劉艷光， 張珈溯， 羅新惠， 柳檢強(qiáng)，金海國(guó)， 夏廣軍， 曹 陽(yáng)， 張立春,*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，吉林 公主嶺 136100)

防御素是由機(jī)體分泌的具有強(qiáng)烈抗菌作用和抵抗外援微生物入侵的多肽，是機(jī)體免疫作用的重要屏障之一[1-3]。哺乳動(dòng)物的防御素根據(jù)二硫鍵所在位置的不同分為α防御素、β防御素和θ防御素[4-5]，β-防御素(β-defensin)具有6個(gè)半胱氨酸殘基形成β-防御素基序，這也是β-防御素的主要特征[6]。研究表明，β-防御素主要存在于牛、綿羊、豬和人類[7]，對(duì)包括革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌和酵母菌在內(nèi)的多種微生物普遍具有抑制活性[8-9]。豬β-防御素(PBD)是豬自身分泌的一種能夠殺菌、調(diào)節(jié)免疫功能的小分子抗菌肽，是豬生長(zhǎng)繁殖不可缺少的蛋白質(zhì)[10]，有望成為飼料抗生素添加劑的理想替代品[11-12]。目前豬β-防御素功能研究報(bào)道較多，但對(duì)不同豬種抗病能力表型性狀構(gòu)成中的作用鮮有報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)長(zhǎng)白與野豬雜交豬，民豬及大白豬群體免疫相關(guān)指標(biāo)比較分析中證實(shí)，野雜豬與民豬具有更高的抗病能力[13-14]，并進(jìn)一步證實(shí)天然免疫相關(guān)基因具有更加豐富的基因遺傳多樣性[15-16]。鑒于β-防御素在天然免疫系統(tǒng)的重要作用以及不同遺傳背景豬中分泌量的差異還很少有人報(bào)道。該試驗(yàn)以野雜豬、民豬和大白豬為研究對(duì)象，利用RT-PCR技術(shù)和分子克隆技術(shù)獲得PBD-119基因的CDS區(qū)；利用qRT-PCR檢測(cè)該基因在不同品種豬相同組織中的表達(dá)量，為進(jìn)一步闡明PBD-119基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)；為后續(xù)研究該基因在不同品種豬體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

野豬與當(dāng)?shù)孛褙i的雜交豬(含75%長(zhǎng)白山野豬血統(tǒng)，簡(jiǎn)稱野雜豬)30頭，民豬25頭，純種大白豬健康后備母豬29頭，分別來(lái)自吉林省白山市隆興牧業(yè)有限公司興隆豬場(chǎng)、吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院民豬保種場(chǎng)和四平紅嘴集團(tuán)梨樹種豬場(chǎng)，均為5～6月齡。屠宰后取肝臟和脾臟，用滅菌剪刀剪成小塊，放入凍存管并做好標(biāo)記，于液氮保存；血液用抗凝血管收集，試劑盒提取DNA，于冰箱-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑

Trizol(Invitrogen公司)；cDNA合成試劑盒、感受態(tài)DH5α大腸桿菌(TaKaRa公司)；梯度PCR儀(北京博輝生物科技有限公司)；2×ES Taq Master Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；凝膠回收試劑盒(Omega公司)；Light Cycler 480 SYBR Green I Master和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

目前GenBank中僅公布有PBD-119基因mRNA預(yù)測(cè)序列信息(XM_005654239.3)，為獲取該基因真實(shí)mRNA序列，該試驗(yàn)以預(yù)測(cè)序列信息為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物，序列測(cè)定完成后，重新設(shè)計(jì)定量PCR引物，以豬HPRT1基因[17]為內(nèi)參基因，引物信息見表1，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 總RNA提取及cDNA合成

按照說(shuō)明書利用Trizol法提取民豬、大白豬和野雜豬肝臟、脾臟總RNA后，采用Quawell-Q5000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度，參照Roche Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit使用說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成，合成后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析

