模型，分析心理應(yīng)激對(duì)雌性小鼠胃泌素及雌激素水平的影響，探討其對(duì)氧化應(yīng)激和食管炎癥發(fā)生中的作用。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20只8周齡，SPF級(jí)雌性昆明小鼠，購(gòu)于新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心［SCXK（新）2011‐0001］，飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所IVC系統(tǒng)動(dòng)物中心。采用Microsoft office excel軟件隨機(jī)分心理應(yīng)激組和正常對(duì)照組，每組各10只。兩組小鼠單只飼養(yǎng)在自由進(jìn)食水的鼠籠內(nèi)，每日給予12h/12h晝夜循環(huán)，光照均始于8∶30，止于20∶30。

2.主要試劑與儀器：自制式束縛器和1‐14K型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)）；Eclipse E200型光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司生產(chǎn)）；C1000型梯度PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio‐Rad公司生產(chǎn)）；PBS緩沖液粉末、檸檬酸及H&E染色相關(guān)試劑均購(gòu)于北京中杉金橋公司；TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)）；cDNA合成試劑盒（北京天根有限公司生產(chǎn)）；實(shí)時(shí)定量RT‐PCR試劑盒（日本TaKaRa公司生產(chǎn)）。

二、慢性束縛應(yīng)激動(dòng)物模型的建立

束縛應(yīng)激施行時(shí)間均在每日上午10∶30～12∶30進(jìn)行，每日限制活動(dòng)2 h，期間禁食禁水，后放回鼠籠內(nèi)自由活動(dòng)，連續(xù)束縛應(yīng)激14 d［5］。10只心理應(yīng)激組小鼠置于用50 ml離心管所制的自制式束縛器中（離心管提前燙制出直徑約5 mm的通氣孔若干，分布于左右及上側(cè)管壁）。正常對(duì)照組小鼠自由飲水?dāng)z食，其余時(shí)間兩組小鼠處理相同。

三、取材與標(biāo)本處理

心理應(yīng)激第14天17∶00開始對(duì)各組小鼠禁食，于次日11∶00腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉，150毫克/千克進(jìn)行麻醉并取材。麻醉的小鼠以平臥位固定，從腹部正中至劍突取切口3 cm切口，下腔靜脈取血注入于1.5 ml EP管中，全段食管組織剪斷取材。

四、組織病理學(xué)處理及炎癥評(píng)價(jià)

兩組小鼠食管組織置于4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片行H&E染色，并觀察分析兩組食管組織形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行炎癥評(píng)價(jià)［6］。

五、酶聯(lián)免疫吸附法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天取每組小鼠全血標(biāo)本，放入含有15 g/L乙二胺四乙酸的采血管內(nèi)，血液標(biāo)本在采集后的30 min內(nèi)于4℃、3000×g離心10 min，取上清，并置于?80℃冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清胃泌素、雌二醇等激素的含量以及NADPH 氧化酶‐4（NADPH oxidase，Nox‐4）、白介 素 ‐1β （Interleukin‐1β， IL‐1β）、 白 介 素 ‐6（Interleukin‐6，IL‐6）以及腫瘤壞死因子‐α（Tumor necrosis factor‐α，TNF‐α）等的含量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及測(cè)量指標(biāo)濃度的計(jì)算嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

六、實(shí)時(shí)定量RT‐PCR

采用實(shí)時(shí)定量RT‐PCR方法檢測(cè)Nox‐4、IL‐1β、IL‐8及TNF‐α等指標(biāo)的mRNA的相對(duì)表達(dá)。取兩組每只小鼠食管組織40 mg，采用TRIzol試劑提取總RNA，采用天根公司Fast Quant RT試劑盒合成第一鏈cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成引物，各指標(biāo)及β‐肌動(dòng)蛋白（actin）引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。實(shí)時(shí)定量RT‐PCR，反應(yīng)體系為 20 μl，按照 94 ℃ 3 min，95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，共40循環(huán)設(shè)置反應(yīng)條件。反應(yīng)結(jié)束后由電腦自動(dòng)得出熒光曲線及Ct值，采用2—△△Ct計(jì)算出目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