以3個(gè)品種豬的肝臟、脾臟及血液cDNA為模板，擴(kuò)增PBD-119基因CDS區(qū)。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×ES Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，從第2部開始共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用凝膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收，目的基因進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，并將陽(yáng)性克隆菌液送金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用Seqman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析；同時(shí)應(yīng)用Expasy在線軟件對(duì)PBD-119基因蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、磷酸化、信號(hào)肽以及跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并對(duì)其二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；運(yùn)用MEGA7.0將克隆序列與其他10個(gè)物種的PBD-119基因的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.7 差異表達(dá)與統(tǒng)計(jì)分析

采用qRT-PCR檢測(cè)PBD-119基因在大白豬、民豬和野雜豬的肝臟、脾臟和血液中的表達(dá)情況并分別以組織和品種為對(duì)象，比較相同組織不同品種和相同品種不同組織間的差異表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)中，cDNA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×SYBR Premix DimerEraser 10 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸35 s，從第2步開始共45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，溫度以5 ℃/s 的速率從60 ℃遞增到97 ℃，最后降到40 ℃保存。每個(gè)品種檢驗(yàn)3個(gè)隔離，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2-△△Ct方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并采用Graph Pad 6.0 Software進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PBD-119基因CDS區(qū)擴(kuò)增克隆及SNP篩選結(jié)果

以野雜豬、民豬和大白豬肝臟、脾臟及血液的cDNA為模板，RT-PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增出特異性條帶(圖1)。

圖1 不同群體豬PBD-119基因 RT-PCR 擴(kuò)增電泳圖

由圖1可知，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)片段小于500 bp，與預(yù)期結(jié)果大小一致。進(jìn)一步通過(guò)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及菌落PCR鑒定及陽(yáng)性菌落測(cè)序。測(cè)序發(fā)現(xiàn)該目的條帶全長(zhǎng)408 bp，Blast N比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該片段與豬PBD-119基因預(yù)測(cè)mRNA序列完全一致(XM_005654239.3)，其中，包含完整CDS序列252 bp，共編碼83個(gè)氨基酸(圖2)，Cys殘基組成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，其連接方式為 Cys1-Cys5，Cys2-Cys4和Cys3-Cys6，表明該基因高度保守；同時(shí)通過(guò)PBD-119基因測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析得出在第263位堿基上存在多肽位點(diǎn)的改變(C266T)，并在第53位氨基酸上引起氨基酸的改變，由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸(P-S)，但其并不影響二硫鍵結(jié)構(gòu)。

圖2 PBD-119基因的全長(zhǎng)cDNA序列及其氨基酸序列

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1PBD-119基因蛋白理化性質(zhì)及蛋白磷酸化分析

利用Protparam軟件分析PBD-119基因蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果顯示PBD-119基因編碼83個(gè)氨基酸(表2)。

由表2中可知亮氨酸(Leu)和絲氨酸(Ser)含量最高(9.6%)，不含蘇氨酸、吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸；該蛋白分子式為C424H670N122O115S9，分子量為9.6 ku，理論等電點(diǎn)(PI)為9.38，其在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，水溶液在280 nm處的消光系數(shù)為15 845，穩(wěn)定系數(shù)為59.43，脂肪系數(shù)為76.39，推測(cè)該蛋白為不穩(wěn)定的堿性脂溶性蛋白；利用NetPhos 3.1 對(duì)PBD-119蛋白進(jìn)行磷酸化分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，該蛋白存在8個(gè)磷酸化位點(diǎn)(分值>0.5)，分別為絲氨酸(Serine)6個(gè)，酪氨酸(Tyrosine)2個(gè)。

表2 PBD-119基因蛋白氨基酸組成

圖3 PBD-119基因蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

2.2.2PBD-119蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用TMHMM在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)；利用在線軟件SignalP對(duì)蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4)，結(jié)果顯示C處最高值出現(xiàn)在第21位氨基酸上，為0.897；Y-max為0.910，也出現(xiàn)在第21位氨基酸上，S-max為0.960，出現(xiàn)在第1位氨基酸上，其值均高于閾值0.5，說(shuō)明該序列存在信號(hào)肽，是分泌型蛋白。

圖4 PBD-119基因蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.2.3PBD-119蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用Protean 軟件預(yù)測(cè)PBD-119蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，由圖5可知，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含α螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，其分別各占20.5%、10.8%和68.7%。利用 SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)PBD-119蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，得到PBD-119蛋白三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)圖(圖6)，并證實(shí)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)存在高度一致性。

1表示α螺旋(HELIX：20.5%)；2表示β折疊(STRAND：10.8%)；其余部分表示無(wú)規(guī)卷曲(COIL：68.7%)

圖6 PBD-119基因蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.4PBD-119基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用Mega7.0將克隆序列與人(NM_001271209.2)、馬(XM_003363904.4)、牛(NM_001101661.3)、綿羊(XM_027976441.1)、山羊(XM_005688343.3)、小須鯨(XM_007193330.2)、美洲獅(XM_027623094.1)、倭黑猩猩(XM_003833410.3)、雙峰駝(XM_006192533.2)和羊駝(XM_006202685.2)10個(gè)物種β-防御素-119基因核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建(圖7)。由圖7可知，豬與人、倭黑猩猩、馬同源性較高，親緣性較近，但與雙峰駝和羊駝的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，進(jìn)化樹所呈現(xiàn)的趨勢(shì)符合物種進(jìn)化程度。

圖7 不同物種PBD-119基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 PBD-119基因的組織表達(dá)譜的構(gòu)建

由圖8可知,PBD-119基因在3個(gè)品種豬肝臟中的表達(dá)量野雜豬>民豬>大白豬，且大白豬分別與民豬和野雜豬的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，民豬與野雜豬的表達(dá)量差異則不明顯，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PBD-119基因在3種豬脾臟中的表達(dá)模式則與肝臟不同，主要差別表現(xiàn)為大白豬表達(dá)量最高，民豬和野雜豬表達(dá)量依次減少，且野雜豬表達(dá)量與大白豬和民豬表達(dá)量差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但大白豬和民豬差異表達(dá)較?。辉谘褐械谋磉_(dá)模式則與肝臟相似，表現(xiàn)為民豬中PBD-119基因量最高，大白豬最低，野雜豬居中，其中，大白豬分別與野雜豬和民豬差異表達(dá)具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但大白豬和野雜豬間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以相同品種為目標(biāo)，檢測(cè)不同組織間PBD-119基因差異表達(dá)(圖9)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大白豬與民豬、野雜豬在肝臟、脾臟和外周血中PBD-119基因表達(dá)不同，表現(xiàn)為脾臟中最高，肝臟居中，血液中最低，僅脾臟與血液差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，民豬和野雜豬3個(gè)組織中PBD-119基因表達(dá)模式相似，均表現(xiàn)為肝臟和血液表達(dá)較高、脾臟最低的表達(dá)模式。

注：P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

注：P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論與結(jié)論

豬防御素是內(nèi)源性抗菌肽的重要組成部分，具有分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、抑菌譜廣且不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，是抗生素的理想替代品[9,18]。最新研究發(fā)現(xiàn)，豬防御素不僅能夠抵抗病原菌的入侵，還與生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收、腸道微生物和免疫調(diào)控有密切關(guān)系[19-21]，同時(shí)，通過(guò)在妊娠母豬飼糧中添加一些乳鐵蛋白(LF)能夠促進(jìn)PBD基因在各組織中的表達(dá)，進(jìn)而提高斷奶仔豬的抗病力[22-23]。由于防御素在體內(nèi)分泌量非常少，所以現(xiàn)大都采用化學(xué)合成或者基因工程的方法來(lái)獲取進(jìn)行研究。然而，對(duì)于PBD-119在同一物種不同品種動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)量的研究卻很少有報(bào)道。