表1 實(shí)時(shí)定量RT‐PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS22.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、心理應(yīng)激對(duì)激素水平的影響

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，14d的束縛應(yīng)激后，小鼠血液中胃泌素（圖1A）和雌二醇（圖1B）激素水平顯著降低，較對(duì)照組比較，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.265，5.622；P＜0.05）。

圖1 兩組小鼠血清激素水平比較（每組n=10，aP＜0.05 vs正常組）

二、心理應(yīng)激對(duì)食管組織的影響

心理應(yīng)激組小食管粘膜層可見基底細(xì)胞增生，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)和炎癥性改變，提示食管上皮受到外界因素?fù)p傷后的表現(xiàn)及增生修復(fù)反應(yīng)（圖2A）。心理應(yīng)激組小鼠食管粘膜炎癥細(xì)胞評(píng)分明顯高于對(duì)照組（圖2B），兩組比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.512，P＜0.05）。

圖2 兩組食管粘膜組織H&E染色

三、心理應(yīng)激引起氧化應(yīng)激水平上升

RT‐PCR和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心理應(yīng)激組小鼠食管粘膜組織NADPH氧化酶‐4（NADPH oxidase，Nox‐4）的mRNA相對(duì)表達(dá)（圖3A）及其血液中（圖3B）的表達(dá)水平顯著上升，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.546，6.013；P＜0.05）。

圖3 兩組食管組織Nox‐4的表達(dá)水平比較（n=10，aP＜0.05 vs正常組）

四、慢性束縛應(yīng)激引起炎癥因子表達(dá)上升

心理應(yīng)激組食管粘膜組織IL‐1β、IL‐6及TNF‐α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組（圖4），兩組比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.124，5.876，6.832；P＜0.05）。酶聯(lián)免疫吸附結(jié)果顯示，血液中心理應(yīng)激組炎癥因子IL‐1β、IL‐6、TNF‐α的釋放水平明顯上升（圖5），與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.317，4.681，8.105；P＜0.05）。

圖4 兩組食管組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平的比較（n=10，aP＜0.05 vs正常組）

圖5 兩組血清炎癥因子水平比較（n=10，aP＜0.05 vs正常組）

討 論

CERD的病理生理機(jī)制有多種因素參與，包括遺傳、環(huán)境、解剖、激素、神經(jīng)因素等，但其詳細(xì)機(jī)制目前尚不清楚。胃食管反流是一種生理現(xiàn)象，只有出現(xiàn)反流癥狀或并發(fā)癥時(shí)才稱作反流性疾?。?］。胃酸是食管黏膜的主要損傷因素。食管黏膜與酸接觸后，局部血流和組織內(nèi)胃泌素分泌異常，從而黏膜對(duì)酸的易感性增強(qiáng)。反復(fù)的酸刺激使黏膜發(fā)生炎癥，最終導(dǎo)致食管炎。食管內(nèi)酸化會(huì)影響吞咽頻率、食管黏膜完整性和食管原發(fā)性蠕動(dòng)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，胃泌素與GERD的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，胃泌素分泌不足可以導(dǎo)致下食管括約肌（Lower esophageal sphincter，LES）功能不全，進(jìn)而增加GERD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此，若血清胃泌素水平較低，可以初步提示GERD，特別是內(nèi)鏡陽(yáng)性的反流性食管炎［9］。但由于各研究納入的病例組不同，特別是NERD是否納入，血清對(duì)GERD診斷界限值和診斷效能參差不齊。