該試驗(yàn)成功克隆獲得了大白豬、民豬、野雜豬PBD-119基因CDS區(qū)全長(zhǎng)252 bp，編碼83個(gè)氨基酸，該蛋白分子式為C424H670N122O115S9，分子量為9.6 ku，理論等電點(diǎn)(PI)為9.38，其在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，水溶液在280 nm處的消光系數(shù)為15 845，穩(wěn)定系數(shù)為59.43，脂肪系數(shù)為76.39，推測(cè)該蛋白為不穩(wěn)定的堿性脂溶性蛋白；不存在跨膜結(jié)構(gòu)，但存在磷酸化位點(diǎn)與信號(hào)肽，是分泌型蛋白；在二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)比例較小，說(shuō)明蛋白不穩(wěn)定，這與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致；通過(guò)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，豬PBD-119基因與其他物種均能聚為一類，并且這11個(gè)物種PBD-119基因的遺傳多樣性較低，表明PBD-119基因在進(jìn)化過(guò)程中是較為保守的且這些物種可能是由共同的祖先進(jìn)化而來(lái)的[24]，PBD-119蛋白組成與二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析也證實(shí)β-防御素-119結(jié)構(gòu)與功能的保守性，也由此推斷PBD-119基因在不同物種中發(fā)揮的調(diào)控機(jī)制比較相似。有研究報(bào)道將PBD基因?qū)氪竽c桿菌中表達(dá)，誘導(dǎo)純化的防御素在低濃度時(shí)即可對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用[25]。運(yùn)用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，豬PBD-119蛋白存在8個(gè)磷酸化位點(diǎn)，有研究指出蛋白質(zhì)磷酸化與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)周期、生長(zhǎng)發(fā)育及部分癌癥發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，同時(shí)，蛋白質(zhì)磷酸化在翻譯過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，是一種重要的共價(jià)修飾方式[26-27]。因此，豬PBD-119蛋白可能在調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞周期過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。

此外，在以往試驗(yàn)中，大都研究該基因在體內(nèi)不同組織中的分布情況，對(duì)于不同品種動(dòng)物相同組織中的表達(dá)情況鮮有報(bào)道。有研究表明血液是生命維持的最大保障，在生命的任何一個(gè)階段都作為免疫屏障并且會(huì)隨著身體狀態(tài)發(fā)生變化[28]，肝臟做為機(jī)體最大的免疫器官，在動(dòng)物體生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如解毒、代謝、免疫等[29-30]，脾臟作為機(jī)體免疫器官中的重要組成部分，是集體最大的淋巴器官[31]。因此，該試驗(yàn)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)PBD-119基因在野雜豬、民豬和大白豬血液、肝臟和脾臟中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBD-119基因在3個(gè)品種豬的各組織中均有表達(dá)，但其表達(dá)量存在差異，表明PBD-119基因具有廣泛的組織表達(dá)特征，該特征進(jìn)一步表明它可能有助于粘膜和全身宿主免疫防御[32]。該試驗(yàn)中，PBD-119基因在3個(gè)品種豬的相同組織和同一品種不同組織中表現(xiàn)為民豬和野雜豬的肝臟和血液中表達(dá)量均較高，大白豬的肝臟和血液中表達(dá)相對(duì)較少，而脾臟表現(xiàn)則相反，說(shuō)明該基因可能對(duì)豬的免疫和消化功能有一定的促進(jìn)作用，這與野雜豬與民豬抗病能力較強(qiáng)的特性相符合。有研究發(fā)現(xiàn)β-防御素基因在不與微生物環(huán)境直接接觸的那些組織中表達(dá)，例如腦、肝、腎、心臟、肌肉和生殖器官，可能有助于抵抗機(jī)會(huì)性感染；或者，這些小肽可能在這些組織中具有超出其抗菌活性的其他功能，但確定這些β-防御素在非上皮組織中的細(xì)胞來(lái)源和功能意義還需要進(jìn)一步的研究[33]，這與該試驗(yàn)得出的結(jié)論基本一致。因此，對(duì)于PBD-119基因在各品種豬的肝臟、脾臟和血液等組織中的表達(dá)及作用還有很大潛力，有待進(jìn)一步研究。