從食管的解剖學(xué)來(lái)看食管下段完全由平滑肌構(gòu)成，GERD患者的食管動(dòng)力學(xué)改變特點(diǎn)與食管平滑肌的分布特點(diǎn)和平滑肌的收縮功能密切相關(guān)［10］。胃泌素是一種重要的胃腸激素，它主要由G細(xì)胞分泌，具有刺激胃酸分泌、促進(jìn)胃腸道細(xì)胞增殖和分化等生理功能。體內(nèi)胃泌素分泌水平主要受G細(xì)胞數(shù)量、胃內(nèi)pH值、刺激迷走神經(jīng)、胃竇牽拉、服用抑酸藥和促胃泌素激素藥物等諸多因素影響。胃泌素可以維持食管下括約肌壓力，防止胃食管反流。研究結(jié)果表明，胃泌素通過(guò)結(jié)合LES平滑肌上的CCK‐2受體，促進(jìn)LES的收縮，促進(jìn)食管平滑肌推進(jìn)性蠕動(dòng)，從而防止酸反流［11］。胃泌素不全或水平降低是引起LES功能不全的重要因素。Suzuki等［12］發(fā)現(xiàn)，GERD患者血液中胃泌素水平及LES收縮能力顯著低于健康對(duì)照組。血清胃泌素低值是胃食管反流病的預(yù)測(cè)指標(biāo)其原理可以概括為兩點(diǎn)。其一，低胃泌素血癥是GERD發(fā)生機(jī)制之一。其二，GERD是一種酸相關(guān)性疾病，多數(shù)患者處于高胃酸狀態(tài)，基礎(chǔ)胃酸分泌量較高；由于胃酸的反饋性抑制作用，胃竇G細(xì)胞分泌胃泌素減少，血清胃泌素相應(yīng)降低。既然GERD是一種酸相關(guān)性、動(dòng)力障礙性疾病，因此胃泌素與其發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，為臨床診斷提供一種可能。因此，胃泌素分泌異常可能是GERD發(fā)生的機(jī)制之一。此外，絕經(jīng)后老年婦女因卵巢萎縮，血清雌二醇含量減低，導(dǎo)致食管胃粘膜屏障功能削弱，粘液分泌減少，微循環(huán)障礙，對(duì)胃酸反流、膽汁酸和外源性刺激敏感性增強(qiáng)，進(jìn)而引起GERD的發(fā)生［13］。對(duì)老年女性GERD防治，除使用促動(dòng)力劑、抑酸劑外加用雌激素補(bǔ)充療法可望改善癥狀，提高療效。Naik等［14］的研究結(jié)果表明，雌、孕激素對(duì)LES壓力具有松弛效應(yīng)，在妊娠期女性中可引起LES功能降低，而出現(xiàn)GERD相關(guān)癥狀的加重。

過(guò)量產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在GERD發(fā)生與發(fā)展中的作用逐漸受到重視。氧化應(yīng)激‐炎癥‐衰老，三者的形成機(jī)制互為因果關(guān)系；當(dāng)機(jī)體氧化、抗氧化能力出現(xiàn)紊亂時(shí)，可使炎癥反應(yīng)和促炎癥因子的大量釋放，最終導(dǎo)致機(jī)體持續(xù)處在過(guò)度炎癥狀態(tài)［15］。炎性細(xì)胞因子在GERD發(fā)生中的作用逐漸成為學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)。氧化應(yīng)激是由活性氧過(guò)量生成或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損導(dǎo)致氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過(guò)量聚集，從而對(duì)機(jī)體造成損害的病理狀態(tài)［16］。既往研究顯示，心理應(yīng)激反應(yīng)是誘導(dǎo)活性氧過(guò)量產(chǎn)生的的重要機(jī)制，在GERD的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用［17‐19］。近年來(lái)，焦慮、抑郁等精神心理異常因素常發(fā)現(xiàn)與下丘腦‐垂體‐卵巢軸的神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)，性激素（雌二醇、促黃體生成素）分泌異常、排卵功能障礙等有關(guān)［20‐21］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，心理應(yīng)激小鼠血液中胃泌素、雌二醇等激素水平更低；食管粘膜組織炎癥評(píng)分更高；氧化應(yīng)激和炎癥因子水平增高，這結(jié)果提示心理應(yīng)激誘導(dǎo)激素水平的異常分泌，促進(jìn)食管氧化應(yīng)激和炎癥損傷。

綜上所述，胃泌素以及雌二醇與GERD的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。心理應(yīng)激增加罹患GERD的風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)導(dǎo)致GERD癥狀的加重。本研究結(jié)果顯示，心理應(yīng)激誘導(dǎo)雌性小鼠胃泌素和雌二醇水平降低，促進(jìn)食管氧化應(yīng)激產(chǎn)生及其炎癥發(fā)生，可能是心理壓力相關(guān)GERD的發(fā)病機(jī)制之一，但其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。